【摘要】目的 研究共轭亚油酸对HepG2细胞中脂质沉积的阻碍。方式 以HepG2细胞为研究对象,以不同浓度CLA(10μmol·L-一、50μmol·L-一、100μmol·L-1)作用细胞24小时,采纳油红染色、RT-PCR等方式检测肝脏脂肪沉积、ACC mRNA表达,观看CLA对肝细胞内脂质沉积的阻碍。结果 CLA增加HepG2细胞中脂质沉积,50μmol·L-1CLA组细胞中红染脂滴与对照组相较明显增多;CLA使HepG2细胞培育液中游离脂肪酸降低,50μmol·L-1组的培育液中游离脂肪酸与对照组相较含量降低了50%(P< );CLA增加HepG2细胞ACC mRNA的表达,ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而增高。结论 CLA可增加HepG2细胞的脂肪沉积;其机制可能与CLA能够改变肝细胞中ACC的表达有关。
【关键词】共轭亚油酸 (CLA) HepG2细胞 脂肪代谢 ACC 共轭亚油酸(conjugated linoleic acids,CLA)是由一组具有共轭不饱和双键的亚油酸的异构体组成的混合物。1987年Michael Pariza研究小组分离出CLA,能够抑制化学诱导的皮肤肿瘤形成[1]。CLA有减轻肥胖、抗肿瘤、避免动脉粥样硬化、提高机体免疫力、增加骨密度、增进生长等多种生理功能。可是一些研究发觉,CLA在减少体内脂肪的同时,可能显现肝脏脂肪代谢障碍,显现肝脏脂肪沉积的现象,其确切的分子机制尚不明确[2]。本实验确实是研究CLA对肝脏细胞脂肪堆积的阻碍。
1 材料
HepG2细胞
第四军医大学营养与食物卫生学教研室惠赠。 要紧试剂
高糖DMEM培育基,Gibco公司;新生小牛血清,杭州四季青;胰蛋白酶,Wolsen公司,四甲基偶氮噻唑兰(MTT),Amresco公司;油红O-0625,Sigma公司,共轭亚油酸(CLA),Sigma公司;游离脂肪酸测试盒南京建成科技;TRIZOL,Invitrogen公司;反转录试剂盒Fermentas公司葡萄糖试剂盒,上海复星公司。
要紧仪器与设备
NU-2500E型CO2孵箱,倒置相差显微镜,YI-875SA医用超净工作台,酶联免疫检测仪,MyCycler thermal cycle,凝胶成像仪等。
引物
引物由奥达公司合成,其中ACC引物为:5’-TGATGTCAATCTCCCTGCAGC-3’;5’- TTGCCTCTTCTCTGTTTTCTCCCC-3’。
β-ACTIN
引物为:5’-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3;5’
-CAGGGTACATGGTGGTGCC-3’。
2 实验方式 细胞培育
HepG2细胞置于含10%新生小牛血清的高糖DMEM培育液中,含有100 IU/ml 青霉素,100μg/ml链霉素,37℃、5%CO二、饱和湿度的恒温孵箱条件下培育,用胰蛋白酶消化液消化。
油红O染色观看HepG2细胞脂质沉积
将HepG2细胞接种于放有干净盖玻片的6孔板内,37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培育。待细胞长至80%满时,吸弃培育液,加入不同浓度CLA作用24小时后,终止培育;弃培育液,每孔加入1ml10%的甲醛溶液室温孵育5分钟。除去甲醛溶液,加入一样体积的10%甲醛室温孵育1小时,用锡纸包封好幸免干燥;除去甲醛溶液,60%的异丙醇冲洗,完全干燥;加入油红O工作液放置10分钟,除去油红O当即用蒸馏水冲洗4次,晾干后在倒置显微镜下观看。
染色法测定培育液中的游离脂肪酸
将HepG2细胞以每孔5×104个细胞接种于24孔培育板内,37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培育。待细胞长至80%满时,吸弃培育液,将实验组分为1%血清的DMEM培育液空白对照组(无细胞),正常细胞对照组(含1%血清的DMEM培育液)、CLA干与组(浓度为0、10、50、100μmol·L-1),每组设3孔并列,孵箱中培育24小时后吸弃培育液,CLA干与组每孔加入1ml 100nmol·L-1的胰岛素溶液作用1小时后,依照试剂盒说明书方式,采纳比色法测定培育液中游离脂肪酸的转变,同时24孔板内细胞胰酶消化后细胞计数板计数。
胞总RNA的提取
用TRIZOL试剂按操作说明书提取,提取的RNA用约25μL DEPC 处置水溶解。
RNA纯度鉴定
取RNA5μL,稀释100倍后用紫外分光光度计测定其OD260和OD280值,并计算OD260/OD280值及RNA浓度。
cDNA的合成
(1)以提取的总RNA3μg为模板,cDNA合成反映体系为12μL,包括:提取的总RNA模板3μg,Primer Oligo(dT)5μL,RNase,用DEPC水补至12μL。3-5sec离心混匀,65℃加热5min后置于冰浴中。
(2)逆转录反映 反映体系包括:5×RTbuffer 4μL;RNase Inhibitor 1μL;10mMdNTPmix 2μL;Rever Tra Ace 1μL;补水到20μL。3-5sec离心混匀,37℃孵育5min后冰浴。
(3)加入M-MuLV反转录酶1μL,整体积为20μL。离心混匀,3-5s,42℃孵育60min。
(4)70℃加热10min以终止反映。合成的cDNA保留于-20℃或用于扩增。
PCR反映体系
10×Reaction Buffer 5μL;10mM dNTPs 1μL;Primer1(P1)和 Primer2(P2) 各20pmol;cDNA 2μL;KOD-Plus 1μL; H2O 33μL,整体积为50μL。
PCR扩增条件为: 解链95℃,60s;聚合55℃,60s;延伸72℃,45s,共30个循环。
琼脂糖凝胶电泳及图像处置
取各组肝细胞RT-PCR产物10μL及DNAMarker(TAKARA),在1%琼脂糖中进行凝胶电泳,电泳结果用GeneFlash成像系统(SynGene,USA)搜集染色条带后转入运算机,并用GeneSnap图像分析软件分析
各条带。结果以图像扫描的像素值表示。
统计学处置
实验数据用x-±s表示,组间不同比较用统计软件进行方差分析,以P<为显著性不同水准。
3 实验结果 实验结果一
CLA对HepG2细胞脂质沉积的阻碍
如图1所示,与对照组相较较,CLA作用24小时后50μmol·L-1和100μmol·L-1 CLA组细胞中红染脂滴明显增多。提示肝细胞脂质沉积可能随着CLA作用浓度提高而增加。
图1 CLA作用后HepG2肝细胞中脂质沉积。油红O染色,倒置显微镜观看。(×200)
(a:正常细胞;b:正常细胞+胰岛素;c:10μmol·L-1 CLA;d:50μmol·L-1CLA;e:100μmol·L-1 CLA)
CLA对HepG2细胞培育液中游离脂肪酸含量的阻碍
由表1可见,不同浓度CLA干与HepG2细胞24小时,胰岛素溶液干与1小时后,与0μmol·L-1 CLA相较,50μmol·L-一、100μmol·L-1 CLA组的培育液中游离脂肪酸的含量别离降低了25%、50%,有显著性不同(P<),提示CLA干与可能增进了细胞对培育液中游离脂肪酸的吸收。DMEM培育液对照组为无细胞空白对照组。
表1 CLA对HepG2细胞对培育液中游离脂肪酸的阻碍 (x-±s)
实验结果二
CLA作用增加ACC mRNA表达
从图2能够看出,与对照组相较,ACC mRNA表达水平随CLA浓度增加而慢慢增高。相关于胰岛素单独作用组,50 μmol·L-1 CLA+胰岛素组和100 μmol·L-1 CLA,ACC的mRNA表达水平增精湛显,别离增加了倍、倍(n = 5,P<),而10μmol·L-1 CLA。同时胰岛素单独作用组与对照组相较增加了倍(n=5,P<)。提示胰岛素单独作用能够增加ACC mRNA的表达,而CLA作用能够增进ACC mRNA的表达进一步升高,并具有浓度依托效应。
图2:RT-PCR方式检测CLA作用后肝细胞中ACC mRAN的表达 (1:正常细胞;2:正常细胞+胰岛素;3:10μmol·L-1 CLA:50μ CLA;5:100μ CLA)
注:*与对照组比较 P<;#与胰岛素组比较 P< 4 讨论
CLA的作用能够减少机体肌肉组织脂肪蓄积,其通过增加机体线粒体中脂肪酸β-氧化进程而阻碍机体内脂质的沉积,脂肪酸β-氧化中的关键酶肉毒碱棕榈酰基转移酶1(carnitine palmitoyl-CoA transferase 1,CPT1)在CLA作用下明显增加,致使肌肉组织中脂肪氧化分解代谢增强,脂肪蓄积减少。有结果显示,CLA作用肝脏致使脂肪堆积,可能是由于脂肪合成增多而分解代谢减少引发的,乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是肝脏脂肪合成中的关键酶,是长链脂肪酸的生物合
成中限速酶,要紧调剂脂肪酸的合成,ACC催化乙酰辅酶A形成丙二酸单酰辅酶A,是脂肪酸合成和代谢中起重要作用的中间代谢物[3],骨骼肌心脏和肝脏中脂肪酸的氧化[4]。因此推测CLA致使肝脏中脂肪沉积可能是增加ACC增多,脂肪合成增多,同时增加丙二酰CoA,从而抑制了线粒体CPT1的活性及脂肪酸β-氧化进程,脂肪分解减少致使脂肪在肝细胞蓄积。
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在脂肪酸的代谢进程中起着重要作用。ACC包括乙酰辅酶A 羧化酶1- ACC1(ACCα)和乙酰辅酶A 羧化酶2- ACC2(ACCβ)两种形式,被不同的基因编码。ACCβ要紧在β-氧化作为要紧能量来源的骨骼肌和心脏中表达[5]。ACC活性受到别构效应物和磷酸化的调剂[6]。
实验中通过检测细胞内ACCmRNA的表达,发觉随着CLA的剂量增高,ACCmRNA表达慢慢增高,ACC表达增高,进一步致使丙二酰CoA增加,细胞内CPT1的活性受到抑制,细胞脂肪合成增加而分解减少,CLA干与后的培育液中游离脂肪酸减少,提示更多的脂肪酸知足细胞脂肪合成的需要,同时脂肪分解减少,引发肝脏脂肪沉积。但其机制还不甚明确,需要进一步实验证明。
参 考 文 献
[1]Pariza MW,Ashoor SH,Chu FS,Lund DB: Effects of temperature and time on mutagen formation in pan-fried hamburger. Cancer Lett 1979,7:63-69.
[2]Takahashi Y,Kushiro M,Shinohara K, Ide T: Activity and
mRNA levels of enzymes involved in hepatic fatty acid synthesis and oxidation in mice fed conjugated linoleic acid. Biochim Biophys Acta 2003, 1631:265-273.
[3]Ha YL,Grimm NK,Pariza MW: Anticarcinogens from fried ground beef: heat-altered derivatives of linoleic acid. Carcinogenesis 1987,8:1881-1887.
[4]Degrace P,Demizieux L,Gresti J,Chardigny JM,Sebedio JL,Clouet P: Hepatic steatosis is not due to impaired fatty acid oxidation capacities in C57BL/6J mice fed the conjugated trans-10,cis-12-isomer of linoleic acid. J Nutr 2004,134:861-867.
[5]McGarry JD,Foster DW: Regulation of hepatic fatty acid oxidation and ketone body production. Annu Rev Biochem 1980,49:395-420.
[6]Tong L: Acetyl-coenzyme A carboxylase: crucial metabolic enzyme and attractive target for drug discovery. Cell Mol Life Sci 2005,62:1784-1803.
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