学校代码：三！！至业研究生学号：密１２４４６０４０１７分类号：笾级：无＠东牡打爷冠太莩硕士学位论文：ｇ－篙挥发油抗菌活性研究ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａＮａｐｈｔｈａ作者：谢荚辉指导教师：周义发教授学科专业：生物化学与分子生物学研究与。向：天然产物生物化学学位类型：高师硕士东北师范大学学位评定委员会２００７年５月摘要青蒿（ａｒｔｅｍｉｓｉａｅａｎｎｕａｅ，ｈｅｒｂａ）系菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）蒿属（ａｒｔｅｍｉｓｉａ）植物，作为传统的常用中药，有很高的利用价值。临床上可治疗哮喘、阴虚发热、气管炎及黄疸等疾病，在心血管系统疾病和肿瘤等方面也有明显的药理活性。青蒿挥发油是青蒿活性成份之一，有消炎、止痒、避虫等功效。本文优化了青蒿挥发油提取条件，并且进一步试验了青蒿挥发油的抗菌活性。研究工作采用水蒸气蒸馏法提取青蒿挥发油，对物料比和提取时间进行优化选择，发现两个因素对挥发油的提取均有较大的影响。结果表明青蒿挥发油提取的最佳条件是水与提取物的比例为７：１，提取时间３小时时产率最高。利用上述的最佳提取条件对不同生长期的青蒿出油率进行比较，结果表明９．１０月份采集的果期青蒿出油率为１．６７％，明显高于其他生长期。研究青蒿挥发油抗菌实验中采用纸片法对４种受试菌种进行抑菌试验，结果表明：青蒿挥发油对受试菌种均有明显的抑菌作用，且随着浓度逐渐增大抑菌作用也随之加强。在此基础上参照文献采用试管法分别对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（ＭＩＣ）。结果表明：大肠杆菌最低抑菌浓度（ＭＩＣ）为２．８１ｍｇ／ｍｌ；其余受试菌种最低抑菌浓度（ＭＩＣ）均为５．６３ｍｇ／ｍ１。关键词：青蒿；挥发油；抗微生物活性ＡｂｓｔｒａｃｔＡｒｔｅｍｉｓｉａｅｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｏｆａｎｎｕａ，ａｓｐｅｃｉｅｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉａＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ．ｉｓａＣｌｉｎｉｃａｌｌｙ，ｉｔｉｓｕｓｅｄｔｏｒｅｍｅｄｙａｓｔｈｎｌａ，ｙｉｎａｓｔｈｅｎｉａ，ｐｙｒｅｘｉａ，ｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ，ｊａｕｎｄｉｃｅ，ｄｉｓｅａｓｅｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒｓｙｓｔｅｍ．ｔｕｍｏｒ，ａｎｄａｎｄｔｅｓｔｅｄｔｈｅｉｒａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌＳＯｏｎ．１１１ｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｓａｒｅｉｍｐｏｒｔａｎｔａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．ａｎｎｕａＩｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．ｗｅｅｖａｌｕａｔｅｄｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎＴｈｅｙｉｅｌｄｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｓｗａｓｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄｂｙｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｍａｔｅｒｉａｌ／ｗａｔｅｒｐｅｒｉｏｄ．ｎｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒｏｉｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｗａｔｅｒｓｔｅａｍｄｉｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈａｔｔｈｅａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄｉＳ２ｈｏｕｒｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｙｉｅｌｄｓｉｎｔｈｅｇｒｏｗｔｈｓｅａｓｏｎ．ｉｔＷａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔｔｈｅｕｎｒｉｐｅｆｉ＇ｕｉｔｓｉｎａｕｔｕｍｎｒａｔｉｏｏｆｍａｔｅｒｉａｌ／ｗａｔｅｒｉｓ７：１ｄｉｆｅｒｅｎｔｐａｒｔｓａｎｄｉｎｄｉｆｆｅｍｅｍｐｒｏｄｕｃｅｍｏｒｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｓｔｈａｌｌｏｔｈｅｒｐａｒｔｓａｎｄｉｎｏｔｈｅｒｓｅａｓｏｎｓ．ＴｈｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｓｆｒｏｍＡｒｔｅｍｉｓｉａａｇａｉｎｓｔｔｗｏｆｕｎｇｉａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｆｉｌｔｅｒｐａｌ＇ｅｒｔｗｏｍｅｎｔｈｏｄｓｈｏｗｅｄｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｄｅｐｅｎｄａｎｔｏｎｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｆｉｌｔｅｒＰａＤｅｒｉｎｈｉｂｉｔｅｄａｌｌｔｅｓｔｅｄｆｕｎｇｉａｎｄｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｗｅｒｅｏｆｅｓｓｅｎｔｉｏｎａｌｏｉｌｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｅｓｔｔｕｂｅｍｅｔｈｏｄａｎｄｔｕｂｅｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉｏｎａＩｏｉｌｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆ西ｃｈｅｒｉｃｈｉａＣＯｌｌ．ｗｉｔｈｔｈｅｍｉｎｉｍｕｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ）２．８１ｍｇ／ｍｌ，ａｎｄｔｏＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｗｉｔｈｔｈｅＭＩＣｗａｓ５．６３ｍｇ／ｍｌ；Ｔｈｅｔｗｏｌｕｎｇｉｗｅｒｅｂｏｔｈｉｎｈｉｂｉｔｅｄｂｙｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌ．ｔｏｏ．ＢｕｔｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｔｏＡｌｔｅｒｎａｒｉａＳＯｌａｎｉＷａｓｓｔｒｏｎｇｅｒｔｈａｎｔｏＧｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｓｏｒｇｈｉ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ａｒｔｅｍｉｓｉａ；Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌ；ＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙＩＩ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：诎墓煜日期：如］，』．』学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名指导教师签名：阻日期：也盘１．占。ｌ工作单位：鱼盈堑她兰幽：通讯地址：兰蜮五迟盎蕴幽魏ｋ学位论文作者毕业后去向：电话：！丝￡＝鱼墼钉夕７邮编：丛Ｚ‘２亚旦引言青蒿为传统中药，性味苦、辛，微寒，归肝，有特殊香气。具有清热解暑，截疟、抗心律失常、抗系统性红斑狼疮、抗病毒、抗肿瘤等生理活性。临床上用于治疗哮喘、阴虚发热、感受署邪及免疫系统等疾病。青蒿的有效成分较多，其中青蒿素是我国科学工作者于１９７２年从青蒿中提取的抗疟有效成分，具有起效最快、疗效最好、毒性最低的特点，在国际上引起极大的轰动，被世界卫生组织称为是世界上唯一有效的抗疟药物１１－２］。由于青蒿中含有抗疟活性物质一青蒿素，目前青蒿主要用于提取青蒿素。而青蒿挥发油和青蒿中其他成分在青蒿素提取过程中被遗弃，大量的其他成分未被加以综合利用，导致青蒿素成本居高不下，影响青蒿素类药的广泛应用。因此，开展对青蒿的综合利用研究，是降低青蒿素成本的有效途径之一。青蒿的化学成分复杂，可分为挥发性和非挥发性两大类，挥发性成分即挥发油，它的主要成分有蒿酮、异蒿酮、茨烯、丁香烯、左旋樟脑、月挂烯、樟脑等成分。其中以烯类成分为主，这也从理论上解释了青蒿本身具有强烈芳香气味的原因。非挥发性成分主要有青蒿素、青蒿甲素、青蒿丙素以及青蒿素的多种衍生物。目前对青蒿的研究主要集中在青蒿素及其衍生物上【３，４】，而对挥发油的研究很少。青蒿挥发油的提取受多种因素的影响，利用水蒸汽蒸馏法提取青蒿挥发油。通过采取不同的方式，筛选出挥发油提取的最佳条件，提高了挥发油的出油量。同时根据传统中医使用青蒿退热，多采用后下以取其气的特点，以及现代研究己证明青蒿挥发油具有一定的活性作用１５１。本项目拟开展青蒿挥发油的抗菌活性的研究，为野生资源的开发利用，具有一定的经济价值和社会效益，使传统的中药得到更广泛的应用。第一章青蒿的研究现状青蒿，别名：香蒿、苦蒿、黑蒿。为菊科一年生草本植物黄花蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ）的干燥地上部分。耐干旱喜潮湿。一般夏秋两季采收。生长于山坡、荒地、路旁、河岸、旷野、丘陵等处。广泛分布于全国各地，根和种子易成活且繁衍能力较强，因此资源十分丰富。青蒿作为我国传统的常用中药，虽为野生植物，却有很高的利用价值Ｋ】。千百年来一直受到人们的关注，最早载于马王堆出土《五十二病方》，《神农本草经》。晋葛洪《时后备急方》治疟病方载有：“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁尽服之。”此后，宋，元，明各作家医籍本草均有以复方“青蒿汤”；“截虐青蒿丸”；“青蒿散”治虐。李时珍亦称青蒿“治虐及寒热”，清代《瘟病条辨》用“青蒿鳖甲煎”、“治少阳虐”，民间也有流传使用［７１。青蒿其性微温，嫩枝叶入药，可清热凉血、清热解暑、治疟、久热稽血、骨蒸潮热、血热哑血、虚烦盗汗、中暑头晕、久热寒热、高热不退。具有抗心率失常、抗系统性红斑狼疮、抗内毒素等功效。临床上用于治疗哮喘、阴虚发热、感受暑邪、疟疾及免疫系统等作用［８】。目前，国内外对青蒿在治疗诸多疾病方面的研究都得以肯定，特别是抗疟方面得到了国际公认。为野生资源的开发利用，具有一定的经济价值和社会效益。１．青蒿的主要生物活性成分青蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎ“ａＬ．）为菊科一年生草本植物。茎直立，多分枝，高５０—１５０ｃｍ，如在试验地里管理良好的条件下，多可高达２ｍ以上。基部及下部叶在花期枯萎，中部叶卵形，三次羽状深裂，裂片及小裂片矩圆形或倒卵形，叶开展，顶端尖，基部裂片常抱茎，两面被短微毛。上部叶小，常一次羽状细裂。青蒿为浅根系植物，主根短，侧根发达多而密集。青蒿整个生育期大约２４０ｄ左右。以本地区为例，从９月下旬至１０月上旬种子成熟，次年以４月下旬至５月中旬种子开始萌发。该时期发芽率高，出苗整齐，１８．２５℃是种子发芽的适宜温度。７月中旬至８月中旬为花蕾期。头状花序黄绿色，极多数，球形，长及宽约１．５ｍｍ，有短梗，排列成复总状或总状，常有条形苞叶，总苞片２．３层，外层狭矩圆形，内层椭圆形，花托长圆形，花筒状，外层雌性，内层两性。９月上旬左右形成果实，瘦果矩圆形，长不超过ｌｍｍ无毛。９月下旬、ｌＯ月上、中旬，种子成熟，每克种子超过３万粒。青蒿的化学成分复杂，可分为挥发油和非挥发性两大类，前者主要是挥发油。是采用适当的溶剂及方法从天然青蒿中萃取具有香气的浓缩萃取物。青蒿挥发油由于产地的气候、雨量、日照和土质等诸多自然环境的不同，其化学组成与含量差异很大眇…。青蒿挥发油的成分主要有蒿酮（ａｒｔｅｍｉｓｉａｋｅｔｏｎｅ），异酮蒿（ｉｓｏａｒｔｍｉｓｉａｋｅｔｏｎｅ），茨烯（ｃａｍｐｈｏｎｅ），ｐ一蒎烯（ｆｌ－ｐｉｎｅｎｅ），ｐ一丁香烯（ｆｌ－ｃａｒｙｏｐｈｌｌｅｎｅ），左旋樟脑（三一ｃａｍｐｈｏｒ），ａ．蒎烯（ａ－ｐｉｎｅｎｅ），月桂烯（ｍｙｒｅｃｅｎｅ），柠檬烯（１ｉｍｏｎｅｎｅ），１．８－桉叶素（』．８－ｃｉｎｅｏｌｅ），Ｔ．松油烯（ｙ－ｔｏｒｐｉｎｅｎｅ），ａ－松油醇（ｎ—ｔｅｒｐｉｎｅ０１），反式－丁香烯（ｔｒａｍｃａｒｏｐｈｙｌｌｅｎｅ），反２式－ｐ一金合观烯（ｔｒａｎｓ－ｆｌ－ｆａｒｍｅｓｅｎｅ），异戊烯龙脑脂（ｂｏｒｙｌｉｓｏｖａｌｅｒａｔｅ），等４０多种。其中茨烯，异蔫酮，左旋樟脑，ｐ．丁香烯及Ｂ．蒎烯约占挥发油的７０％【１１】（见表一）。非挥发性成分主要有青蒿素（ａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ），青蒿甲素，青蒿乙素，青蒿丙素，氢化青蒿素，青蒿酸，香豆素，茗黄素，黄酮豆甾醇，Ｂ．谷甾醇，青蒿醇甲酯和青蒿醇等”２１。并在青蒿素的基础上又开发了多种衍生物如：青蒿琥酯（ａｒｔｅｓｕｎａｔｅ），双氢青蒿素（ｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ）及蒿乙醚（ａｒｔｅｍｅｔｈｅｒ）等Ｉ”４４Ｊ。表１青蒿挥发油组分及相对含量序号１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５一化台物名称ｂｅｔａ－ＰｉｎｅｎｅＥｕｃａｌｙｐｔｏｌ分子茸ＣｌｏＨｌ６Ｃ１０Ｈ１８０Ｃ１０Ｈ１６ＣＩｏＨＩｓ０Ｃ１０Ｈ１６Ｃ１０Ｈ１８０Ｃ】ｏＨｌ８０ＣｌｏＨｌ６０ＣＩｏＨｌ６０ＣｌｏＨｌ４０Ｃ１０Ｈ１８０ＣｌｏＨｌ８０ＣｌｏＨｌ４０ＣｌｏＨ】８０Ｃ１０ｌｌｌ６０分子量１３６１５４１３６１５４１３６１５４１５４１５２１５２１５０１５４１５４１５０１５４１５２翌墨、芎２．７３５．１９２．３０１．８５１．１０１．４６１．１ｌ２．２９１．８８２．５１２．３２３．３３１．５７２．２８１．９４１３－蒎烯桉油醇，桉树脑１＇－萜品醇３－萜品醇ｇａｍｍａ－ＴｅｒｐｉｎｅｏｌＢｅｔａ－Ｔｅｒｐｉｎｅｏｌ４一Ｃａｒｅｎｅ蒈醇３－癸炔－２一醇３－Ｄｅｃｙｎ－２－ｏｌＬｉｎａｌｏｌ里哪醇（沉香醇）Ｃａｍｐｈｏｒ，ｎａｔｕｒａｌ天然樟脑ｔｒａｎｓ．Ｐｉｎｏｃａｒｖｅｏｌ松香芹醇Ｕｍｂｅｌｌｕｌｏｎｅ伞桂酮Ｉｓｏｂｏｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ异冰片基醇Ｔｅｒｐｉｎｅｎ－４．ｏｌ萜品烯．４．醇Ｍｙｒｔｅｎａｌ桃金娘烯醛ａｌｐｈａ－Ｔｅｒｐｉｎｅｏｌ洳萜品醇Ｍｙｒｔｅｎｏｌ桃金娘烯醇１６善等。：。慧薯嬲譬。反式．２．己烯酰戊酸盐１７１８１８４ＣｕＨＥ０２２Ｕ０２－．．１１１６１．１“Ｃ１２Ｈ２００２ＣｌｏＨｌ８０２Ｃ１３ＨＣ１５Ｈ２４１９６１７０１．２５１．０４Ｂｏｍｅｏｌ，ａｃｅｔａｔｅ龙脑醋酸盐８－Ｈｙｄｒｏｘｙｌｉｎａｌｏｏｌ８－羟基里哪醇１９篓嚣凳录黑跫嚣掣删。ａ－油松基丙炔酸盐２０ａｌｐｈａ－Ｂｕｌｎｅｓｅｎｅ０２２Ｕ２２２１０１＂１３１５９．２２０４１．１９３．３１１．３２３．２４１．２６２．４７２．４６１．８２１．６３２．３８ａ一布藜烯～２１：爹詈娶翟管：凳环＋一襻，睡三甲基亚甲基双环十一碳烯２２２３２４２５２６～Ｃ１５Ｈ２４ｎ２４Ｃ１５Ｈ２４Ｃ１５Ｈ２４ＣｌｓＨ“Ｃ１５Ｈ２４Ｃ１５Ｈ２４Ｃ１５Ｈ２４０Ｃ１５Ｈ２２０Ｃ１５Ｈ２４０２０４２０４２０４２０４２０４Ｂｅｔａ－ＦａｍｅｓｅｎｅＢ癌｝呢烯３Ａｌｐｈａ－Ｍｕｕｒｏｌｅｎｅ洳木罗烯ｇａｍｍａ－Ｓｅｌｉｎｅｎｅｙ－蛇床烯Ｇｅｒｍａｃｒｅｎｅ大根香叶烯Ｅｒｅｍｏｐｈｉｌｅｎｅ荒漠术烯２０４２２０２１８２２０２７篙黑罢荔戮马兜铃素还氧化物２８２９Ｌｏｎｇｉｐｉｎｏｃａｒｖｏｎｅ长叶松香芹酮Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｅｎｅｏｘｉｄｅ石竹烯氧化物２．青蒿素的研究２．１青蒿素的发现史在很多热带国家，疟疾一直危害着人类的健康。据世界卫生组织（ＷＨＯ）估计，每年有超过５亿人感染，２百万人死亡。这种严重的状况归因于自６０年代以来出现了疟原虫的抗氯喹的变体。从那时起，特别是东南亚，疟原虫产生了对现有抗疟药物的抗药性或降低了敏感性。如氯喹、嘧啶乙胺、甚至奎宁。因此，研究新抗疟的药物有很大的必要【”ｌ。１９７２年，数百名中国研究者聚在一起探索新的抗疟药物，研究者们坚信必定有一种物质可以克服疟原虫的抗药性。已经有数千年应用史并有效保障人类健康的中药，给研究者提供了极大丰富的资源。超过１０００种传统中草药，包括长山（ＤｉｃｈｒｏａｆｅｂｒｉｆｕｇａＬ）ｔ１６】、仙鹤草（ＡｇｒｉｍｏｎｉａｐｉｌｏｓａＬ．）、青蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．）Ｄ７ｑ８１等中草药。用现代科学方法来研究其对动物样本的抗疟性，这些草药包括除了结构，已经鉴别和分离出了他们的有效活性成分，从青蒿中提取的青蒿素因其出色的抗疟活性及低毒性是这些化合物中最有前途的一个。青蒿（ＡｒｔｅｍｉｓｉａａｎｎｕａＬ．）是中国特有的植物，并且生长茂盛分布较广。因此易于采集，即被视作药物。李时珍的《本草纲目》中收录此药物用作疟疾的治疗，因而很多研究小组把它作为主要的研究课题。然而分离活性成分却一波三折。在青蒿素分离方面，首先我们应当提起一个人，Ｓｔｅｆａｎｏｖｉｃ博士，大概在７０年代早期他也分离了青蒿素。但是他没有确定其正确结构以及从未认识到其神奇的抗疟活性。青蒿在水或乙醇中加热萃取，其摹取物从未显示出抗疟活性。在上世纪７０年代早期，在北京、云南省、山东省的三个课题组用不同萃取过程几乎同时得到活性成分。他们分别用乙醚、石油醚及丙酮做溶剂，将分离物质进行体内抗疟筛选。随后，此组分被临床试验证实非常有效。最后４终于从菊科植物青蒿中提取出抗疟有效成分青蒿素。由于其具有一个前所未有的独特结构：由罕见的—ｍ—ｂＣ—ｏ－《—Ｏ—Ｃ＝０片断结构组成的内过氧化缩酮．内酯（图１）。迄今为止在天然产物中尚未发现类似结构。青蒿素的发现，在国际上引起极大的轰动，被世界卫生组织称为是世界上唯一有效的疟疾治疗药物。随后，国内外科学家在青蒿素化学结构基础上，开发了一系列衍生物，包括蒿甲醚、青蒿琥酯、蒿乙醚、双氢青蒿素等，它们已经成为世界上抗疟药市场上必不可少的治疗药物。因其具有独特的抗疟活性，受到了国内外学者的高度重视【１９－２０］。目前，青蒿素及其衍生物已在世界范围内广泛应用。随着对其研究的不断深入，通过大量实验研究、药理研究和临床应用表明，青蒿素是所有抗疟药中起效最快、疗效最好、毒性最低的药物，特别是对脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾疗效更为突出。ｏｌ图１青蒿素的独特结构２．２青蒿素抗疟机制青蒿素是从中药青蒿中分离出的抗疟有效单体，为无色针状晶体，是与己知抗疟药完全不同的新型药物。其抗疟原理与已知抗疟药迥然不同。它的化学结构独特，分子中没有含氮原子，是一种含过氧基团的新型倍半萜内酯，它的过氧桥结构是其有效的部位的关键，过氧桥是一个重要的抗疟活性基因，一旦过氧桥结构破坏，抗疟活性也随之消失。所以人们在以青蒿素为中心，进行合成和筛选类似青蒿素的结构或含有过氧桥的化合物，进行抗疟研究。例如在青蒿素的母核上进行修饰，发现１０一位取代的青蒿素衍生物的有效性高于其他。还通过合成过氧化物，发现也有较好的抗疟效果，如含有１，２，４，一三恶烷的过氧化物等。此后，在青蒿素的基础上开发了一系列衍生物，包括蒿甲醚、青蒿琥酯、蒿乙醚、双氢青蒿素等（图２）。也具有较强的抗疟活性，主要杀灭疟原虫的环状体。对于它的机制目前有两种说法，其一分为两个步骤【２１－２２］。第一步，活化：由亚铁血红素活化青蒿素，形成带有一个自由基的形式或其他的亲电子中间体。第二步，形成烷基化状态：青蒿素的自由基或亲电子中间体与疟原虫的微细胞器和细胞膜上的蛋白发生烷基化，使其被破坏，而没有实验证实青蒿素可使正常的红细胞膜蛋白发生烷基化。第二种解释是：青蒿素具有与奎宁类似结构的半萜醇内过氧化物，可以与疟原虫食物泡内疟色素的高铁原卟啉Ⅸ分子内的Ｆｅ”结合，从而破坏了疟色素的形成，达到杀灭疟原虫的作用‘２３埘】。青蒿素的抗疟作用自发现起就是一个不断争论的问题。球一球・肆＋毽图２青蒿素的衍生物２．２．１作用方式的探索青蒿素可用来治疗抗氯喹的疟疾，很明显他的抗疟机理不同于先前像氯喹等生物碱型的抗疟药物。从青蒿素的抗疟作用发现后，分子水平的作用方式尽管很难阐述清楚，但他仍然是一个有吸引力的问题。实际上，至今还没有弄清喹咛及其他生物碱的抗疟药物的作用方式。青蒿素抗疟药特异性地浓集在疟原虫细胞内，并在亚铁的激发下释放出活性氧或产生自由基，从而对疟原虫的膜系统或生命大分子产生氧化损伤¨”。也有实验显示青蒿素自由基能使疟原虫的蛋白质烷基化或引起疟原虫ＤＮＡ的损伤。由于人体内铁主要分布在红细胞内，而寄生于红细胞内的疟原虫，靠消化血红蛋白生长繁殖，同时游离出血红素，血红素随后复合成疟色素留在疟原虫的食物泡内，因此含有疟原虫红细胞的青蒿素含量是未含有疟原虫红细胞的１００倍以上。由实验证明，通过透射及扫描电子显微镜观察到青蒿素对疟原虫的主要作用部位是疟原虫的膜系统，其中包括细胞膜、线粒体膜及核膜的膜间隙增宽，膜变形等病理变化［２６－２７］。２．２．２其他观点在８０年初期，已经完成了青蒿衍生物抗疟活性的Ｈａｎｓｃｈ分析以及在油和水中的分配系数。发现衍生物的亲油性越高，活性越高。可以理解青蒿素衍生物的亲油性关系到穿透细胞膜的能力，但这只是作用模式的第一步。近来，很多实验室已经完成了青蒿素及其衍生物的循环伏安法研究。青蒿素衍生物的活性与其还原电势的相互关系已经有报道。然而青蒿素及其衍生物的电化学还原是一个双电子迁移过程，产生脱氧青蒿素及其衍生物，而没有自由基还原产物生成。这已经被电化学还原产物的分离和确认所证实。青蒿素在体内的主要代谢控制产物与自由基还原产物相同，所以在体内电化学还原和青蒿素的过氧桥断裂之间是否相关联还不清楚。新近，Ｊｅｆｆｏｒｄ用它的观点得出结论：碳自由基烷基化杀死虫体是合逻辑并有说服力的。但也可能由于氧原子迁移和含氧的亲电试剂的作用导致其死亡。然而，Ｈａｙｎｅｓ完全反对基于氧化还原化学和结构．活性关系上的碳中心自由基假说。在２００１年出现另一个完全不同的观点，它指出青蒿素的抗疟疾机理是：没有化学反应的完整化合物间的作用；青蒿素或其分解产物与虫体生物分子的化学反应；在氧化还原反应时产生的氧自由基。６他们的考虑是基于一个未阐明的实验结果之上的。总之，青蒿素治疗疟疾的疗效在国际多中心的临床研究中得到了一致的结果，即杀虫速度快，控制症状迅速，副作用少，耐受良好，安全范围大等特点，成为目前治疗重症疟疾特别是脑型疟的首选治疗药物［２８－２９】。但是由于半衰期短，疗程在７天以上才能达到高治愈率，为了解决这个问题，目前青蒿素类药一般采用复方配伍给药。现在已面市的复方要有复方双氢青蒿素、复方蒿甲醚等。３．青蒿挥发油的研究青蒿挥发油是抗疟药青蒿素生产过程中残余物质经淬取提纯而得的淡黄色油质液体，具有浓烈的芳香味。原油为微酸性，不溶于水及酒精，而溶于乙醚或油类（如土温８０等）。青蒿挥发油的提取：将青蒿全草阴干，剪切成３－５ｃｍ碎段，置于挥发油提取器中，加水至药材面，加热煎煮，收集、分液、萃取得到的油层经无水硫酸钠脱水，即为青蒿挥发油。青蒿挥发油中含有多种成分，是油性混合物。具有一定药用功效，如消炎、止痒、避虫等，也是夏季防暑良药。韩铁、戴璨等人对青蒿挥发油的研究发现，青蒿挥发油具有清爽的芳香味，适用于化妆品，也可用于香皂、香水、空气清新剂等。经进一步加工可为天然香料增添一个新的品种【３０】。薛雅琳，李静等人对青蒿籽油的组成分析研究时发现，在青蒿挥发油中含有的脂肪酸种类较多，但以亚油酸为主，其中不饱和脂肪酸占９９％，特别是亚油酸含量高达８４．５％，比一般优质食用油高得多。亚油酸是人体必需脂肪酸，它与平滑肌的收缩，脂类代谢中酶的活性，中枢神经系统的活动，脉搏与血压的调解，类固醇激素的生理功能、前列腺素的合成以及其他的生命机能有关【”Ｊ。此外亚油酸还具有营养脑细胞，降低血中胆固醇，调节植物神经的作用等功效。这一特征可以肯定青蒿挥发油具有颇高的保健功能。同时他们进一步对该油中的植物甾醇、维生素Ｅ的含量与组成进行了分析研究，结果证明青蒿挥发油中含有人体必不可少的维生素Ｅ。维生素Ｅ是天然抗氧化剂，在抗衰老，调节人体生殖器功能上具有重要作用【３２】。由此可见，探索青蒿挥发油的其他功效，也为开发利用我国丰富的芳香油植物资源具有重要的现实意义和理论价值。４．青蒿的药理作用研究青蒿具有清热解暑，截疟，治疗平喘、阴虚发热、感受暑邪、除虫等多种生理活性，还可增强机体在抗菌、抗病毒、抗肿瘤等方面的免疫能力。果实、枝叶均可提取芳香油，用于医药、食品、日化等领域。根、叶及果实含有多种有效成分，具有较高的药用价值。４．１免疫调节作用青蒿中的非挥发油成分大都有免疫调节作用。如青蒿素及其衍生物均有不同程度的免疫抑制作用。曾经有人用青蒿素做试验，观察对人体补体、Ｔ淋巴细胞、中性粒细胞的影响，均呈现抑制作用【３３１。青蒿素在一定浓度时，能够抑制细胞流动性，抑制旺盛细胞ＤＮＡ的合成，可以稳定细胞膜。钱瑞生等对青蒿的免疫作用和抗病毒作用的研究中指出，青蒿的免疫作用在于其可以抑制补体的激活［３４－３５１。用小鼠足垫试验，淋巴细７胞转化试验，免疫特异玫瑰花试验和溶血空斑试验等四项免疫指标，观察青蒿的免疫作用。实验表明青蒿对迟发型变态反应具有促进作用【３６】。７０年代末，就有用青蒿治疗红斑狼疮取得疗效的报道，最近，有人用青蒿琥酯配合激素治疗系统性红斑狼疮于单纯激素对照比较，无论是改善临床症状、体征、降低病情平分、改善实验指标，还是在减少激素用量，降低并发症等方面均具有明显的优势，取得总有效率９６％的疗效阶３引。４．２抗血吸虫作用青蒿抗血吸虫作用是青蒿的又一重要的生理功效，２０世纪８０年代初，人们研究发现，青蒿素有抗血吸虫作用。其后进一步研究证实，青蒿素及其多种衍生物均有抗血吸虫作用。主要是蒿甲醚和青蒿琥酯为有效的抗血吸虫药剂。肖淑华等观察到蒿甲醚对日本血吸虫磷酸化酶，乳酸脱氢酶，６．磷酸葡萄糖脱氢酶和三磷酸腺苷酶的影响。蒿甲醚引起血吸虫磷酸化酶活力的增加，使虫体糖原分解，并抑制乳酸脱氢酶。使虫体糖酵解的终产物乳酸有明显减少。此外，蒿甲醚对血吸虫的６．磷酸葡萄糖脱氢酶有明显的抑制作用ｐ９．．４０］。该作者还研究了蒿甲醚对小鼠体内日本血吸虫的己糖激酶，磷酸葡萄糖异构酶和磷酸果糖激酶的影响，证实磷酸果糖激酶可能是蒿甲醚作用与血吸虫糖酵解途径的靶酶之一【４ｌＪ。同时人们在研究发现，实验时在整个服药阶段对幼虫期的血吸虫都有杀灭作用，因此具有良好的预防效果。青蒿素还能杀灭进入宿主体内的幼虫，对疫水接触者具有保护作用，用于感染日本血吸虫尾蚴后的早期治疗，可降低血吸虫感染率和感染程度，并可预防血吸虫病发生。其抗血吸虫活性基团是过氧桥，作用机理是影响虫体的糖代谢。在大规模应用青蒿琥酯预防性治疗接触疫水的人群时发现，多数人在服药后无急性血吸虫病发生【４２Ｊ，因此，认为青蒿预防血吸虫病具有高效、安全、方便等特点，是目前比较理想的防治药物。４．３抗肿瘤作用随着人们关于细胞死亡本质认识的不断深入，它们扩大了人们的生死观的思维空间。过去一直认为肿瘤是一种由于细胞增值失控所造成的疾病。但最近研究表明，一些人类肿瘤的细胞增值率并不比正常细胞高，而其生理性细胞凋亡的能力却严重受阻，从而使肿瘤细胞成无性增加，与此相反，在严重威胁人类健康的新脑神经变质性疾病或艾滋病等受损靶细胞的丧失都与细胞凋亡的增加有密切联系【４３ｌ。李燕，李明远等人，通过诱导肝癌细胞凋亡的实验研究发现，细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡的过程。肿瘤的发生不仅与细胞的过度增殖有关，而且与细胞凋亡受抑制从而使已转化的细胞生存期限延长有关［４４１。细胞凋亡具有可诱导性。因此，诱导肿瘤细胞凋亡成为肿瘤治疗的一大热点。青蒿挥发油是一种新药，是来源于青蒿的一种新剂型。他们通过对数种凋亡指标的检测，发现经青蒿挥发油诱导ＳＭＭＣ．７７２１细胞后，肿瘤细胞贴壁能力降低，体积缩小，染色质浓缩或重新分布于核膜下呈圆形或新月形，并出现凋亡小体等凋亡形态学的改变；ＤＮＡ凝胶电泳出现凋亡所特有的梯状条带；流式细胞仪检测ＤＮＡ含量，出现亚Ｇｌ峰。实验表明青蒿油能诱导人肝癌细胞发生凋亡ｆ４５】。具有防癌及抗肿瘤作用。４．４护肝作用陈重阳在动物实验中发现，青蒿琥酯能对抗醋氨酚和黄磷所致肝脏还原型谷胱甘肽（ＧＳＨ）耗竭，其中，较大剂量尚能增加正常饥饿小鼠肝脏ＧＳＨ含量，提示其抗肝损伤作用可能与增加肝脏ＧＳＨ储备，促进对毒性代谢产物的解毒有关Ｉ“，－４７１。４．５其它生理活性作用青蒿除消炎解热，截疟，免疫，抗血吸虫，抗肿瘤等生理活性外，还具有其它的重要的生理活性。如青蒿琥酯对实验性、变应性、接触性皮炎（ＡｃＤ）有抑制作用１４８】；青篙素有降血压和平喘作用［４９１，另外，青篙乙醚提取中性草药部分０．５－７．１９／ｋｇ口服，对猫心率一般无明显影响，０．５－４．Ｏｇ／ｋｇ对血压和心电图亦无明显影响。离体兔心灌注试验表明，青蒿素可减慢心率，抑制心肌收缩力，降低冠脉流量。青蒿素口服及或静脉注射１００．１６０ｍｇ／ｋｇ，心率随剂量增加而逐渐减慢【５０】。说明还有一定的抗心律失常作用【５１１。蒿甲醚对艾滋病鹅口疮效果甚佳。另有报道，青蒿素类具有明显抗乌头碱作用，局部麻醉作用，作用强度稍大于普鲁卡因和利多卡因，作用方式与之相似等【５２１。所以，国内外很多机构和部门也已经逐渐认识到了这一点，并进一步研究其生理活性部位、药理作用及其作用机理是今后的主要研究方向和重点。５．青蒿的应用前景及展望５．１青蒿资源由于青蒿在我国分布广泛，资源丰富，同时又是传统的中草药。结合其良好的药用价值，今后的发展和应用前景将是非常好的。因为青蒿素治疗疟疾效果好，可使众多的疟疾患者有希望尽快痊愈，因此国内外市场上供不应求。目前青蒿的来源主要是野生资源和田间栽培。这也是青蒿素来源的最可靠的途径。同时许多国家正在试图通过生物技术的手段来解决青蒿素的生产问题。钟国跃等对黄花蒿的青蒿素含量与气候、土壤诸生态因子的相关性进行了研究１５３Ｊ。结果表明国内大部分地区青蒿素的含量普遍较高。而且适合栽培。目前，在青蒿原料的商品化过程中，用种子播种是最适用和经济的方法。青蒿种子在低温条件下至少可以保存３年，陈和荣等就我国不同地区的青蒿种子，不同播种期，不同生态型，植株不同部位的样品作过较为详细的比较，青蒿的产量明显不同，光照，施肥等外界条件都可以促进青蒿的生长，提高青蒿的产量。由于利用传统化学合成西药的方法来合成青蒿素具有很多缺点，现在人们在试图利用组织培养技术获得青蒿素，以便使疟疾流行地区的贫困人民解除疾病的痛苦。利用细胞培养技术生产青蒿有不破坏自然资源，不受自然条件的优点，还可能通过各种细胞及基因工程的手段获得高产青蒿素的新品种，常用的方法有：５．１．１组织器官培养：许多研究者已经成功地进行了青蒿愈伤和芽的离体培养繁殖，通过愈伤组织的诱导分化及青蒿素含量变化的研究，他们成功地进行了愈伤组织的诱导与植株的再生，并且测定了青蒿素的含量。此外，青蒿发根培养；青蒿牙培养，具有一定分化程度的组织培养的芽上生根对青蒿素的合成起到很重要的作用，结果发现青蒿发根及转基因丛生牙培养有较好的前景ｉ５４］。９５．１．２青蒿培养生物反应器；利用反应器生产青蒿素成功的研究，就是中国科学院的科学工作者利用新型雾化生物反应器培养青蒿发根和不定芽，他们为了充分利用反应器空间，减少营养液损失，降低染菌的机率，对原有的超声雾化反应器进行了改进，利用一种新型的内环流超声雾化生物反应器进行青蒿不定芽培养和发根培养生产青蒿素的初步研究，获得较好结果，由此可见，雾化反应器为青蒿不定芽生长提供了适宜的环境条件，从而促进了青蒿不定芽的快速生长和青蒿素的大量合成【５５１。５．１．３前体生物合成，应用幼苗水插法和项插法，在青蒿体内ａ（２．”．Ｃ）．ＭＶＡ为前体，成功地合成了青蒿酸，而青蒿酸适合成青蒿素的有用手性合成单体１５“。５．２生物和类似物的合成衍生物：近年来，美国ＪｏｈｎＨｏｐｋｉｎｓ大学、英国利物浦大学、越南河内药学院、科技大学、中国科学院药物所闻以及法国Ｃｈａｔｅｎａｙ－Ｍａｌａｂｒｙ药学院等陆续发表了数百个新的青蒿素衍生物，这些论文仍然保留青蒿素母核而进行局部修饰，但仍未找到比已上市的青蒿素衍生物抗疟作用更好的化合物，不过他们也发现了其他的活性，如用于肝病、艾滋病、免疫性疾病等等。类似物：陈阳等综述了青蒿素及其类似物的化学合成方法口…，其中提到Ｍｅｓｈｎｉｃｋ过氧化物型”的抗疟药，但据新药要求还有很大距离。５．３剂型研究复方和联合用药：中事医学科学院研制了蒿甲醚和苯芴醇复方，每片由苯芴醇ＳＲ等进行简化青蒿素结构，但保留过氧基团，得到了Ａｒｔｅｆｌｅｎｅ等化合物，据称是“第二代１２０ｒａｇ和蒿甲醚２０ｍｇ组成，以商品名ＣＯ．Ａｒｔｅｍ由诺华公司在德国上市；广州中医药大学热带病研究所研制的二氢青蒿素合哌喹复方，每片哌喹１６０ｍｇ和二氢青蒿素２０ｍｇ组成，已由国家药监局批准上市：ＷＨＯ在泰国用青蒿琥酯和甲氟奎联合应用，每天一次４ｍｇ／ｋｇ青蒿琥酯，连用三天，在第三天甲氟甲氟奎１５－２５ｍｇ／ｋｇ，经过５年联合用药的考察，确保了高治愈率；刘德全等用双氢青蒿素和咯萘啶伍用治疗抗性恶性疟３２例，三天疗法，结果：退热快，无性体原虫消失时间短，无明显药物反应【５９１。；王善青等用双青青蒿素１６０ｍｇ与磷酸萘酚喹４００ｍｇ配伍治疗恶性疟３７例，一次顿服，结果：仅ｌ例复燃，治愈率９７．３％，药物无明显不良反应【６０ｌ。青蒿琥酯栓剂：ＷＨＯ和热带病研究与培训规划署或同瑞士ｍｅｐｈａ制药厂制成青蒿琥酯直肠用软胶囊，商品名Ｒｅｔｏｃａｐｓ，每粒胶囊含青蒿琥酯５０ｍｇ获２００ｍｇ，成人三天总计量１２００ｒａｇ．１６００ｒａｇ，在泰国和缅甸的ｌ临床结果表明直肠胶囊的耐受性良好而且见效快，但需进一步优化剂量和方案【６”。青蒿琥酯贴片：侯海霞等将青蒿琥酯制成贴片，经测定；铁片中青蒿琥酯释放规律符合Ｈｉｇｕｃｈｉ方程，并达到特效性制剂的要求［６２１。５．４药理毒理作用机制：早期的机制研究观察到药物作用于疟原虫的膜系结构。后又发现血色素中含有二甲铁能催化分解药物的过氧基，生成氧化自由基，从而引起生化反应而导致原虫死亡。今年青蒿素类药物具有选择性烷化蛋白质的作用已被大量实验所证实，被认为１０是导致虫体死亡的重要原因。但此观察结果只是来源于红细胞膜蛋白质，还有待于疟原虫蛋白质的直接观察结果，因此有关青蒿素类药物的抗疟作用机制还有待深Ａｔ“】。关于神经毒性：尽管动物实验中已见青蒿素类药物有神经毒性，但目前还没有发现临床上该类药物对人有神经毒性。赵艳红等对青蒿素类药物神经毒性问题进行了综述：ＶａｍＶｕｇｆ等对７９例患者和经进行年龄与性别配对的７９名志愿者进行单盲法实验，未发现蒿甲醚和青蒿琥酯对患者有神经毒的任何证据１６４］。Ｐｄｃｅ等对４４３例对恶性疟有抗药性的复燃患者进行开放随机实验，比较青蒿琥酯和蒿乙醚的疗效和毒性，结果两者均高效、安全没有毒性。抗药性：陈颖丹等培育了伯氏疟原虫青蒿素抗性系，采用疟原虫转种传代和药物剂量递增发，在培养过程中，显示伯氏疟原虫对青蒿素产生抗性具有特殊性，不同于氯喹等抗疟药，伯氏疟原虫对青蒿素产生抗性过程缓慢，而当产生抗性达到一定水平时不再继续增强，反而减弱趋势。为中度抗性系【６”。抗孕作用：娄小娥等研究了青蒿琥酯对大鼠孕酮、雌二醇和蜕膜组织的影响，结果青蒿琥酯能使血清孕酮含量下降并损伤蜕膜和胎盘而是胚胎坏死，吸收而终止妊娠【响。临床：主要用于疟疾治疗：青蒿琥酯在马里治疗恶性疟３２１例，治愈率１００％；另有奎宁一雷锁率３２０例和氯喹３２０例做对照，奎宁一雷锁率组和氯喹组治愈率为９７．５％和６７．２％，认为：青蒿琥酯治疗恶性疟安全有效【６７１。５．５药用开发目前，田间栽培的青蒿依然是商业化青蒿素的唯一可靠来源，过去，青蒿素的主要来源是中国的野生青蒿，即使这样，我们国家还是收获了足够的原材料用于东南亚新型抗疟药的ｌ临床研究。由于对青蒿素的兴趣和应用越来越广，许多研究着眼于把药用青蒿驯化为一种可以栽培的作物。尝试把青蒿作为栽培作物并取得良好结果的国家有澳大利亚、比利时、印度、瑞士、美国和越南。因为青蒿是一种短日照植物，而且无性繁殖方法很简单，易于栽培，扩大资源。但国内外对青蒿的研究主要集中于青蒿素及其衍生物。而对青蒿中的挥发油研究较少，它的价值还没有得到充分利用。张海云、郭永来通过对青蒿籽油的组成分析研究中发现，青蒿全草提取挥发油可供化学工业及药用，种子油可食用亦可工业用【６引。青蒿挥发油的提取对当地野生资源的开发利用，具有一定的经济价值和社会效益，同时也给天然香料增添了一个新品种。青蒿挥发油具有药香、凉香的清爽气、香气浓郁透发，适用于男用化妆品，已可用于香皂、香水、空气清新剂等香精的调配。青蒿是我国宝贵的中药材，在许多领域都有待开发利用，今后重点应深入探讨青蒿各种药理活性、作用机理和动物模型等方面的问题，拓展其在医药保健、绿色食品开发和临床治疗领域的应用范围，为今后我国青蒿的生产及深加工和推广开发提供重要的理论基础。青蒿的产业开发方兴未艾，从目前全国产业基地建设调查结果来看，青蒿产业发展迅猛，已经成为许多地区的特色产品支柱产业，南方地区以大规模种植，北方滞后一些，但发展空间更广，开发潜能更大。第二章青蒿挥发油的提取及影响因素青蒿挥发油因提取方法的不同，组成成分及相对含量会出现很大差异。根据研究对象和目标的不同，提取挥发油可选用不同的提取方法和提取工艺。常用的提取方法有三种：有机溶剂萃取法、水蒸汽蒸馏法和超临界ｃ０２萃取法。各种方法各有所长，并在不断地加以改进和完善，而且各种方法相互之间可结合使用，提取时可根据不同需要选择适合的一种方法或几种方法相结合的实验方案。有机溶剂萃取法和水蒸汽蒸馏法是传统的提取方法，提取方法简单、好分离、生理活性较突出，但分离成分不够详细。陈飞龙、贺丰等人对不同方法提取的青蒿挥发油成分进行比较，发现结果有较大差异［叫。９０年代以后，超临界Ｃ０２萃取技术开始应用于天然产物的提取，是一种新的提取和分离技术。作为萃取剂的超临界流体可根据不同的提取对象而选取不同的气体。目前在食品、医药等工业领域最常用的萃取剂是二氧化碳。近几年开始运用到青蒿成分提取中来１７０】。本实验我们提取挥发油的主要目的是研究其生物活性成分的药用效果，要保证青蒿活性成分的保真性并尽可能地排除其它因素干扰，所以我们采用了水蒸汽蒸馏法。１．实验材料与仪器１．１实验材料青蒿：２００６年分别在５，６，７，８，９，１０月采自吉林省白城市郊区，取其天然野生的地上部分，置于阴凉干燥处阴干，粉碎备用。经东北师范大学生命科学学院植物学肖洪兴教授鉴定。１．２仪器挥发油提取器：上海亚荣生化仪器厂生产。２．主要试剂９５％７，醇（化学纯）；石油醚（３０—６００ｃ）３．实验方法为了开发利用青蒿野生资源，用常规蒸馏法，分别对不同蒸馏时间；不同加水量的青蒿，进行挥发油提取，试验的目的是为了探讨出青蒿挥发油提取的最佳工艺流程。然后利用提取最佳条件对不同生长期的青蒿挥发油进行提取，提取时，主要以青蒿的茎叶花果为原料，实验证明，叶子受热后会发生粘合，有阻碍蒸汽透入现象。所以选用水中蒸馏，使其原料直接与水接触，通过水渗作用，从植物体渗透，达到理想的出油量。青蒿挥发油的提取：将青蒿全草阴干，剪切成３－５ｃｍ碎段，置于挥发油提取器中，加水至药材面，加热煎煮，收集、分液、萃取得到的油层经无水硫酸钠脱水，得到淡黄色油脂即为青蒿挥发油。１２提取青蒿挥发油工艺流程投料一加水一蒸馏一冷却一油水分离一挥发油一包装储存一备用３．１不同蒸馏时间青蒿挥发油的提取将９，１０月采集的青蒿，阴干粉碎，称取２００９，加水１４００ｍｌ，蒸馏时间分别是：６０分钟；９０分钟：１２０分钟；１５０分钟；１８０分钟和２１０分钟。按提取工艺流程提取。观察结果并记录。３．２不同加水量青蒿挥发油的提取将９，１０月采集的青蒿，阴干粉碎，称取２００９，加水量分别是：１０００ｍｌ；１４００ｍｌ和２０００ｍｌ蒸馏时间１８０分钟，按提取工艺流程提取。各进行重复试验。观察结果并记录。３．３不同生长期青蒿挥发油的提取将不同生长期采集的青蒿，阴干粉碎，各称取２００９分别放入挥发油提取器中，加水１４００ｍｌ，蒸馏１８０分钟，按提取工艺流程提取。观察结果并记录。４．实验结果４．１不同蒸馏时间青蒿挥发油的提取结果投料量，加水量不变，改变蒸馏时间，分别蒸馏６０分钟、９０分钟、１２０分钟、１５０分钟、１８０分钟、２１０分钟，重复进行挥发油的提取，其结果如表２表２不同蒸馏时间的提取由表２可知，青蒿挥发油出油率的多少与蒸馏时间有很大的关系。蒸馏时间为６０、９０分钟时出油率明显低，蒸馏时间为１８０．２１０分钟时，出油率无显著差异，因此，由表看出蒸馏时间为１８０分钟为宜，与张海云报道的有点差异。４．２不同加水量青蒿挥发油的提取结果投料一定，蒸馏时间不变，加水量改变，挥发油出油率见表３表３不同加水量的提取由表３可看出，投料量为２００克时，加水量为５、１０倍时，挥发油的提取率都比较低，所以加水量以７倍左右为宜。与郭永来报到的相同。４．３不同生长期青蒿挥发油的提取结果利用上述提取最佳条件，在适宜投料量，加水量，蒸馏时间对不同生长期青蒿挥发油的提取结果见表４表４不同生长期的提取由表４可知青蒿挥发油的出油率随着生长期的不同而有显著差异，９—１０月果期出油率明显高于其它生长期，故应选择９．１０月份的青蒿进行挥发油的提取，是比较理想的时期。５．讨论通过上述实验表明，青蒿挥发油提取时，不同的外界因素，如青蒿的采集时间，提取过程中投料量、加水量、及蒸馏时间等对挥发油的提取都有很大的影响，多次的实验结果证明，青蒿挥发油提取的最佳条件是：挥发油提取工艺中最佳的加水量应为投料量的７倍左右，最佳蒸馏时间为１８０分钟最适宜。另外，青蒿采集时间最好在９—１０月之间，也就是青蒿的结果期。这时出油量最多。采用挥发油提取器提取青蒿挥发油时，在实验前期应做好各项准备，采集的实验材料在自然阴干的过程中，要适当的翻晒，避免材料发霉变质。另外在蒸馏时，开始火力应大，待有馏出液时活力要适当减小，并保持稳定，使蒸出来的油水汽得到充分冷凝。蒸馏快结束时，加大火力使附着在蒸馏器壁上的挥发油充分蒸出。蒸馏过程中，切不可压火或停火，否则会大大的降低挥发油的出油率。１４第三章青蒿挥发油抗菌活性的研究青蒿挥发油有多种生理活性，抗菌作用是其中的最重要生理活性之一。在我们的生活中，很多时候，因各种菌类微生物的存在而带来很多不便，比如饮食、食品保存、植物病虫害等方面，所以研究挥发油的抗菌作用具有重要意义。我们首先用常规蒸馏法提取出挥发油的样品，然后选用两种典型细菌和两种真菌菌株，对青蒿挥发油的抗菌作用进行了定性和定量研究，比较了其对不同菌种抑菌作用的差异，为进一步扩大青蒿挥发油抗菌作用的应用范围。及更深入研究其抗菌作用机理提供一定的科学依据。１．实验材料与仪器１．１实验材料试验菌种：细菌：大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｌ）、金黄色葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）真菌：高梁胶尾孢菌（ＧｌｏｅｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａｓｏｒｇｈＯ、茄链格孢菌（ＡｌｔｅｒｎａｒｉａＳｏｒａｕｅｒ）以上菌种均由东北师范大学生命科学学院实验室提供。１．２仪器ｓｏｌａｎｉ上海青浦沪西仪器厂生产的ＲＥ．５２型旋转蒸发器；ＹＸＱ．ＳＧ４１．２８０型手提式压力蒸汽灭菌器，上海医疗器械工业公司江阴医疗设备厂制造；电热恒温培养箱，型号ＰＹＸ．５０６５，上海跃进医疗器械一厂制造；ＶＯＲＴＥＸ．２ＧＥＮＩＥ型漩涡混合器；菌种培养所需的所有玻璃仪器（０．１Ｍｐａ，１２１ｏＣ灭菌２０ｍｉｎ）；微波炉；电子天平（岛津ＡＹ２２０）；超净工作台。打孔器２．主要试剂吐温８０（Ｔｗｅｅｎ－８０）：西安化学试剂厂生产、无水硫酸钠（均为分析纯）。培养基：细菌选择肉汤培养基，真菌采用马铃薯培养基。肉汤培养基：蛋白胨１０．Ｏｇ，牛肉高３．Ｏｇ，氯化钠（ＮａＣＩ）５．Ｏｇ，琼脂１８．Ｏｇ，蒸馏水１０００ｍｌ，ＰＨ７．０．７．４。马铃薯培养基（ＰＤＡ）：马铃薯（去皮切块）２００９，蔗糖２０．Ｏｇ，琼脂１８９，蒸馏水１０００ｍｌ，自然ＰＨ。３．实验方法‘３．１样品制备（青蒿挥发油的提取）取粉碎后的原料２００９置于５０００ｍｌ挥发油提取器中，加入１４００ｍｌ蒸馏水，按《中华人民共和国药典》２０００年版一部（附录ＸＤ）在最佳提取条件下提取挥发油…１，将所得挥发油加入适量无水硫酸钠脱水。４ｏＣ冰箱保存，供抗菌实验用。１５３．２菌种接种将保存菌种反复转种２次，使菌种新鲜，细菌置３０ｏＣ温箱培养１ｄ，真菌置２７ｏＣ温箱培养３ｄ，备抗菌实验用。３．３滤纸片法３．３．１药液制备提取的挥发油用无菌水依次稀释成浓度为４５、２２．５、１１．２５、５．６３、２．８１ｍｇ／ｍｌ，备用。３．３．２滤纸片的制备用打孔器将干净的滤纸制成直径为０．６ｃｍ的小圆纸片，干热灭菌后，备用。３．３．３菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水（约５ｍ１），接种环轻刮菌落，摇晃，置璇涡混合器混匀。３．３．４倒平板装有固体培养基的锥形瓶（已在微波炉中预热２ｍｉｎ左右至全部融化成液体，在超净台里将培养基倒入平板（直径９ｃｍ），每板约１５ｍｌ左右，水平放置，凝固后倒置放入３０ｏＣ温箱中，２ｄ后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新到平板。３．３．５涂布菌悬液在超净台里用移液器取０．ｉｍｌ菌悬液注入平板，放置５ｍｉｎ左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。３．３．６贴片在超净台里将平板划分６个或３区（本实验选平板中心为了进行生长率分析对比），用无菌水做对照组。每两张滤纸片（直径０．６ｃｍ）为一帖，用镊子夹着滤纸片在不同药液中轻轻粘一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固。３．３．７培养放入（倒置）培养箱中培养，细菌３０℃，真菌２７ｏＣ。细菌培养２４ｈ后观察结果，真菌７２ｈ后观察有无抑菌圈及抑菌活性。３．３．８数据分析利用上述观察结果参照菌丝生长法用直尺测量菌圈生长直径以无菌水做对照进行生长率的测定，计算公式：型麴琶鬃墓冀掣避Ｘ１００％对照组菌落直径…～３．４试管法根据滤纸片法所得的结果，参照文献采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（ＭＩＣ）。培养基以每管总体积５ｍ１分装于试管（１８ｍｍｘ１８０ｍｍ）中，在１２０℃、０．１Ｍｐａ条件下灭菌２０ｍｉｎ，当灭菌培养基冷却至５０ｏＣ左右时，无菌操作加入样品充分混匀，倍比稀释成２２．５、１１．２５、５．６３、２．８ｌ、１．４１、０．７０ｍｇ／ｍｌ系列浓度，无菌水做对照，１６分别制成斜面。取生长良好的受试菌划线接种于斜面上。细菌放于３００ｃ温箱中。于２４ｈ观察菌落生长状态。真菌放于２７℃温箱中，于７２ｈ后观察结果。设置重复组。目测并以下列标准记录：菌完全无生长“一”；菌生长迟缓，形成的菌落很小“＋”；菌生长比较快形成菌落较大“＋＋”；菌生长迅速但菌落比正常小“＋＋＋”；菌生长迅速与正常相同“＋＋＋＋”。取完全不生长管最低样品浓度为最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。４实验结果４．１滤纸片法测定结果４．１．１滤纸片法测定青蒿挥发油对２种细菌作用的结果见表５。表５滤纸片法测定细菌生长直径从表５种看出：上述不同浓度的青蒿挥发油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制作用。且随着浓度逐渐增大抑菌作用也随之加强。通过细菌生长直径及生长率对比分析青蒿挥发油对大肠杆菌的抑制作用高于对金黄色葡萄球菌的抑制，见图３、４。９２．００％９０．００％宕８鲫％；８∞％一誉一褂半州弘∞％８２．００％８０．００％２．８１５．６３１１．２５２２．５４５大肠杆菌药物浓度（ｍｇ／ｋｇ）图３不同浓度青蒿挥发油对大肠杆菌生长率影响１７９４．ＯＯ％９２．００％旨；∞％鹋∞％一邑料半刊％∞％８４．００％８２．００％｝＿。＿｜＿Ｉ＿金黄色葡萄球菌药物浓度（ｍｇ／ｋｇ）表６滤纸片法测定结果＿．４５图４不同浓度青蒿挥发油对金黄色葡萄球菌生长率影响４．１．２滤纸片法测定青蒿挥发油对２种真菌作用的结果见表６。从表６看出：上述不同浓度的青蒿挥发油对茄链格孢菌、高粱胶尾孢菌均有抑制作用。随着浓度逐渐增大抑菌作用也随之加强。通过细菌生长直径及生长率对比分析青蒿挥发油对茄链格孢菌的抑制作用高于对高梁胶尾孢菌的抑制，见图５、６。９２．００％９０．００％８８．ＯＯ％尊８６．００％糌脊８４．００％划８２．００％８０．ＯＯ％７８．００％２．８１５．６３１１．２５２２．５４５茄链格孢菌药物浓度（ｍｇ／ｋｇ）图５不同浓度青蒿挥发油对茄链格孢菌生长率影响９２．００％９０．００％一８８．Ｏｏ％誉母８６．００％业刊８４．００９６８２．ＯＯ％８０．００％２．８１５．６３１１．２５２２．５４５高粱胶尾孢菌药物浓度（ｍｇ／ｋｇ）图６不同浓度青蒿挥发油对高梁胶尾孢菌生长率影响４．２试管法测定结果根据滤纸片法所得的结果，用乳液对各受试菌种的样品进一步测定最低抑菌浓度（ＭＩＣ）。表７试管法测定结果表７表明：青蒿挥发油对大肠杆菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）为２．８１ｍｇ／ｍｌ；对金黄色葡萄球菌地最低抑菌浓度（ＭＩＣ）为５．６３ｍｇ／ｍｌ。表８试管法测定结果表８表明：青蒿挥发油对高粱胶尾孢菌、茄链格孢菌的最低抑菌浓度（ＭＩＣ）相同都为５．６３ｍｇ／ｍｌ。１９结论本文以青蒿为材料，采用水蒸汽蒸馏法萃取青蒿挥发油，研究了青蒿挥发油萃取的影响因素，通过实验得出最佳萃取条件及提取工艺流程，试验结果证明：蒸馏时，投料量一定时，加水量为投料量７倍时青蒿挥发油出油量最多，蒸馏时间为１８０分钟为宜。青蒿生长为果期时挥发油出油量高于其他生长期（即本地区９—１０月采集）。将提取的青蒿挥发油，采用纸片法分别对４种受试菌种进行抑菌试验，结果表明：青蒿挥发油对受试菌种均有明显的抑菌作用，相比之下，对大肠杆菌和茄链格孢菌的抑制作用更显著。在此基础上参照文献采用试管法对各受试菌种进行最低抑菌浓度测定（ＭＩＣ）。结果表明：大肠杆菌最低抑菌浓度（ＭＩＣ）为２．８１ｍｇ／ｍｌ；其余受试菌种最低抑菌浓度（ＭＩＣ）均为５．６３ｍｇ／ｍｌ。青蒿是传统的常用中草药。具有良好的药用价值。国内外对青蒿在治疗诸多疾病方面的研究都得以肯定，特别是抗疟疾方面得到了国际公认。因此，目前人们对青蒿的研究主要集中在青蒿素的研究。对青蒿挥发油的研究很少，鲜少有关青蒿挥发油抗菌活性的研究，尤其对农作物有害真菌活性的研究尚未报道。通过本实验结果进一步证实青蒿挥发油具有抑菌活性，尤其对植物真菌有抑菌活性的研究尚属首例。这对于深入开发和利用天然野生资源提供了科学依据。目前利用生物防治病虫害的方法，生产绿色食品己成为当今农业生产的发展趋势。长期以来，化学农药的滥用产生了一系列的公害问题，如环境污染、人畜中毒、破坏生态平衡等，因此从植物中探寻具有抗病性的活性物质具有十分重要的意义。青蒿是传统的常用中药，资源十分丰富，为此可以充分利用其丰富的资源，通过抑菌活性研究，并结合其它文献记载，认为青蒿挥发油可广泛应用于临床，如可做为外用涂剂治疗痤疮等皮肤疾病””…。因此，具有一定的开发价值，值得进一步研究。２０参考文献【１】Ｉ钟袼容．青蒿挥发油化学成分的研究【Ｊ】．中国通报，１９８３，８（６）：３・４．【２】李广勋主编．中药药理毒理与临床【Ｉ川．天津科技翻译出版公司．天津：１９９２，６６－６８．【３】青蒿结构研究协作组．一种新型的半萜内酯－青蒿素【Ｊ】科学通报，１９７７，２２：１４２一ｌ“．【４】杨小平．青蒿酯钠抗肿瘤作用研究叨．中国肿瘤ｌ临床，１９９５，Ｖ０１．２２增刊．【５】中医研究院．中药研究所药理研究室．青蒿的药理研究，新医药学杂志，１９７９，（１）：２３－２４．［６】中华人民共和国卫生部．中药新药临床研究指导原则，１９９７年第三辑：８９—９０．【７】青蒿研究协作组．抗疟新药晴好的研究们．要学通报，１９７９，１４（２）：４９—５０．【８］中医研究院．中药研究所药理研究室青蒿的药理研究阴新医药学杂志，１９７９，（１）；２３—２４．【９】葛发欢．超临界Ｃ０２萃取黄花蒿中挥发性成分的研究．中药材，１９９５，１８（１１）：５７０・５７２．【１０】彭洪．黄花蒿挥发油的成分研究．中药材，１９９６，１９（９）：４８－４９．【１１】董岩．刘洪玲．青蒿与黄花蒿挥发油化学成分对比研究．中药材第２７卷第８期２００４，８．【１２】舒贝．马行一．青蒿素及其衍生物的免疫调节作用．中国中西医结合肾病杂志２００５，６（３３）：１７７．［１３】赵生芳．张瑞琴．青蒿研究的现状．中国药师，２００３，６（１Ｉ）：７３３．７３５．［１４】屠坳坳．中药研究所药理研究室青蒿的药理研翘Ｊ】药理学报，１９８１，１６（５）：３６６－３６８．【１５］Ｃｈｏｕ．ＴＱ；ＦＹ；Ｋａｏ，Ｙ，ＳＪ，ＡＩＩｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４８，７０，１７６５—１７６６．［１６］Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｎｇ『１７１ＲｅｓｅａｒｃｈＧｒｏｕｐｆｏｒｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＡｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ．ＳｃｉｅｎｅｅＢｕｌｌｅｔｉｎ，１９７７，２２。１４２．１４５．Ｓｈａｎｇ［１８］ｈａｉｉｎｓｔｉｍｔｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｓｈａｎｇｈａｉ１４ｔ“ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｐｌａｎｔ．ＨｕａｘｕｅＸｕｅｂａｏ．１９１５，３３，２３－２５．【１９】Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｌ；Ｚｈｕ，Ｄ．Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｈ．Ｃ．Ｈｕａｎｇ，Ｂ．ｓ；Ｑｉｎ，Ｇ．Ｗ．Ｈｕａｘｕｅ２００３，１６（３）：１９２．Ｘｕｅｂａｏ，１９７８，３６，３５—３６．史保权．刘波．程义亮，等，青蒿素及其衍生物治疗疟疾的临床应用研究．中国寄生虫病防治杂志【２０】赵兵．王玉春．欧阳藩，等．生物合成青蒿素及其衍生物研究概况．中药材，１９９８：２１（１２）：【２１】ＬｅｆｅｒｅＧｅｔａｌ．ＡｍＪＴｒｏｐＭｅｄＨｙｇ．２０００：６２（３）：４０２－４０８．ｆ２２】ＰｏｓｎｅｒＧｈ，ＯｈＣＨ，ＷａｎｇＤ，ｅｔａ１．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ２ｂａｓｅｄｔｅｓｔｉｎｇｏｆｎｅｗ４２ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄｒｅｉｏｘａｎｅｓｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙｃａｒｂｏｎ２ｃｅｎｔｅｒｅｄｒａｄｉｃａｌｏｆａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｄｅｓｉｇｅｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄｉｎｔｏＶｉｔｒｏ．Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｏｆａｒｅｌａｔｅｄａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎ：ｔｈｅｉｍｐｏｒｔａｎｃｅａｃｔｉｖｉｔｙ【Ｊ】．ＪＭｅｄＣｈｅｍ，１９９４，３７：１２５６—１２６３．【２３】ＳｈｕｋｌａＫＬ，ＧｕｎｄＴＭ，ＭｅｓｈｎｉｅｋＳＲ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｏｄｅｌｉｎｇｓａｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｓ２ｈｅｍｉｎｉｎｔｒａｃｔｉｏｎ：ｄｏｃｋｉｎｇｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌａｇｅｎｔａｎｄｉｔｓｐｕｔａｔｉｖｅｒｅｃｅｐｔｏｒ［Ｊ】．ＪＭｏｌＧｒａｐｈ，１９９５，１３：２１５－２２１。［２４】ＣｈｏｕＡＣ，ＣｈｅｖｌｉＲＦｉｔｃｈＣＤ．ＦｅｒｒｉｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉａａＩＸｆｕｌｆｉｌｓｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ∞ｔｈｅｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅｒｅｃａｐｔｏｒｏｆｍａｌａｒｉａｐａｒａｓｉｔｅｓ［Ｊ】．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８０，１９０：１５４３—１５４９．［２５】Ｍｅｓｈｎｉｃｋ１）：３１．ＳＲ，ＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＨｙｇｉｅｎｅ，１９９４，８８（ｓｕｐｐｈ【２６】中医研究院．中药研究所药理研究室．青蒿的药理研究．新医药学杂志，１９７９；（１）；２３－２４．【２７］ＬｉＧＱ，Ｇｕｏｃｈｉｎａ，ＴｒａｎｓＲＸＢ，ＦｕＬＣ，ｅｔａｌ，ＣｌｉｎａｌｓＨｙｇｔｒｉａｌｓｏｆａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎａｎｄｉｔｓＤｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｉｎｔｒｅａｍｅｎｔｏｆｍａｌａｒｉａｉｎＳＯＣ，ＴｒａｐＭｙｏ．１９９４；８８（ｓｕｐｐｌ１）：５－７．【２８】符林春．王新华．郭兴伯，等，青蒿琥酯治疗脑型疟的临床疗效．广州中医药大学学报，１９９８；（１）２７－２９．２１【２９】韩铁．戴璨．艾叶挥发油抗病毒作用的初步研究．氨基酸和生物资源，２００５，２７（２）；１４．１６．１３０】薛雅琳．李静．青蒿籽油的组成分析研究．中国油脂，１９９７，２２“）：４２－４３【３ｌ】Ｄ．斯沃恩主编．秦洪万主译．贝雷：油脂化学与工艺学．第四版，北京：轻工业出版社，１９８９．【３２］油脂及其衍生物的标准分析方法，１９７９年版【３３】李锐．李连璞．青蒿琥酯钠对猴疟原虫超微结构的影响冲草药，１９８１；１２（４）：３１．３３．【３４】钱瑞生．青蒿的免疫作用和抗病毒作用［Ｊ】．中医杂志，１９９１；２２（６）：６３．６４．【３５】刘成伟，陈雅棠．李文桂，等．双氢青蒿素治疗实验大鼠卡氏肺孢子虫肺炎的疗效观察【Ｊ］．重庆医科大学学报。２００１；２６（３）：２６１．２６２．【３６】钟嘉熙髟胜权．中西医结合治疗系统性红斑狼疮２５例阴．中国中西医结合杂志，１９９９；１９（１）：４７－４８．【３７］ＥｌｌｉｓｄＳ，ｅｔａｌ，ＡｒｍＴｒｏＭｅｄ＆Ｐａｒａｓｉｔ０１．１９８５：２９（４）：３０７．３０９．【３８】赖镇源．青蒿挥发油抗座疮病原体及解热作用的实验研究广州中医药大学学报，２００５；５．【３９】ＸｉａｎＳＨ，ＹｏｕＪＱ，ＧｕｏＨＥｅｔａｌ，ＥｆｆｅｃｔｏｆａｒｔｅｍｅｔｈｅｒＯｎｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ａｄｅｎｏｓｉｎｅ仃ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｍｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｏｆＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍｊａｐｏｎｉｃｕｍｈａｒｂｏｒｅｄｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］，ＡｃｔａｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＳｉｎｉｃａ．１９９９，２０（８）：７５０－７５４．．［４０］［６３］严笠．甘绍伯．齐志群，等．双氢青蒿素治疗急性弓形虫感染小鼠疗效的进一步观察［Ｊ】．寄生虫与医学昆虫学报，２０００，７（２）：７０．．７２【４１】ＸｉａｏＳＨ，ＹｏｕＪＱ，ＧｕｏＨＦ，ｅｔａｌ，ＥｆｆｅｃｔｏｆａｒｔｅｍｅｔｈｅｒＯｉｌｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ，ｇｌｕｃｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｆｒｕｃｔｏｋｉｎａｓｅｏｆＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍｈａｒｂｏｒｅｄｉｎｍｉｃｅ［Ｊ］ＣｈｉｎＪＰａｒａｓｉｔｏｌＰａｒａｓｉｔＤｉｓ，１９９８，１６（１）：２５－２８．［４２】柳建发．汤治元．青蒿素蒿甲醚和青蒿琥酯康寄生虫的研究进展．地方病通报，２００４，１９（２）：９１。［４３】杨同书．细胞死亡研究进展，第三集．【４４］ＨｅｎｇａｒｔｎｅｒＭＯ，Ｔｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ．２０００；４０７（６８０５）：７７０．【４５】李燕．李明远．青蒿油诱导肝癌细胞凋亡的实验研究．四川大学学报，２００４；３５（３）：３３７．３３９．【４６】陈重阳．唐祖年．梁荣感．青蒿琥酯对正常及肝脏毒物中毒小鼠肝脏谷胱甘肽含量的影响［Ｊ】．中国药理学通报，１９９３，９（１）；５２．ｆ４７】王勤．李英．徐功立，等．青蒿琥酯抗肝癌作用的实验研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００１，２６（１０）：７０７．［４８】ＬｕｏＬ’ｄｉａｎｅＭ，ＷｉｌｌｉａｍｃｈｌｏｒｉｄｅｃｈａｎｎｅｌｂｌｏｃｋｅｒｓａｎｄＢＣ‘Ｂｌｏｃｋａｄｅｏｆｃａｌｃｉｕｍ・ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｃｈｌｏｒｉｄｅｃｕｒｒｅｎｔｉｎＸｅｎｏｐｕｓＯＯＣｙｔｅＳｂｙａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｄｒｕｇｓ，ＣｅｌｌｐｈｙｓｉｏｌＢｉｌｃｈｅｍ１９９１；１１（５－６）：２５１．Ｎｏｎｔｐｒａｓｅｒｔ，－Ａ；Ｐｕｋｒｔｔａｙａａｍｅｅ，一ｓ［Ｊ】［４９］ＳｔｕｄｉｅｓｏｆｔｈｅｎｅｍｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｏｒａｌａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｉｎｍｉｃｅＮｏｓｔｅｎ－ｂｅｅｒｔｒａｎｄ，Ｍａｍ—Ｊ－Ｔｒｏｐ－Ｈｙｇ．【５０］韩文素．周文琴．青篙琥酯钠对猴疟原虫作用的流氏细胞分析．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，１９９２，１０（３）：２０４－２０６．【５ｌ】李英．青篙素及其衍生物研究进展．国外医学・植物药分册，１９９９，１４（３）１０３．【５２】符林春．郭兴伯．青篙素及其衍生物治疗孕妇疟疾的随访观察．中医杂志，１９９８，２９（７）：１２．【５３】ＣｈｅｎＰＱ，ＹｕａｎＪ，ＤｕＱＹ，ｅｔａｌ—ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｈｙｄｒｏａｒｔｅｍｉｓｉｎｉｎｏｎｆｉｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｒｙｔｈｒｏｅｙｔｉｅｓｔａｇｅｓｏｆｐｌａｓｍｏｄｉｕｍｂｅｒｇｈｅｉＡＮＫＡｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．ＡｃｔａｐｈａｒｍａｃｏｌＳｉｎ，２０００，２１０）：２３４．【５４】叶彬．陈雅棠．刘成伟．双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫超微结构的影响［Ｊ】．中国人兽共患病杂志，２０００：１６（４）：２１．【５５】徐继红．章元沛．双氢青蒿素与青蒿琥酯的抗孕作用【Ｊ］．药学学报，１９９６；３１（９）：６５７．【５６】娄小娥．周慧君．青蒿琥酯对大鼠孕酮、雌二醇和蜕膜组织的影响［Ｊ】药学学报，２００１；３６（４）：２５４．【５７】陈征途．黄真炎．吴玲霓，等．青蒿素介导肝瘤细胞凋亡的实验研究［Ｊ】．中西医结合肝病杂志，２０００，１０（５）：２３．【５８】ＢｅｃＫｍａｎＡＣ，ＷｉｅｒｅｎｇｅＰＫ，ＷｏｅｒｄｅｎｂａｇＨＪ，ｅｔａ１．Ａｒｌｅｍｉｓｉｎｉｎｄｅｒｉｖｅｄｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ［ａｃｔｏｎｅｓａｓｐｏｔｅｎｔｉａｌａｎｔｉｔｕｍｏｎｒｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：ｃｙｔｏｔｏｘｉｃａｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄｔｕｍｏｕｒｃｅｌｌ［Ｊ】．ＰｌａｎｔａＭｅｄｉｃａ．１９９８，６４（７）：６１５．［５９］１６６］林培英．张丹．肖柳英，等．青蒿素、青蒿琥酯和蒿甲醚对抑制Ｔ细胞的作用明．广州医药，１９９８，２９（１）：３７１［６０］１６７］贺光照．黄崇本．张代录，等．青蒿素局部治疗增殖性瘢痕ｌ临床观测帆．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