龙葵多糖提取、含量测定及组分分析王帅帅１２季宇彬１２，汲晨锋１２（１．哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站，黑龙江，哈尔滨１５００７６；２．哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，黑龙江，哈尔滨１５００７６）摘要：从龙葵鲜果的水提取液中分离出水溶性成分即龙葵多糖，并对其进行含量测定和组分分析。采用分光光度法测定多糖含量，高效毛细管电泳法分析多糖组分。电泳条件：缓冲液：７５ｍｍｏｌ／Ｌ硼砂溶液（ｐＨ１０．５）。柱温：２５。Ｃ，柱压：２０ｋＶ，检测波长：２４０ｈｍ。经处理后粗多糖提取率为１３．５％：经分光光度法测定粗多糖含量为３９．１５％，精制后多糖含量为６５．２８％；运用高效毛细管电泳法分析，证明龙葵多糖由Ｌ（＋）一鼠李糖、Ｄ一木糖、Ｄ一葡萄糖、Ｄ一甘露糖、Ｄ一（一）阿拉伯糖、Ｄ一半乳糖组成，其含量百分比为２．５６：２．２８：１：７．０２：４．ｉｉ：７．０４。所采用的方法均具有简便、灵敏、干扰少的特点，是实验中的理想方法。关键词：龙葵；多糖；提取Ｅｘｔｒａｃｆｉｏｒｎ、ｃｏ皿蚀叻Ｅ皿ｅｎｅ册丑ｎ壶皿ａ蚰。助ａ皿皿ｃｏ．ｐｏｔｅｎｔａ蚰ａⅡｙｓｉｓｏ质ｐｏⅡｙｓａｃｃ皿丑ａ而皿ｅ碍如丑ⅡⅡＳｄａｎｕｍＮｉｇｍｍＬＷａｎｇ（１．Ｒｅｓｅａｒｃｈ２．ＰｏｓｔｄｏｃｔａｌｃｅｎｔｅｒｏｎＳｈｕａｉ—Ｓｈｕａｉｌ２，ＪｉＹｕ—Ｂｉｎｌ２，ＪｉＣｈｅｎ．Ｆｅｎ９１２ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｃｉｅｎｃｅｏｆＨａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｃｏｍｍｅｒｃｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００７６，Ｃｈｉｎａ；ＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈｏｆｔｈｅｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａｏｆＨａｒｂｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆｃｏｍｍｅｒｃｅ，ＨｅｌｏｎｇｊｉａｎｇＨａｒｂｉｎ１５００７６，Ｃｈｉｎａ）ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ａｗａｔｅｒ－ｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｂｙｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｆｒｏｍｔｈｅａｑｕｅｏｕｓｃｏｎｔｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｏｆＳｏｌａｎｕｍＮｉｇｒｕｍＬ．ｆｒｕｉｔｓａｎｄｉｔｗａｓａａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈｅｍｉｃａｌ，ａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｎｄａｎａｌｙｓｉｓａｓｏｆｃｏｍｐｏｎｅｎｔ．ＵｓｉｎｇＵＶａｎｄＨＰＣＥｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｃｏｎｔｅｎｔａｎｄｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｔｆｏｌｌｏｗｉｎｇ：ｂｕｆｆｅｒ：７５ｍｍｏｌ／ＬＮａ２８４０５（ｐＨ１０．５），ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：２５＂Ｃ，ｖｏｌｔａｇｅ：２０ｋＶ，ＵＶｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｓ１３．５％：Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔ２４０ｎｍ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｉｏｏｆｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｗｈｉｃｈｔｈｒｏｕｇｈ蛐既ｏｆｔｈｅｏｆｃｒｕｄｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＷａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＩＲｉｓ３９．１５％，Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｈｉｇｈｌｙｆｉｎｉｓｈｅｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｉｓ６５．２８％；ＨｉｇｈＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＨＰＣＥ）ａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｔｉｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＬ（＋）一ｒｈａｍｎｏｓｅ，Ｄ・ｘｙｌｏｓｅ，Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｄ—ｍａｎｎｉｔｏｌ，Ｄ一（一）ａｒａｂｉｎｏｓｅａｎｄＤ・ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅａｎｄｔｈｅｉｒｃｏｎｔｅｎｔｒａｔｉｏｉｓ２．５６：２．２８：１：７．０２：４．１１：７．０４．Ａｂｏｖｅａｌｌｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｓｉｍｐｌｅ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ａｎｄｔｈｅｓｅｗｅｒｅｇｏｏｄｍｅｔｈｏｄｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ＳｏｌａｎｕｍＮｉｇｍｍＬ．；Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ龙葵（ＳｏｌａｒｉｕｍＮｉｇｒｕｍＬ．）属茄科植物，其性寒昧苦，具有清热解毒，活血消肿，治疗疮、痈、肿、丹毒、跌打损伤、慢性气管炎、急性肾炎等功效。龙葵是一味传统的中草药，在近些年的医疗实践中发现，龙葵全草在治疗子宫绒毛膜癌、卵巢癌和肝癌等效果显著ｕ’。癌症是严重威胁人类生命的第二号杀手，寻找有效的抗癌物质一直是医药和化学工作者感兴趣的课题。在医药上，多糖的研究已给近代肿瘤化疗开辟了新方向。目前世界各国，尤其是日本、美国正在进行大量的深入研究。七十年代以来，我国在云芝多糖、银耳多糖、刺五加多糖、竹黄多糖和黄芪多糖等的研究中已展现出可喜的前景，近二十年来多糖的研究表明，多糖能用来治疗肝炎、风湿痛、癌症、艾滋病昭’３１等疾病。龙葵抗肿瘤的有效成分可能为水溶性物质，多年来工作者们从脂溶性成分中分离出龙葵碱，并且从水溶性成分中分离出两种龙葵多糖Ｈ。。最近，我们从龙葵水溶性提取液含８０％乙醇溶液中又分离出一棕色粘稠物，经初步鉴定为龙葵多糖类。本文主要研究龙葵多糖的提取、分离、纯化、糖含量测定及其组分的分析，具体操作和结果如下。１材料与仪器基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０４００５９１，３０３００２８４）；黑龙江省自然科学基金资助项Ｈ（Ｄ００２４－－１３）；哈尔滨市青年科学基金资助项目（２００４ＡＦＱＸＪ０３５）．作者简介：季字彬（１９５６．８．），男，博士，教授，博士生导师，研究方向：抗肿瘤药物研究．２０８１．１龙葵１．２试剂哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心采集并提供。９５％乙醇、无水乙醇、丙酮、石油醚、葡萄糖、苯酚、无水甲醇（天津福晨化学试剂厂）、三氯甲烷（天津市津宇精细化工有限公司）、硼砂（天津市东丽区东大化工厂）、Ｑ一萘胺（天津市光复精细化工研究所）、硼氢化氰钠（北京莱博生物实验材料研究所）、冰乙酸，均为分析纯。１．３溶液配制Ｓａｖａｇｅ液的配制：氯仿：正丁醇＝４：１混合液，临用时配制。５％苯酚的配制：取一定量的苯酚固体，加入一定量的铝条和碳酸氢钠，在１８２℃条件下，制取其馏分。冷却后取馏分５９，加蒸馏水溶液并定容到ｌＯＯｍｌ，混匀，装入棕色瓶中备用。１－４标准单糖样品Ｌ（＋）一鼠李糖Ｄ一半乳糖Ｄ一木糖Ｄ一（一）阿拉伯糖Ｄ一葡萄糖Ｄ一甘露糖１．５仪器ＬＤ－２Ａ型离心机１０１－２Ａ型真空干燥箱数字恒温水浴锅高效毛细管电泳２实验方法与结果２．１龙葵多糖提取取干燥的龙葵鲜果２００ｍｇ加入４倍９５％７，醇，８０。Ｃ水浴２ｈ，过滤，滤渣干燥保留。将干燥的滤渣加入１０倍蒸馏水沸水浴加热５ｈ，过滤，滤渣反复提取２次，合并２次的水提液。静止去沉淀后浓缩到４５０ｍｌ左右，逐渐加入９５％乙醇（１：４）并不断搅拌，有糖浆状棕色沉淀，静止于冰箱中２４ｈ。抽滤沉淀，然后分别用无水乙醇、丙酮、石油醚冲洗三次，再将沉淀抽干，即得浅黄色粉末状物质，干燥，称重，．得粗产物龙葵多糖２７．５９。２．２龙葵多糖初步纯化２．２．１脱蛋白由于在水提龙葵多糖的过程中，游离蛋白质也被提取出来，降低了龙葵多糖的纯度，为排除游离蛋白质的干扰，故在实验过程中需要加入除蛋白的步骤。脱游离蛋白的方法有哺。７’：Ｓａｖａｇｅ法和三氯乙酸法等，Ｓａｖａｇｅ法比较温和，三氯乙酸法比较剧烈，易引起多糖降解。故本实验采用Ｓａｖａｇｅ法脱龙葵多糖中的游离蛋白。将粗产物溶于水中，加入等体积的Ｓａｖａｇｅ液（氯仿：正丁醇＝４：１混合液）振荡混匀离心，弃下层有机相（蛋白质与氯仿和正丁醇生成的凝胶物），反复多次，需经７次以上才能将游离蛋白除尽，保留上层清夜。２．２．２透析将离心后的上清夜装入透析袋中，在蒸馏水中浸泡＋４８ｈ，这样可以除去氨基酸等小分子杂质，得到多糖的半精品。２．２．３脱色向脱完蛋白质的糖液中加入氨水，调ＰＨ值在８—９之间，加入一定量的Ｈ２０ｚ（１５％），在５０。Ｃ下保温２ｈ，样品水溶液变成浅棕色，致于冰箱２４ｈ，除去沉淀部分，浓缩，无水乙醇（１：４）沉淀，离心，干燥后（北京医用离心机厂）（上海泰斯特仪器有限公司）（上海申胜生物技术有限公司）（美国贝克曼公司）７２１型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）（北京化学试剂公司）（上海伯奥生物科技有限公司）（国药集团化学试剂有限公司）（ＡＨａＡｅｓａｒ）（天津市天达净化材料细化工厂）（北京益利精细化学品有限公司）得龙葵多糖精制品。２．３龙葵多糖物化性质测定２．３．１物理性质粗产物为浅黄色粉末状物质，精制品为乳白色粉末状，均无臭、无味，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、乙酸乙酯等一般有机溶剂，可溶于热水、温水，不易溶于冷水，其水溶液透明粘稠状。２．３．１显色反应①印三酮实验没有颜色改变，说明该物质不是蛋白质。②Ⅱ一萘酚实验观察紫色光环，说明该物质可能是糖类物质。２．４多糖含量测定［８—１１］２．４．１测定波长的选择精密吸取多糖样品稀释液ｉｍｌ放于具塞试管，加５％苯酚１．Ｏｍｌ混匀，迅速加入浓硫酸５．Ｏｍｌ，摇匀，于沸水浴１５ｍｉｎ，对照液取ｌｍｌ蒸馏水于具塞试管中，以下操作相同，从４３０ｎｍ开始每隔ｌＯｎｍ测定一次至５３０ｎｍ，进行最大吸收度测定，结果见图ｌ，最大吸收波长为４９０ｎｍ。Ｆｉｇ．１Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｏｆｔｈｅｂｉｇｇｅｓｔａｂｓｏｒｂｅｄｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ２．４．２稳定性实验：按２．４．１方法操作，分别在１５、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０ｍｉｎ处测定吸光度，ＲＳＤ＝Ｉ．６％，结果见表１Ｔａｂｌｅ１．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｓｔａｂｉｌｉｔｙ２．４．３精密度实验：精密称取某一浓度的多糖样品液５份，按２．４．１方法操作，同时测其吸光度，ＲＳＤ＝Ｏ．１％，结果见表２Ｔａｂｌｅ２．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆａｃｃｕｒａｃｙ２．４．４标准曲线的绘制：精密称取１０５。Ｃ下干燥至恒重的无水葡萄糖２５ｍｇ，致ｌＯＯｍｌ容量瓶中，加水定容，摇匀，得浓度为０．２５ｍｇ／ｍｌ的葡萄糖标准溶液。吸取标准溶液０．０，２．０，４．０，８．０，１０．０，１２．０，１４．Ｏｍｌ，分别置于５０ｍｌ容量瓶中，加水稀释至刻度，各吸取２．Ｏｍｌ置具塞试管中，加入ｌｍｌ５％苯酚溶液，再垂直快速加入浓硫酸５．Ｏｍｌ，摇匀，放置５ｍｉｎ，沸水浴１５ｍｉｎ，取出，流水迅速冷却至室温，于４９０ｈｍ波长处测吸光度。以吸光度为纵坐标，以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线得回归方程：ｙ＝Ｏ．００８ｘ一０．０３１３Ｒ＝Ｏ．９９８４，见图２２１０Ｆｉｇ．２Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ换算因子ｆ＝Ｗ／（ｃ×Ｄ）其中，Ｗ为多糖重量（ｍｇ），ｃ为龙葵粗多糖储备液的葡萄糖浓度（ｍｇ／ｍ１），Ｄ为多糖的稀释因素，测得多糖含量％＝ＣＸＤＸｆ／ｗ×１００其中，Ｃ为样品液的葡萄糖浓度（ｍｇ／ｍ１），Ｄ为样品的稀释因素，ｆ为换算因子，ｗ为样品的重量（ｍｇ）。样品多糖含量（％）龙葵粗多糖３６．２５龙葵精制品多糖６５．２８高效毛细管电泳（ＢＥＣＫＭＡＮ佃Ｑ／Ｐ）缓冲液：７５ｍｍｏｌ／Ｌ硼砂溶液（ｐＨ１０．５）。柱温：２５。Ｃ。柱压：２０ｋＶ。检测波长：２４０ｎｍ。ＮａＯＨ，０．１ｍｏｌ／ＬＨＣＬ，去离子水。称取Ｑ一萘胺１４３．２ｍｇ和硼氢化氰钠３５ｍｇ，溶于４５０１１１无水甲醇中，再加入ｕ１冰乙酸，置于冰箱中待用ｕ｝Ｈ。。用双蒸水配成浓度为２０ｍｇ／ｍｌ的各种单糖标准溶液，各取２００ｕ１，加入ｕｌ衍生试剂置于试管中封管，８０。Ｃ恒温４ｈ衍生化，然后各加入三氯甲烷和双蒸水ｌｍｌ，反复离心萃取三次，取上层水相过滤后定容至５ｍｌ，冷藏备测ｕ副。２．５．５多糖水解样品的配制以２ｍｏｌ／ＬＨｅＳＯａ２ｍｌ溶解ｌＯｍｇ样品，封管，１００。Ｃ水解６ｈ，冷却，３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清夜，固体ＮａＯＨ中和，３０００ｒ／ｍｉｎ再离心５ｍｉｎ，取２００ｕ１，同上述的衍生方法一样进行衍生化ｕ”“１。２．５．６标准品及样品的测定将衍生化的标准品及样品试液经微孔滤膜过滤。取滤液为供试品溶液。然后进行毛细管电泳。分别平行做４份。根据各吸收峰的峰面积来计算各单糖组成的相对比例。２．５．７标准单糖谱图将６种单糖混合，作出标准单糖电泳谱图，然后逐－ａｎ入一种单糖，根据峰面积的变化，确定对应的单糖。标准单糖谱图见图３，迁移时间见表３。２１１２．４．５换算因子的测定：精密称取龙葵粗多糖ｌＯＯｍｇ，加水溶解，定容至ｌＯＯｍｌ，作为储备液。吸取储备液２．Ｏｍｌ，按上述方法测定吸光度。求出储备液中葡萄糖的含量。按下式计算换算因子：ｆ＝１．９７２５。２．４．６样品中多糖含量测定：精密称取龙葵粗多糖及精制品各０．２９，用蒸馏水定容到２５０ｍｌ容量瓶中，摇匀得样品液。吸取待测样品液２．Ｏｍｌ，按标准曲线制备的方法测其吸光度值，代入回归方程，得葡萄糖浓度（ｍｇ／ｍ１），按下式计算多糖含量：２．５多糖组分分析２．５．１电泳装置２．５．２电泳条件２．５．３衍生剂的配制４１清洗液：０．１ｍｏｌ／Ｌ２．５．４单糖的Ｑ一萘胺衍生４０Ｆｉｇ．３Ｔｈｅａｔｌａｓｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓａｃｃｈａｒｉｄｅ１．Ｄｅｒ：衍生峰２．Ｒｈａ：Ｌ（＋）一鼠李糖３．Ｘｙｌ：Ｄ一木糖４．Ｇｌｕ：Ｄ一葡萄糖５．Ｍａｎ：Ｄ一甘露糖６．Ａｒａ：Ｄ一（一）阿拉伯糖７．Ｇａｌ：Ｄ一半乳糖Ｔａｂｌｅ３．Ｔｈｅｍｏｖｅｍｅｎｔｔｉｍｅｏｆｓａｃｃｈａｒｉｄｅ２．５．８多糖样品分析将龙葵多糖作出的谱图与标准混合单糖的谱图对照，根据其出峰时间的对应关系，可以确定龙葵多糖主要由Ｄ一半乳糖、Ｌ（＋）一鼠李糖和Ｄ一（一）阿拉伯糖组成，还含有少量的Ｄ一木糖、Ｄ一葡萄糖和Ｄ一甘露糖。单糖组成、迁移时间、峰面积值及相对含量见图４、表４。Ｆｉｇ．４ＴｈｅａｔｌａｓｏｆＳｏｌａｎｕｍＮｉｇｒｕｍＬ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅＴａｂｌｅ４．ＴｈｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳｏｌａｎｕｍＮｉｇｒｕｍＬｐ０１ｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ２１２电泳结果表明，龙葵多糖主要是由Ｄ一半乳糖、Ｌ（＋）一鼠李糖和Ｄ一（一）阿拉伯糖三种单糖为主组成，三者的比例为Ｇａｌ：Ｒｈａ：Ａｒａ＝２．７５：１：１．６１。本实验利用ＨＰＣＥ检测龙葵多糖中单糖组成，取得了较好的分离效果，且操作简单，精密度高，因此随着ＨＰＣＥ的普及，此实验方法可以发展为一种测多糖中单糖组成的一种常用方法。３讨论从传统中草药龙葵水煎剂在治疗疾病方面的疗效，可以推断其治疗疾病的有效成分应该是水溶性的。因此，分离水溶性成分，对于寻找新的药物具有重要意义。近年来从水溶性成分中分离出具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗血栓的多糖后，对于水溶性多糖的研究更为关注。龙葵水溶性成分的研究还有待于进一步的深入。虽然ＨＰＣＥ对于检测多糖中单糖有较好的分离效果，但前处理及电泳条件尤为重要。单糖的紫外吸收很弱，用Ｑ一萘胺衍生后可使单搪的还原端接上很强的紫外吸收基团，但单糖的Ｑ一萘胺衍生物在水溶液中仍然不带电荷，不能实现电泳分离，采用以硼砂为介质的电泳体系，硼砂可与糖基上相邻的二羟基络合，形成糖一硼酸根阴离子，不同糖基上羟基取向不同以及分子量的差异，使其络合物具有不同的淌度，从而达到有效分离。但硼砂浓度与ＰＨ值对样品分离有一定的影响，用硼砂做缓冲液单糖混合物的分离度一般随ＰＨ值增加而增大，其最佳分离条件的ＰＨ值在９．５—１０．５之间，ＰＨ值升高分离度下降，出峰变慢ｕ眦¨。实验选择最适宜的ＰＨ值在１０．５。增加缓冲液中硼砂浓度，能比较有效的增加分离度，不过单糖的出峰时间亦有所延长，实验在７５ｍｍｏｌ／Ｌ分离效果最好。参考文献［１］ＭｏＨｍｈｏｎｇ，ＺｅｎｇＨｅｐｉｎｇ，ＸｉａｏＧｕｉｗｕ．ＳｔｕｄｙｏｎｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｄｕｃｔｓｆｒｏｍＳｏｌａｎｕｍｎｉｇｒａｍＬ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＳｏｕｔｈＭｅｄＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９５，２：４１．【２］ＨａｔａｎａｋａＫ，ＹｏｓｈｉｄａＴ’ＭｉｙａｈａｒａＳ，ｅｔａ１．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｎｅｗｈｅｐａｒｉｎｏｉｄｓｗｉｔｈｈｉｇｈａｎｔｉａｇｕｌａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙ．ＪＣｈｅｍ，１９８７，３０：８１０２【３】ＹａｓｕｈｉｔｏＫ．Ｖｉｒｕｃｉｄｅｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｕｌｆａｔｅｄｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔｓ，１９９０，２：２２９．［４］ＸｉａｏＧｕｉｗｕ，ＺｅｎｇＨｅｐｉｎｇ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｂｌａｃｋｎｉｇｈｔｓｈａｄｅ（Ｓｏｌａｎｕｍｎｉｇｒｕｍ）（Ⅱ）ＣｈｉｎｅｓｅＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌａｎｄＨｅｒｂａｌＤｒｕｇｓ，２０００，３１（３）：１６２．［５】ＬｕｏＸｉｎｌｉ，ＹａｏＳｈｕｈｕａ，ＺｈｏｕＳｈａｏｑｉ．ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＦｏｏｄＩｎｄｕｓｔｒｙ，１９９８，３：５．ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，［６】ＭｉｙａｚａｋｉＴ’ＮｉｓｈｉｊｉｍａＭ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１９８２，１０９：２９０—２９１．［７】ＴａｎＺｈｏｕｊｉｎ，Ｘｉｅ２００２．３：１０・１１．Ｄａｐｉｎｇ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ［８】ＣｈｅｎｇＳｈｕａｎｇ，ＣｕｉＱｉｎｇｘｉｎ，ｗａｎｇＹｏｎｇ．ＥｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｗａｔｅｒｓｏｌｕｂｌｅｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＭｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａＬ．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＺｈｅｎｇｚｈｏｕＧｒａｉｎＣｏｌｌｅｇｅ，２０００，２１（２）：５３－５４．ｃｏｎｔｅｎｔ【９】ＬｉｕＹｕａｎ，ＸｕｅＨｕｉｚｈｏｎｇ，ＹａｎｇＷｅｎｇｅ，ＣｈｅｎＳｈａｏｗｅｎ，ＺｈｏｕＪｉｎｓｏｎｇ．Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎａｎｄｏｆｃｏｍｓｔｉｇｍａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ［１０］ＸｕＢｉｎ，ＤｏｎｇＹｉｎｇ，ＬｉｎＬｉｎ，ＸｕｏｆＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴＣＭ，１９９９，１５（２）：９０．Ｚｉｍｉｎｇ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＭｏｍｏｒｄｉｃａｃｈａｒａｎｔｉａＬ．ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｂｙｉｍｐｒｏｖｅｄｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃａｃｉｄｍｅｔｈｏｄ．ＦｏｏｄＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，７：７９．【１１］ＷａｎｇＨｕｉ，ＴａｎｇＨｕｉｊｕａｎ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎＧｕａｎｇｚｈｏｕｏｆＢａｍｂａｘｒｎａｌａｂａｒｉｃｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．ＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０００，２８（３）：３２．【１２］ＺｈｏｕＲｏｎｇ，ＱｉＬｉ，ＷａｎｇＹａｆｅｎ，ＺｈｕＹｉｃｈｕａｎ，ＹｕＣｕｉｊｕａｎ．Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄＨＰＣＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｌｙｃｙｒｒｈｉｚｉａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌ【１３］ＤｉｎｇＫａｎ，ＦａｎｇｏｆＡｎａｌ），ｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，２７（２）：２４５．Ｊｉｎｉａｎ．Ｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．ＣｈｉｎｅｓｅＷ．ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｉｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９９９，１７（４）：３４７—３４８．［１４］ＷａｎｇＷ：ＳｕｎＸ，Ｊｉｎｈｕｍａｎｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙ２１３ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＪｏｕｒｎａｌＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍＢｉｏｌｏｇｙ，２００３，７９８：１７５—１７８．［１５】ＺｈｕＸｉａｏｌｉｎ，ＭａＹｏｎｇｊｉａｎ，ＦｅｎｇＦａｎｇ，ｅｔａ１．ＳｔｕｄｙｑｕｉｎｑｕｅｆｏｌｉｕｍｂｙｈｉｇｈｏｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｏｆＪｏｕｒｎａｌｐａｎａｘｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＣｈｉｎｅｓｅｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２００１，２２（６）：２９８．［１６］ＧｅｎｇＹｕｅ，ＷａｎｇＮｕａｎｂｏ，ＬｉＨａｉｙａｎ，ＧａｏＹｕｍｅｉ，ＳｈｉＪｉａｎｇｕｏ，ＦｕＳｈａｎｊｉａｎｇ．ＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｆｒｏｍｐｏＨｅｎｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃ仃ｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＳｈａｎｄｏｎｇＳｃｉｅｎｃｅ，２００１，１４（４）：１０—１１．［１７】ＣｈａｎｇＬｉｗｅｎ，ＹａｏＲｕｉｆｅｎｇ，ＹａｎＦｅｎｇ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌ）７ｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，２２：９７５—９７９．ａｎａｌｙｓｉｓｂｙｈｉｇｈ［１８］ＷａｎｇＹｉｍｉｎｇ，ＷｅｉＷｅｉ，ＬｕｏＧｕｏａｎ．ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｃａｐｉｌｌａｒｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．ｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，２４（１２）：１４５９．［１９］ＷａｎｇＦ，ＫｈａｌｅｄｉＭＧＥｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｓｅｐａｒａｔｉｏｎｂｙｎｏｎ—ａｑｕｅｏｕｓＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍＡｃａｄｅｍｅ，２０００，８７５：２７７—２９３．ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ［２０】Ｓｕ只ＺｈａｎｇＸＪ，ＷａｎｇＹＣ，ｅｔａ１．ＤｉｒｅｃｔｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆｅｓｔｒｉｏｌｉｎｐｒｅｇｎａｎｃｙｂｙｃａｐｉＨａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｉｔｈｌａｓｅｒｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｄｅｔｅｃｔｏｒ．Ｔａｌａｎｔａ，２００３，６０：９６９—９７５．【２１】Ａ１一ＡｒｈａｂｉＭ，ＭｒｅｓｔａｎｉＹＲｉｃｈｔｅｒＨ，ｅｔａ１．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｕｓｉｎｇＣＺＥ．ＪｏｕｒｎａｆＰｈａｒｍＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ，２００２，２９：５５５．５６０．ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ２１４
