一种磷酸铝佐剂及其制备方法[发明专利]

*CN102188701A*

(10)申请公布号 CN 102188701 A(43)申请公布日 2011.09.21

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010123850.2(22)申请日 2010.03.12

(71)申请人上海泽润生物科技有限公司

地址201203 上海市浦东新区张江张衡路

1399号(72)发明人张高峡 沈琼 王兰创 美娟

郭慧丽(74)专利代理机构上海天翔知识产权代理有限

公司 31224

代理人王裕(51)Int.Cl.

A61K 39/39(2006.01)A61K 39/12(2006.01)A61P 31/20(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 2 页

()发明名称

一种磷酸铝佐剂及其制备方法(57)摘要

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种磷酸铝佐剂及其制备方法。本发明公开了一种磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-4500nm；多分散性系数0.01-1.00；等电点4.0-6.0。本发明所述磷酸铝佐剂稳定性高、均一性好和包载能力强，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用，其效果优于现有商品化佐剂。本发明所述方法工艺简单，能得到性质稳定、分散均一、批间差小的磷酸铝佐剂，解决磷酸铝佐剂批间差异大的问题。CN 102188701 ACN 102188701 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200-4500nm；多分散性系数0.01-1.00；等电点4.0-6.0。

2.如权利要求1所述的磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200-800nm；多分散性系数0.10-0.50；等电点4.2-5.8。

3.如权利要求1所述的磷酸铝佐剂，其特征在于其粒径200～300nm；多分散性系数0.15～0.35；等电点4.5～5.5。

4.权利要求1所述磷酸铝佐剂的制备方法，包括下列步骤：

a)采用蠕动泵将0.06mol/L氯化铝与0.06mol/L磷酸二氢钠的混合溶液和0.5mol/L强碱溶液分别以相应的流速泵入反应器中，搅拌，其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液和强碱溶液的流速比为5∶2～15∶2；

b)收集混悬液，静置，弃去上清夜，离心，得沉淀；c)洗涤沉淀、溶解即得磷酸铝佐剂溶液。5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述强碱溶液为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10～30ml/min。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速20ml/min。

8.一种疫苗组合物，其特征在于其包含不超过1.25mg/剂量的权利要求1所述磷酸铝佐剂。

9.如权利要求8所述疫苗组合物，其特征在于所述疫苗为带正电荷的蛋白疫苗。10.如权利要求9所述疫苗组合物，其特征在于所述带正电荷的蛋白疫苗为HPV疫苗。

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说 明 书

一种磷酸铝佐剂及其制备方法

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技术领域

[0001]

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种磷酸铝佐剂及其制备方法。

背景技术

近年来，随着免疫学研究的不断深入及基因工程技术的迅速发展，活载体疫苗、

DNA疫苗和蛋白质疫苗等新型疫苗的研究取得了可喜的进步。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但免疫原性弱，诱导机体产生的免疫应答不够强，因此，应用佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答就显得尤为重要。[0003] 随着分子生物学的快速发展，多肽疫苗及亚单位疫苗不断涌现，无论在数量上还是质量上对疫苗佐剂的要求都愈来愈高。人们在寻找新型佐剂的同时，对常规佐剂的改良研究也更加重视起来。虽已涌现不少新型佐剂，但大多尚处于实验研究阶段。所以目前在疫苗产业中铝佐剂是最传统最重要也是应用最多的疫苗佐剂。[0004] 铝佐剂的作用机理主要是在组织中形成抗原贮藏库，产生颗粒性抗原来促进抗原提呈给免疫细胞，使抗原滞留，缓慢释放，从而吸引活性淋巴细胞，激活补体系统。[0005] 铝盐佐剂成本低、使用方便，是生物制品生产中应用最广的一种佐剂，也是最早被美国食品药物监督管理局(FDA)批准用于人类疫苗的佐剂。自1926年Glenny首先应用铝盐黏附白喉类毒素至今已广泛应用于人兽疫苗。铝佐剂通常在人用疫苗中含量为0.5mg/剂量，WHO推荐最高不超过1.25mg/剂量。

[0006] 铝佐剂包括氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。天然的氢氧化铝有上百种存在形式，例如Al(OH)3、Al2O3·H2O、AlOOH等.而商品化的氢氧化铝佐剂，实际上是Al(OH)3的不完全脱水产物，即纤维状结晶形态的偏氢氧化铝AlO(OH)，氢氧化铝佐剂(分子式为AlO(OH))的等电点为11.4，在生理条件(人体内)时带正电荷，可较好地吸附带负电荷的蛋白疫苗，如流感疫苗，乙肝疫苗等。而磷酸铝佐剂的等电点依赖于磷酸根和羟基的比例，完全没有磷酸根时(分子式Al(OH)3)等电点为9.6，完全没有羟基时(分子式AlPO4)等电点为4.0，商业化的磷酸铝佐剂的等电点一般为5.0，在生理条件时带负电荷，可较好地吸附带正电荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗等。

[0007] 中国专利CN2006800090340、CN2006800475728、CN2006800476098公开了磷酸铝佐剂具有下列技术特征：粒径0.5-20um；P/Al 0.3-1.2(优选0.8-1.2)；等电点(PZC)4.0-7.0(优选5.0-6.5，最优5.7)；以沉淀法生产。

[0008] 中国专利CN028149335公开了磷酸铝佐剂具有下列技术特征：其为Al(OH)x(PO4)其中各阴离子化合价和乘以其摩尔分数是-3，P/Al 0.3-0.99；以沉淀法生产。y，

[0009] 但现有的磷酸铝佐剂在均一性和包载能力方面缺陷，影响了此佐剂诱导产生的体液应答水平。

[0002]

发明内容

[0010]

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性高、均一性好和包载能力强的磷酸

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说 明 书

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铝佐剂及其制备方法，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用。[0011] 为此，本发明公开了一种磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-4500nm；多分散性系数0.01-1.0；等电点4.0-6.0。[0012] 在一实施例中，所述磷酸铝佐剂，其特征在于粒径200-800nm；多分散性系数(PDI)0.10-0.50；等电点(PZC)4.2-5.8；其中最优选粒径200～300nm；多分散性系数(PDI)0.15～0.35；等电点(PZC)4.5～5.5。[0013] 在一实施例中，所述磷酸铝佐剂中铝离子浓度为5620ug/ml，磷离子的浓度为5174ug/ml，P/Al比为0.92。[0014] 另一方面，本发明还公开了所述磷酸铝佐剂的制备工艺，包括下列步骤：

[0015] a)采用蠕动泵将0.06mol/L氯化铝与0.06mol/L磷酸二氢钠的混合溶液和0.5mol/L强碱溶液分别以相应的流速泵入反应器中，搅拌，其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液和强碱溶液的流速比为5∶2～15∶2；[0016] b)收集混悬液，静置，弃去上清夜，离心，得沉淀；[0017] c)洗涤沉淀、溶解即得磷酸铝佐剂溶液。[0018] 所述强碱可为氢氧化钠或氢氧化钾；在一些实施方式中，所述氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10～30ml/min，优选其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速20ml/min[0019] 在另一方面，本发明还公开了一种疫苗组合物，其特征在于其包含不超过1.25mg/剂量的本发明所述磷酸铝佐剂；所述疫苗为带正电荷的蛋白疫苗，如HPV疫苗。[0020] 本发明所述磷酸铝佐剂稳定性高、均一性好和包载能力强，以应用此佐剂可诱导产生较强的体液应答水平，同时有利于在疫苗的生产过程中，可减少佐剂和疫苗的添加量，降低疫苗的毒副作用，其效果优于现有商品化佐剂。本发明所述方法工艺简单，能得到性质稳定、分散均一、批间差小的磷酸铝佐剂，解决磷酸铝佐剂批间差异大的问题。附图说明

[0021] 图1、磷酸铝佐剂透射电镜图；[0022] 图2、蛋白包封率检测。

具体实施方式

[0023] 以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。[0024] 实施例1磷酸铝佐剂的制备方法[0025] 1、溶液配制

[0026] 1.1氯化铝溶液(0.06mol/L)和磷酸二氢钠溶液(0.06mol/L)的配制[0027] 称量28.9716g的AlCl3.6H2O和18.7212g的NaH2PO4.2H2O，纯水溶解并定容至2L，

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说 明 书

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即得浓度为0.06mol/L的氯化铝和磷酸二氢钠溶液。[0028] 1.2氢氧化钠溶液(0.5mol/L)的配制[0029] 称量40g的NaOH，纯水溶解并定容至2L，即得浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液。[0030] 1.3除菌除热源：采用超滤仪(截留分子量8KD或10KD)进行超滤。用0.22μm囊式滤器过滤除菌。

2、磷酸铝佐剂的制备工艺

[0032] 分别采用蠕动泵将氯化铝与磷酸二氢钠的混合溶液和氢氧化钠溶液以一定的流速泵入容积为600mL的玻璃反应器中，反应器至于磁力搅拌器上，以恒定的速度搅拌。其中氯化铝与磷酸二氢钠溶液的流速为75ml/min，氢氧化钠溶液的流速控制在10～30ml/min。[0033] 弃去初始的750ml混悬液，收集后续混悬液，静置5小时后，弃去上清夜，8000rpm离心15min，得沉淀，用蒸馏水洗涤3次。将沉淀分散于一定体积纯水中，即得某浓度范围的磷酸铝佐剂溶液。将不同流速的制备的磷酸铝分别标记为75/15、75/15.5、75/15、75/16、75/16.5、75/17、75/17.5、75/18、75/18.5、75/19、75/19.5、75/20、75/25、75/30。[0034] 将制备的各组磷酸铝悬浮液进行121℃、30min湿热灭菌。然后4℃条件下保存。[0035] 3、铝佐剂的检测

[0036] 分别测定各组磷酸铝佐剂的等电点、粒径、HPV18L1蛋白包封率、透射电镜下形态

[0031]

等指标，以购自Accuratechemical公司的磷酸铝佐剂(

[0037]

)作为对照。

形态：将样品稀释后，滴加入磷钨酸染色(也可不染色)，室温挥干，于透射电镜测定样品的粒子形态。磷酸铝佐剂透射电镜照片见图1；[0038] 粒径：将样品适当稀释后，采用Marven公司的粒度与表面电位分析仪测定样品的粒子直径和多分散性系数(PDI)，实验结果分别见表1。

[0039] 表1.从氯化铝出发制备的铝佐剂在水溶液中的粒子直径

[0040]

Sample 75/15 75/15.5 75/16 75/16.5 75/17 75/17.5 75/18 75/18.5

pH 3.03-3.10 3.14-3.29 3.35-3.6 4.4-4.8 5.1-5.3 5.7-5.9 6.2-6.3 6.6-6.7

Size(water) 4086.5 3265.2 2484.5 5321.5 22.5 484.9 336.7 318.2

PDI 0.432 0.592 0.434 1.000 0.818 0.234 0.257 0.242

quality good good good poor poor good good good

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75/19 75/19.5 75/20 75/25 75/30 Adju-phos

[0041]

6.9-7.1 7.3-7.5 7.5-7.8 7.8-8.2 8.3-8.7 none

说 明 书

406.6 228.5 238.1 232.6 241.6 1091.5

0.271 0.185 0.196 0.201 0.182 0.219

good good good good good good

4/10页

蛋白包封率检测：将铝佐剂与HPV疫苗HPV18LI疫苗(可来自中国专利

200710170935.4、200710170936.9和200810032655.1所述方法制备)体积比1∶1混合，搅拌2小时后，8000rpm离心15min，测定上清中疫苗的含量，计算出铝佐剂对疫苗的包载能力，根据包载能力的大小，调整处方。HPV18L1与铝佐剂的比例分别为0.5∶1，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1，6∶1，8∶1。附图2为铝佐剂对HPV18L1的包封率曲线，从图中可以看出，随着蛋白质与铝佐剂比例的升高，包封率逐渐降低，在小于4∶1时，包封率接近100％；与商品铝佐剂相比，自制的铝佐剂对HPV18L1的包封率得到了显著的提高。

[0042]

等电点(PZC)：将样品稀释后，采用Marven公司的粒度与表面电位分析仪测定佐剂的表面电位，绘制曲线得出样品的PZC值。见表2

[0044] 表2.各比例下制备磷酸铝佐剂的等电点(PZC)

[0043]

[0045]

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说 明 书

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[0046]

铝佐剂中各个元素含量的测定：采用电感耦合等离子体发射光谱仪

(inductivelycoupled plasma(ICP)spectroscopy)测定铝佐剂中铝，磷，等离子的浓度，得到铝佐剂的P/Al比，结果见表3。

[0048] 表3.磷酸铝佐剂各元素分析结果

[0047] [0049]

sample 75/20

[0050]

Al ug/ml P ug/ml 5620

5174

S ug/ml \\

P/Al 0.92

实验结果表明，随着氢氧化钠溶液比例的加大，制备的磷酸铝佐剂的粒径逐渐减

小，在75/20附近时基本维持在230nm左右，明显小于对照品佐剂。另外从对HPV18L1蛋白包封率结果来看，75/20的磷酸铝佐剂对HPV18L1的包封率明显高于75/15且明显高于对照磷酸铝佐剂Adju-phos。透射电镜下观察磷酸铝佐剂状态，可见75/20磷酸铝佐剂的粒径小且分散均匀。

[0051] 实施例2HPV18L1疫苗制剂的制备[0052] 1、铝佐剂的稀释

[0053] 制备的磷酸铝佐剂在使用前采用特制的佐剂稀释液进行稀释，得到一定处方组成的磷酸铝佐剂溶液。

7

CN 102188701 A[00] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [00] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069]

说 明 书

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1.1、铝佐剂稀释液的组成

组分 浓度

氯化钠 0.308mo/LL-组氨酸 0.02mol/L吐温80(20％w/v) 0.02％1.2、稀释后铝佐剂的处方组成

组分 浓度

铝 900μg/mL氯化钠 0.1mol/LL-组氨酸 0.01mol/L吐温80(20％w/v) 0.01％2、HPV18L1蛋白液稀释2.1、蛋白稀释液组成

组分 浓度

氯化钠 0.486mo/L

L-组氨酸 0.01mol/L

[0070] 吐温80(20％w/v) 0.01％[0071] 2.2、稀释后蛋白液组成

[0072] HPV18L1 80μg/mL[0073] 氯化钠 0.486mol/L[0074] L-组氨酸 0.01mol/L[0075] 吐温80(20％w/v) 0.01％[0076] 3、HPV18L1蛋白液与磷酸铝佐剂液的吸附[0077] 3.1、分别取相同体积的4.1.2和4.2.2项下两种溶液，将蛋白液加入铝佐剂溶液中，混合均匀，即得含磷酸铝佐剂的HPV18L1疫苗制剂。[0078] 3.2、含磷酸铝佐剂HPV18L1疫苗处方组成[0079] 组分 浓度

[0080] 铝 450μg/mL[0081] HPV18L1 80μg/mL[0082] 氯化钠 0.32mol/L[0083] L-组氨酸 0.01mol/L[0084] 吐温80(20％w/v) 0.01％[0085] 实施例3、磷酸铝佐剂对HPV18L1疫苗增强免疫作用的对比[0086] 1、目的：比较商品磷酸铝佐剂和实施例1制备的磷酸铝佐剂对HPV18L1疫苗诱导体液

[0087] 免疫应答的增强作用。

2、方法：将不同种类的磷酸铝与HPV18L1混合后免疫小鼠。

[00] 2.1实验材料

[0090] 2.1.1实验动物：小鼠：BABL/c，雌性未孕，6周龄或16～20g

[0088]

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CN 102188701 A[0091]

说 明 书

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2.1.2实验样品：

[0092] 用不同种类的磷酸铝佐剂吸附HPV 18L1原液，配制成HPV 18L1单价疫苗0.5ml/剂(含HPV18L1 20μg)，其组成如下表：[0093] 表4

[0094]

样品 I II III IV

[0095]

铝佐剂的添加量(/ml) 450μg Adju-phos 450μg 75/15型铝佐剂 450μg 75/20型铝佐剂 450μg 75/30型铝佐剂

HPV18L1添加(/ml) 40μg 40μg 40μg 40μg

2.2免疫实验分组：

[0096] 免疫实验组I：HPV 18L1疫苗样品I用含铝吸附缓冲液I进行稀释，该实验组又分为5个实验亚组：0.06μg/0.5ml(A组)，0.02μg/0.5ml(B组)、0.0067μg/0.5ml(C组)、0.0022μg/0.5ml(D组)和0.0007μg/0.5ml(E组)。

免疫实验组II：HPV 18L1疫苗样品II用含铝吸附缓冲液II进行稀释，该实验组

又分为5个实验亚组：0.06μg/0.5ml(F组)，0.02μg/0.5ml(G组)、0.0067μg/0.5ml(H组)、0.0022μg/0.5ml(I组)和0.0007μg/0.5ml(J组)。[0098] 免疫实验组III：HPV 18L1疫苗样品III用含铝吸附缓冲液III进行稀释，该实验组又分为5个实验亚组：0.06μg/0.5ml(K组)，0.02μg/0.5ml(L组)、0.0067μg/0.5ml(M组)、0.0022μg/0.5ml(N组)和0.0007μg/0.5ml(O组)。[0099] 免疫实验组IV：HPV 18L1疫苗样品IV用含铝吸附缓冲液IV进行稀释，该实验组又分为5个实验亚组：0.06μg/0.5ml(P组)，0.02μg/0.5ml(Q组)、0.0067μg/0.5ml(R组)、0.0022μg/0.5ml(S组)和0.0007μg/0.5ml(T组)。[0100] 免疫实验组V：阴性对照组用空白对照缓冲液，其编号为(U组)。[0101] 2.3评价方法

[0102] 用稀释后的样品免疫小鼠BABL/c一次，每种剂量注射10只(0.5ml/只、5点注射、每点0.1ml)共210只。

[0097]

小鼠免疫后28d，采用摘眼球取血，分离血清进行阳转率的检测。

[0104] 结果：由小鼠体内活性ED50值判断，自制75/20佐剂增强HPV 18L1单价疫苗效果最佳，且由于商品化Adju-phos佐剂。结果见表5.

[0105] 表5.商品化和自制磷酸铝佐剂对HPV18L1疫苗诱导体液免疫应答的实验结果

[0103] [0106]

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说 明 书

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[0107]

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CN 102188701 A

说 明 书

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[0108] [0109] [0110] [0111] [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] [0120] [0121] 实施例4、自制磷酸铝佐剂质量标准

检验项目 标准规定性状 乳白色悬液磷酸盐鉴别 呈正性反应铝盐鉴别 呈正性反应pH值 6.0～8.0过氧化物 ≤0.0015％氯化物 ≤0.005％可溶性磷酸盐 ≤0.5％

硫酸盐 ≤0.2％可溶性铝盐 ≤0.0005％砷盐 ≤0.00001％重金属 ≤0.0001％灼烧残渣 ≤0.1％

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说 明 书

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无菌试验 应无菌生长

[0123] 细菌内毒素 ≤2.5EU/ml[0124] 含量测定 0.40～0.60％[0125] 本发明的范围不受所述具体实施方案的，所述实施方案只作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。

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说 明 书 附 图

图1

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说 明 书 附 图

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图2

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