几种中药提取物对不同病原菌的抑制作用 张文芳１高郁芳２ （１长春市绿园区农业局，长春１３００６２；２吉林农业科技学院，吉林１３２１０１） 随着时代的发展，人们健康意识的逐渐提高，环境与农 产品的安全性受到了广泛重视，而且对农药残留的也 要求的很严格。近年来，化学农药被大量使用于农业生产 中，由于多数在自然环境中不易降解，蓄积能力强，导致污 染了环境，使病虫害产生了抗药性，破坏了生态平衡，农作 物及畜产品中农药残留量超标，危害了人体健康。而最值得 注意的是生产这些化学农药过程中三废的排放问题，按我 国１９９８年生产化学农药约ｌ８万ｔ计，年排放的三废超过 ４０万ｔＩｌ＿。因此，化学农药的使用量势必会不断下降，而植物 源农药将替代化学农药广泛应用于农业生产中。 植物源农药的活性成分是自然存在的物质，在自然界 中的降解不污染环境，不会对人体产生危害，且低毒、低残 留、病虫害不易产生抗药性，农产品的高品质能够得到充 分保留。植物源农药活性成分复杂，通常能作用于靶标生物 的多个位点，有利于延缓靶标生物的抗药性；有些植物源农 药还能刺激植物生长，起到生长调节作用嘲。因此植物源农 药在农业生产中具有广阔的应用前景。 纪淑娟等对丁香抑菌成分超声波提取工艺进行研究， 得到以９５％乙醇为溶剂的提取物对灰葡萄孢菌的抑菌率 为６２．４７％ ；杨帮等对美洲商陆抑菌活性进行研究，得出以 极性强的甲醇为溶剂对柑橘绿霉病和小麦纹枯病２种病原 菌的抑菌率均达１００％ ；崔永明等在甘草总黄酮的提取技 术及其抑菌活性研究中指出甘草总黄酮对金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌的抑制作用均较为明显嘲；杨国平等通过天南星 提取物对小鼠Ｓ１８０肉瘤的抑制作用的研究，得出天南星醇 提物对小鼠Ｓ１８０肉瘤表现出明显的抑制生长作用，并未造 ２试验方法 ２．１病原菌的分离、纯化与鉴定 ２．１．Ｉ薏苡弯孢叶斑病菌的分离、纯化与鉴定 取带有病斑的薏苡叶，于病健交界处剪成２ｍｍｘ５ｍｍ 的长方形小块，在无菌操作台中对其进行表面消毒，先置于 ７５％乙醇中灭菌２５ｓ，取出，然后放人到０．１％升汞中灭菌 ３－５ｍｉｎ，取出，再放人到无菌水中洗涤３次。 将上述经灭菌的病组织采用五点法接种于ＰＤＡ培养 基上培养，倒置于２８￣Ｃ的恒温箱中培养３—５ｄ，观察菌体生 长情况，挑取组织边缘长出的菌丝，接种到新培养基中，多 次重复挑取、接种，进行纯化。 根据左淑珍等对玉米弯孢菌叶斑病及其抗源鉴定、抗 性遗传研究现状鉴定此种病菌为薏苡弯孢叶斑病菌（Ｃｏｉｘ ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ）ｔ７１。 成明显毒害作用闻。根据上述文献可知，丁香、商陆、甘草、天 南星对不同致病菌有很强的抑制生长作用，而为研究不同 中药提取物对不同致病菌的抑制作用，本试验选用８种中 药材的提取物对４种主要致病菌进行抑菌活性研究，以筛 选出对主要致病菌有抑制作用的中药提取物，对于开发和 利用我国丰富的中药植物资源，有着十分重要的意义。 １试验材料 １．１试验仪器与试剂 ＬＲＨ一２８０型微电脑控制生化培养箱、ＬＤＥｘ一４０ｓｃ Ｉ 型立式自动电热压力蒸汽灭菌器、无菌操作台、高压蒸汽灭 菌锅、回流提取器、ＨＨ—ｓ型恒温水浴锅、培养皿、试管、分 析天平托盘天平玻璃棒烧杯、量筒、锥形瓶、玻璃吸管 酒精灯涂布棒、打孔器、接菌环、挑针、记号笔等。９５％乙 醇、７５％乙醇、无菌水等。 １．２供试菌种 ｕｓ ａｕｒｅｕｓ 金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ ）、大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｔｏｌ１），由吉林农业科技学院微生物实验室提 供；带有薏苡弯孢叶斑病菌的病叶和菜豆灰霉病菌的病果， 均采自吉林农业科技学院九站校区药植园。 １－３供试药材 辛夷（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｂｉｏｎｄｉｉ Ｐａｍｐ．）的干燥花蕾、艾蒿 （Ａ￣ｅｍｉｓｉａ ａｒｇｙｉ Ｌｅｖｉ．ｅｔ Ｖａｎ．）的干燥叶、北豆根（Ｍｅｎｉｓｐｅｒ－ ｍｕｍ ｄａｈｕｒｉｃｍｎ ＤＣ．）的干燥根茎、天南星『Ａｒｉｓａｅｍａ ｅｒｕｂｅｓｃｅｎｓ ｆＷａｌ１．１ Ｓｃｈｏｔｔ］的干燥块茎、丁香（Ｅｕｇｅｎｉａ ａｒｏｍａｔ— ｉｃａ Ｂａｉｌ１）ｌ￣Ｊ干燥花蕾、商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｃｉｎｏｓａ Ｒｏｘｂ．）的干 燥根、甘草（Ｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚａ ｕｒａｌｅｎｓｉｓ Ｆｉｓｃｈ．）的干燥根和根茎、 萝 『Ｍｅｔａｐｌｅｘｉｓ ｉａｐｏｎｉｃａ（Ｔｈｕｎｂ，）Ｍａｒｋ．１的干燥全草，以上 药材均购自国营中药材药店。 １．４培养基 ＰＤＡ培养基：土豆２００ｇ，葡萄糖２０ｇ，琼脂２０ｇ，水 １０００ｍｌ；高温湿热灭菌：１２１℃３０ｍｉｎ。 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏３ｇ，蛋白胨Ｊｏｓ，Ｎａｃｌ ５ｇ， 琼脂２０ｇ，水１０００ｍｌ；ｐＨ ７．０—７．２；高温湿热灭菌：１２１℃ ．２．１．２菜豆灰霉病菌的分离、纯化与鉴定 菜豆灰霉病菌的分离采用菌丝直接挑取培养法。将带 病的病果用无菌水擦洗干净，在无菌操作台上，用７５％乙 醇擦拭没有菌丝的部分进行表面消毒，用消毒过的镊子拨 开表层菌丝，挑取内层的菌丝，将其接种于ＰＤＡ平板培养 基上，倒置于２８℃恒温箱中培养，３天后观察、挑取边缘菌 丝，将其移至新培养基上培养，进行纯化。 根据杨素梅等对菜豆灰霉病的发生与防治措施的研究 鉴定该病菌的病原菌为灰葡萄孢菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）ｔｓｌ。 ２．２中药提取液的制备 将上述中药材料粉碎，取粉碎的各类药粉３ｏｇ，以９５％ 乙醇为溶剂（药粉：９５％乙醇＝１－１５ ，采用回流提取法提取 ４ｈ（提取温度为８５℃），然后将提取液置于旋转蒸发仪中进 行浓缩，再用９５％乙醇定容，使溶液的浓度为ｌｇ／ｍｌ，然后移 置广口瓶中，密封，保存于４℃冰箱中，备用。 ２．３供试菌种的活化扩繁与菌悬液的制备 薏苡弯孢叶斑病菌、菜豆灰霉病菌的活化扩繁：将冰箱 中纯化的病原菌取出，在无菌操作台中分别用灭菌后的接 种环接种于新ＰＤＡ培养基上，在２８￣Ｃ恒温箱中培养３—５ｄ， 备用。 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的活化：分别将菌种用接种 环接种于含牛肉膏蛋白胨培养基试管中，３７℃恒温培养 ２４ｈ，备用。 菌悬液的制备：将２０ｍｌ无菌水倒入含已活化好的细菌 的试管中，用灭菌的接种环将菌种挑起，稍加振摇，既得金 黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌悬液。 ２．４几种中药提取物的抑菌活性测定 、 ２．４．１几种中药提取物对病原真菌的抑制作用 采用生长速率法 ，测定各类药材１ｇ，Ｉｌ１ｌ的乙醇提取物 对供试菌种的抑制效果。 在无菌条件下，取各类药材提取物ｌｍ１分别加入无菌 的直径９ｃｍ培养皿中，对照组加入等量９５％乙醇，再加入 １０ｍｌＰＤＡ培养基，混匀，待其凝固后，得到含药平板。用直 径０．６ｃｍ的打孔器分别制得薏苡弯孢叶斑病菌和菜豆灰霉 病菌的菌饼，用挑针将菌饼接种于含药平板，２８￣Ｃ条件 下进行恒温培养，每次处理重复３次。３ｄ后开始观察菌落 大小，并采用七字交叉法测量菌落直径，连续测量４ｄ，并记 录数据，计算抑菌率［９１。 菌落生长抑制率＝（对照菌落直径一处理菌落直径）／（对 照菌落直径一打孔器直径）ｘ１００％ ３０ｍｉｎ 所得结果通过ｓｐｓｓ软件进行方差分析，进而采用 ＳＮＫ－ｑ检验法进行显著性检验。 ２．４．２几种中药提取物对细菌的抑制作用 采用滤纸片法㈣，测定各类药材ｌｇ／ｍｌ的乙醇提取物对 供试菌种的抑制效果。 用打孔器将滤纸打成直径０．８ｅｒａ的圆片，经高压蒸汽 ７６ 灭菌后，放人盛有各提取物的容器中浸泡１ｈ，对照组滤纸 片用９５％乙醇浸泡。向平板中的培养基表面加入０．５ｍｌ已 配制的金黄色葡萄球菌及大肠杆菌的菌悬液，用三角涂布 棒将其均匀涂布，采用五点法将浸泡好的滤纸片放入到平 板中，每次处理重复３次，于３７￣Ｃ条件下恒温培养２４ｈ，然 后用十字交叉法测量抑菌圈直径。用表示抑菌圈的直径。 ２．５几种中药提取物的最小抑菌浓度测定 通过上述实验，筛选出丁香和辛夷对两种病原真菌、商 陆对菜豆灰霉病菌分别作最小抑菌浓度试验。在无菌条件 下，用９５％乙醇将各提取物稀释成稀释度为１１２、１／４、１／８、１／ １６、１／３２的溶液，分别精取各浓度溶液ｌｍｌ与适量ＰＤＡ培 养基混合均匀，制成含药培养基，冷却，备用 将打好的病原 菌菌饼接种到含药培养基上，倒置于２８ａＣ恒温箱中培养， 每次处理重复３次，从第３ｄ开始观察，每间隔１ｄ观察一 查！：！ ！ 壁 竺塑 重 璺 墨堕 ８ ａ／ｚｔ￣ｓ 墨 ３２ 竺．一＿ 一 一 ４ 荣 般撼， 前 慧茁弯饱叶艇摘茴 由表３－５可以看出，不同稀释度的丁香提取物对菜豆 灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的抑制效果基本相同，最小 抑菌浓度均为０．０６２５ｇ，ｍｌ。 袭３－６不同稀释度的丽陆提取物＿封菜吐 霉痈西的抑制效果 菜豆灰霉病菌 注： 一 － ＋ ＋ ＋ ＋０．５ 表 无病原菌生长；“＋ 表示雨痛原茼生长 由表３－６可以看出，不同稀释度的商陆提取物对菜豆 灰霉病菌的抑制效果也是随着浓度的降低而减弱。实验得 出，商陆提取物对菜豆灰霉病菌的最小抑菌浓度为０．５ｇ／ 次，连续观察至第７ｄ。得到最小抑菌浓度［９１。 ３结果与分析 ３．１几种中药提取物对真菌的抑制作用 ３．１．１几种中药提取物对菜豆灰霉病菌的抑制作用 二 三三二二羔茎 兰兰董茎兰三兰竺 兰曼三三三三兰 薹一耋 ：：：； 萎 蠢 嚣 ； 毒ｏ ； ； 。 嚣 ｉ 由表３－１可知各类中药提取物除天南星外都对病原 菌的生长产生了抑制作用，其中辛夷、商陆和丁香的提取物 对菜豆灰霉病菌的抑菌率均达１００％，与其他中药提取物 有极显著性差异；其次是北豆根和萝的提取物，抑菌率达 到７６．３％；甘草提取物的抑菌率为６９．７％；艾蒿提取物的抑 菌率相对较低，为３３．８％；天南星提取物对菜豆灰霉病菌无 抑制作用。从结果来看，辛夷、商陆和丁香的提取物表现出 较强的抑菌活性，可见，辛夷、商陆和丁香提取物中含有的 抑菌活性成分较多。 ３．１．２几种中药提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作 用 由表３－２可知各类中药提取物都对病原菌的生长产 生了抑制作用，其中辛夷和丁香的提取物对薏苡弯孢叶斑 病菌的抑制效果最好，抑菌率达到１００％；其次是甘草和商 陆的提取物，抑菌率也达到８３％左右；而北豆根、萝和艾 蒿提取物的抑菌率也分别达到了７０．８％、６５．４％、５９．１％；天 南星提取物对薏苡弯孢叶斑病菌的抑制作用不是很明显， 抑菌率为２．５％。从结果看，辛夷和丁香的提取物中抑菌成 分的活性较强，可见，辛夷和丁香中的抑菌活性成分为醇溶 性成分。 ３．２几种中蕴提取物怼组菌的 劁．｛ 用 一差 薹 一 ：… ’； ～ 主 薹 ： ： 二 由表３－３可知，几种中药提取物对大肠杆菌的抑制效 果整体比对金黄色葡萄球菌的抑制效果好，其中丁香提取 物的活性最强，甘草、商陆和萝的提取物的活性较弱；而 这些提取物对金黄色葡萄球菌也有不同程度的抑制效果， 甘草和丁香提取物的活性最强，而辛夷和艾蒿提取物对金 黄色葡萄球菌均表现为无潘陛。从结果看，丁香提取物对金 黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的抑制作用；而甘草提 取物只对金黄色葡萄球菌表现出很强的活性。 ３．３几种中药提取物的最小抑菌浓度 ＂４ 、 ￣ｎｒ，ａ剌疆月Ｅ ｊ晦矗获｜‘，Ｈ茁 － － 一 一 ＋ ＋ ０… 慧茁弯饱叶斑瞒曲 － ＋ ＋ ＋ ＋ １ 由表３－４可以看出，不同稀释度的辛夷提取物对真菌 的抑制效果不同，浓度越大，抑制效果越好。实验得出，辛夷 提取物对菜豆灰霉病菌和薏苡弯孢叶斑病菌的最小抑菌浓 度分别为０．１２５ｇ／ｍｌ、ｌｅ－￣ｍｌ。 ｍｌ。 综上所述，８种中药提取物除天南星提取物外对两种 病原菌均有很好的抑制效果。辛夷、商陆和丁香的提取物对 菜豆灰霉病菌抑菌效果最好，达到了完全抑制的效果；辛夷 和丁香提取物对薏苡弯孢叶斑病菌抑菌效果也是最好，达 到完全抑制的效果。对于细菌来说，这几种中药提取物除辛 夷和艾蒿提取物对金黄色葡萄球菌没有抑菌活性外，其他 提取物对两种细菌均有不同程度的抑菌活性。总体上来说， 这些提取物对大肠杆菌的抑菌活性要好于对金黄色葡萄球 菌的抑菌活性，甘草和丁香的提取物对金黄色葡萄球菌的 抑菌活性最强，丁香提取物对大肠杆菌的抑菌活性也最强， 其他提取物对大肠杆菌也均有不同程度的抑菌活性。 综合上述实验结果可以看出，丁香提取物对４种病原 菌均有很强的抑制作用。丁香提取物的主要成分为挥发油， 挥发油中含量最高的组分是丁香酚，而挥发油对金黄色葡 萄球菌和大肠杆菌均有明显的抑菌作用，丁香酚对不同病 原真菌均有较强的抑制和杀灭作用，因此，丁香提取物中主 要的抑菌成分应为挥发油中的丁香酚；丁香提取物中抑菌 成分并非单一的丁香酚，丁香提取物中所含的脂溶性成分、 水溶性成分均对金黄色葡萄球菌有很强的抑菌作用［１１】。这 与前人研究的丁香提取物对不同致病菌均有很强的抑菌作 用相吻合。李巧如等［１２ｌ通过研究丁香提取物与各类抗菌素 间的相互作用探讨其抗菌机理，推测丁香提取物的抗菌机 理可能是由于氨基糖苷类竞争性地抑制蛋白质的合成而产 生的。 辛夷提取物对两种病原真菌均有很强的抑菌作用。辛 夷提取物中生物碱类成分对致病性的真菌有明显的抑制作 用；高浓度的辛夷提取物对细菌有不同程度的抑制作用 ［１３，１４］。商陆提取物对菜豆灰霉病菌有很好的抑制作用。商陆 提取物中的总皂甙成分对真菌菌体的生长有很好的抑制作 用 。甘草提取物中主要含有甘草酸、甘草苷、异甘草素等活 性成分，对金黄色葡萄球菌有较强的抑菌活性㈣；甘草中的 总黄酮成分对细菌的抑菌效果也较为明显 。 本试验分别用８种不同中药的乙醇提取物对４种常见 致病菌作了抑菌活性研究，从结果来看，总体上这些提取物 的抑菌效果有明显差异，但个别提取物之间的差异不明显， 产生这样的原因可能是由于提取过程中的差异造成，或是 其他成分同时也被提取出来，也有可能是药材地域性、季节 性的变化而影响其有效成分含量，亦或是致病菌本身的差 异，而影响了对各个菌种的抑菌效果。本试验只采用了 ９５％乙醇作为提取溶剂提取得到８种中药的粗提物，没有 对其他溶剂进行研究，也没有对粗提物进一步提取确定其 抑菌活性成分为单体成分或几种成分联合作用进行研究； 真菌在恒温培养箱培养条件下不能产生分生孢子，因而只 对菌丝作了抑菌活性研究，没能作对致病菌分生孢子形成 和萌发的影响试验［９］，导致了本试验的局限性。另外，试验 中只针对室内的抑菌活性进行了研究，其在田间试验的防 治效果如何，对筛选出抑菌活性强的提取物制成何种剂型 能被植物有效吸收，使用后是否能完全降解，还需作进～步 深入研究。本研究初步筛选出丁香提取物对不同致病菌均 有明显的抑制作用，为后续开发植物源农药应用于生物防 治中提供了理论依据。
