生物学教学２０１３年（第３８卷）第４期 ・６５・ 重叠延伸ＰＣＲ技术及其在生物学中的应用 李守宇 （江苏省宜兴第一中学２１４２０６） 摘要重叠延伸ＰＣＲ技术是一种通过寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板，通过多次ＰＣＲ扩增，从而获得目的 ＤＮＡ基因片段的方法。该技术高效、快捷、经济，在基因功能研究方面显示良好的应用前景。 关键词重叠延伸ＰＣＲ技术片段基因合成融合基因构建基因定点诱变 聚合酶链式反应（ＰＣＲ）是一种在体外模拟发生于 １．１ 引物设计 重叠互补引物的设计是重叠延伸 细胞内的ＤＮＡ快速扩增特定基因或ＤＮＡ序列的复制 ＰＣＲ技术成功的关键。相连引物间的重叠区域以１５ 过程的技术。此项技术在现代分子生物学领域具有非 —２０个碱基为宜，重叠区域中应尽量避免富含ＡＴ 常重要的地位，因其具有简易、高效、快速、易于操作等 （ＡＴＩＴＡ，ＡＡＴ从、从ｒＩｆＩ＇ＡＡ等）的序列，因为在片段 优点已经成为许多实验的基础。并且近年来衍生出了 合成过程中，接头区富含ＡＴ的区域极易发生错配。 多种ＰＣＲ方法，其中重叠延伸ＰＣＲ技术就是一项新型 同时，在引物设计中，除了需要考虑一般ＰＣＲ引物设 的ＰＣＲ方法，在长片段基因的合成、融合基因的构建 计的问题外，在Ｔｍ值的控制方面，设计的全部引物最 和基因的定点突变等方面有其广泛而独特的应用Ｏ 好有相同或相近的Ｔｍ值，以便扩增步骤的顺利进行， １重叠延伸ＰＣＲ技术简介 否则可能会导致引物无法组合使用，这是引物设计的 重叠延伸ＰＣＲ技术（ＳＯＥ ＰＣＲ）是采用具有互补 关键，并且尽量避免出现二级结构及引物二聚体 末端的引物，使ＰＣＲ产物形成了重叠链，从而在随后 等［ ］。 的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增 １．２ Ｔａｑ酶选择为了最大限度地避免碱基的错配， 片段重叠拼接起来的技术。 重叠延伸ＰＣＲ反应应避免使用普通Ｔａｑ酶，因为Ｔａｑ 出菇时间多聚集在４月下旬一５月中旬，春雨过后或 ６新疆木耳蘑菇的价值 经冰山雪水浸润之地，气温多在ｌ５℃一２１℃。此时，胡 新疆木耳蘑菇一年一发生，出菇期短而迅速，到６ 杨林地、新疆杨、怪柳灌木丛附近，木耳蘑菇会大量出 月上旬几乎再找不到其踪迹，是欧亚大陆腹地干旱气候 菇，有单生、散生或群生，数量较密集。在离林地较远 区形成的独特耐旱型野生食用菌，并能在较宽的温度范 的地面草丛中也有稀稀疏疏、零零星星蘑菇破土而出， 围内生长，并对极端高温有较强的耐受性。木耳蘑菇发 可能为泛洪期孢子被洪水输送而来导致的出菇。 生地土壤全盐量和ｐＨ较高，说明其对盐碱环境有极强 ５新疆木耳蘑菇的营养成分 的抗逆能力。其具有的综合抗逆能力是在特殊生态环 研究人员通过对新疆木耳蘑菇的化学成分分析 境下长期发育进化形成的，对其抗逆机理及其生物特性 后，发现该菌子实体中含有ｌ８种氨基酸，菌盖、菌柄氨 进行系统研究有助于揭开新的生物抗逆机制。 基酸含量（ｒ／ｋｇ）分别是１９．４６和ｌ３．１４；８种必需氨基 新疆木耳蘑菇至今仍不能人工驯化和培育，由于 酸含量分别是９．２６和２．４１；饱和脂肪酸有粗脂肪、棕 其肉质鲜美、营养丰富。每年收获季节，人为过度采收 榈酸、硬脂酸、棕榈油酸、花生四烯酸，在菌盖和菌柄含 现象较严重，其野生生长环境已经受到破坏，近年来产 量（ｇ／１００ｇ）达到ｌ３．４４和１３．１１；不饱和脂肪酸有油 量也不断下降。然而菇价却连年飙升，已达７００元／ｋｇ 酸、亚油酸、亚麻酸，含量在茵盖和菌病占８６．５６和８６． 干菇，亟待采取保护和合理开发利用为目的的科学研 ２６；蛋白质含量在菌盖和菌柄中（ｇ／１００ｇ）分别为ｌ９． 究，既为保护环境做贡献，尤为当地农牧民增收创收提 ０６和１５．７６；矿质元素含量丰富，Ｚｎ含量为８２３ｍｇ／ｋｇ， 供出路。 多糖含量１１．３３％ Ｊ。此外，还含有甙类、有机酸、皂 甙、内酯、香豆素、生物碱、甾醇及三萜、挥发油、强心苷 主要参考文献 等化学成分［ 。新疆木耳蘑菇不但具有较高的营养 ［１］卯晓岚．１９９１．中国大型真菌．郑州：河南科学技术出版社，６０４ 价值，科学研究表明，食用该菌还可以提高人体免疫 ［２］朱铭莪，薛泉红，和文祥，等．１９９９．巴楚蘑菇研究Ｉ营养成分．西 力、促进大脑发育，防止脑动脉硬化，促进肾上腺皮质 北农林学报，８（３）：７７—８０ 激素分泌，增强人体应激能力，以及溶血栓、降血压、降 ［３］王俊燕．２００７．新疆的珍贵食用菌——白柄马鞍菌．食用菌，（２）： ７ 低胆固醇等多种保健作用。其营养价值远高于同一盘 ［４］曾红，周忠波，胡建伟，等．２００７．裂盖马鞍菌化学成分初步研 菌目的羊肚菌。 究．塔里木大学学报，１９（４）：３３～３７ －６６・ 生物学教学２０１３年（第３８卷）第４期 达的调控机理，研究蛋白质结构与功能间的关系，改造 酶会在ＰＣＲ产物末端加Ａ，从而可能会使产物移码突 变。一般采用高保真ＤＮＡ聚合酶（Ｐｆｕ）。高保真ＤＮＡ 聚合酶不仅具有一般Ｔａｑ酶５ 一３ 聚合酶的活性，还 具有３ 一５ 核酸外切酶活性 ｊ。可有效地校正扩增 产物末端的错配碱基，保证嵌合序列的正确性。 １．３热循环条件对于重叠延伸ＰＣＲ反应，循环不 宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。高温 会使ＤＮＡ受到损伤，造成ＤＮＡ酶终止合成。考虑到 天然蛋白质，使之更符合应用需求 ３。重叠延伸ＰＣＲ 技术可以在ＤＮＡ片段的任意部位产生定位突变。它 在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补 引物（如引物ｂ和引物ｃ），然后分别与５ 引物和３ 引 物（引物ａ和引物ｄ）作ＰＣＲ，这样得到的两个ＰＣＲ产 物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重 组ＰＣＲ就能得到诱变的ＰＣＲ产物（图２）。任何基因， 只要两端及需要变异的部位的序列已知，就可用ＰＣＲ ＤＮＡ聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环 数控制在２０—２５个为宜【 。循环次数过多，碱基错 配的几率增大；循环次数太少，则得不到足够的拷贝数 进行下一轮反应。反应的退火温度也要根据引物而 定，在保证产物扩增效率的前提下，应尽量提高退火温 度以提高产物的特异性，为下一轮ＰＣＲ反应提供高质 量的模板，从而降低反应的错配率。 ２重叠延伸ＰＣＲ技术应用 ２．１ 利用重叠延伸ＰＣＲ技术扩增长片段ＤＮＡ采用 一段已知的５００—６００ ｂｐ碱基的ＤＮＡ片段为ＰＣＲ模 板，根据所要合成的ＤＮＡ序列可以设计一系列的ＰＣＲ 嵌合引物对（即碱基互补配对），长度为５０～６Ｏ ｂｐ，且 从５ 到３ 方向顺序重叠，重叠碱基数目为２５～３０ ｂｐ， 通过多重ＰＣＲ全部引物叠加所得到的ＤＮＡ正是自己 所要合成的长片段ＤＮＡ。 ２．２利用重叠延伸ＰＣＲ技术构建融合基因 以融合 Ａ和Ｂ两基因为例，Ａ、Ｂ两基因可以相同也可以不同， 先分别用ａｌ、ｃｌ和ａ２、ｃ２两对引物扩增出Ａ基因和 ℃ Ｒ ２ Ｂ基因，然后再用ａ１和ｃ２将两基因连接起来，得到 Ａ、Ｂ的融合基因【 。也可以设计多对引物，融合多个 基因。重叠延伸ＰＣＲ可将任意的两个目的基因拼接 连接，中间无任何目的基因以外的其他ＤＮＡ序列，这 样就可避免因加入连接序列可能出现的表达蛋白质的 功能异常（图１）。 ａ ｌ ａ２ —・—■－ ———■－－ ［卫函 ■臣西Ⅲ ‘ 基因Ａ■＿基因Ｂ 图１ 重叠延伸ＰＣＲ技术构建融合基因流程 ２．３利用重叠延伸ＰＣＲ技术进行基因定点诱变基 因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可 以有目的地改变ＤＮＡ序列中的碱基，从而阐明基因表 诱变去改造基因的序列。方法简便易行，结果准确、高 效，因此已成为最常用的定位诱变方法。 引物ａ 引物ｃ －．． ＿＿● ＰＣＲ１ｌ 产物ＡＢ ＋ Ｉ重叠延伸 ’ 突变产物ＡＤ 图２重叠延伸ＰＣＲ技术介导靶ＤＮＡ单位点 定向突变流程（其中为・突变位点） ３重叠延伸ＰＣＲ技术展望 同常规ＰＣＲ相比，重叠延伸ＰＣＲ技术无疑具有 更广阔的应用前景。经过十几年不断的实践与总结， 重叠延伸ＰＣＲ方法的体系已日趋成熟，成为分子生物 学研究中的常用方法。重叠延伸ＰＣＲ已在许多研究 领域发挥重要作用。 但是，作为一种没有标准化反应条件的技术体系， 重叠延伸ＰＣＲ技术在应用过程中还存在很多问题需 要解决，例如最合适的引物长度、最佳连续延伸的循环 数等。这些问题还需要进行系统的研究，才能为该技 术的应用提供更有力的理论支持。 主要参考文献 ［１］魏薇，李凡，陈海如．２００８．利用重叠延伸ＰＣＲ技术扩增长 片段ＤＮＡ．云南大学学报（自然科学版），３０（１）：８６—８８ ［２］杨宇，吴元华，郑雅楠．２００６．利用重叠延伸ＰＣＲ技术进行 ＤＮＡ的人工合成．安徽农业科学，３４（９）：１８１０～１８１１ ［３］徐芳，姚泉洪，熊爱生，等．２００６．重叠延伸ＰＣＲ技术及其在基 因工程上的应用．分子植物育种，４（５）：７４７—７５０ ［４］戴灿，苗聪秀，卢光瑗．２０１０．基于重叠延伸ＰＣＲ法的定点突变 技术．现代生物医学进展，１Ｏ（３）：４１１
