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溶菌酶 PLGA-mPEG 缓释微球的制备及释药行为的研究

来源：抵帆知识网

清华大学

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题目：溶菌酶PLGA-mPEG缓释微

球的制备及释药行为的研究

系别：化工系专业：化学工程与工艺姓名：邱婷婷指导教师：丁富新教授辅导教师：李近博士生

2007年6 月18 日

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中文摘要

蛋白质载药微球可以有效解决蛋白质给药存在的稳定性差，血浆半衰期短等诸多问题。然而，常用载体PLGA疏水性较强，与蛋白相容性差，导致包封率普遍不高、微球突释严重以及释药不完全。在PLGA材料嵌入亲水性mPEG，可以改善材料的亲水性能，更利于蛋白质类载药微球的制备。

本论文以水溶性大分子蛋白溶菌酶（LZ）作为模型药物，嵌段聚合物PLGA-mPEG为基质，采用w/o/w复乳法制备微球。首先考查了微球的包封率、表面形态、粒径、体外释放等特性。通过药材比例、成球材料的分子量和单体配比、外水相乳化剂浓度等重要制备条件，优化微球制备工艺：采用单体配比LA/GA为50/50，分子量为200,000-5,000的PLGA-mPEG，药材比为1:6，外水相浓度1%时制备的微球释药情况最好。

比较PLGA-mPEG微球与PLGA微球在包封率、微球表面形态等特性参数与释药情况等方面的优劣，发现在同一乳化条件下制备的PLGA-mPEG微球与PLGA微球相比，体积略大，表面孔隙与形态更复杂，体外释放速率也更快。

为了提高微球的释放性能并实现对释药速率的控制，本文在制备过程中添加不同附加剂：如在内水相中添加PEG/O-CMC，有机相添加乙酸乙酯/丙酮，并在外水相中添加盐类制备微球。研究发现内水相中添加PEG / O-CMC，或者油相中添加具有不同挥发性和溶解度的有机溶剂，对微球性质和释药行为的调节均不是很理想。而在外水相中添加一定浓度范围的NaCl，对微球收率和包封率等性质基本没有影响，而且能有效改善微球的释药情况，外水相中添加0.9%的NaCl，蛋白质微球的缓释时间可以达到三周以上。

材料的降解是调节药物释放速率的主要因素。论文第三部分考查了不同药材比和材料亲水性对材料降解的影响。对于大分子溶菌酶载药微球而言，随着药材比提高和材料亲水性增强，材料降解速度越快，药物的释放速率也加快。

关键词：溶菌酶微球；PLGA-mPEG；优化；附加剂；降解

ABSTRACT

Protein loaded PLGA microspheres have many advantages in solving problems such as protein instabilities, short half-lives in vivo and low oral bioavailability in therapeutic protein delivery,etc. However, the compatibility of PLGA and protein was not good due to the hydrophobic of PLGA, leading to lower protein encapsulation efficiency, higher burst effect and incomplete protein release. The incorporation of mPEG domain into PLGA can significantly improve the hydrophilicity of PLGA and exhibite to be a good candidate for preparing protein loaded microspheres.

In this study, lysozyme(LZ) was encapsulated as a model protein drug in microspheres of polymer PLGA-mPEG by the water-in-oil-in-water(w/o/w) emulsion solvent extraction /evaporation(double emulsion) technique. Drug loading, surface morphology, partical size and in vitro release profile of the microspheres were examined. The preparation parameters were optimized by adjusting the mass ratio of lysozyme to PLGA-mPEG, the molecular weight of PLGA and PEG, together with its monomer composition and the concentration of polyvinyl alcohol (PVA) in the outer aqueous phase. The optimal conditions were found to be: the monomer ratio LA/GA was 50/50, the molecular weight of PLGA-mPEG was 200,000-5,000, the mass ratio of lysozyme to PLGA-mPEG was 1:6 and the concentration of PVA was 1%.

Comparing the optimized PLGA-mPEG microspheres with PLGA microspheres on encapsulation efficiency, surface morphology and in vitro release, we found that the PLGA-mPEG microspheres were larger in size if prepared under the same emulsification condition. They also exhibited more complex surface structure, less burst effect, and a consequent more rapid protein release rate.

In order to improve the properties and control the rate of drug release of the delivery vehicle materials, additives were used to prepare the micropheres, such

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as polyethhhylene glycol(PEG)/ Carboxymethyl-chitosan(O-CMC) in internal aqueous, ethylacetate(EA)/acetone(ACE) in organic solvent and NaCl in outer aqueous. Results showed that the addition of PEG/O-CMC in internal aqueous or EA/ACE in organic solvent was not a good way to improve the properties of microsphere. However, NaCl as an outer aqueous additive had no adverse effect on microsphere properties and could adjust drug release rate in a good manner. NaCl with a concentration of 0.9% in outer aqueous led to a sustained protein release for nearly 21 days.

The degradation of material was the main factor to control the rate of drug release. In this study, effects of different drug loadings and material hydrophilicity on degradation of material were investigated. More rapid degradation rate and protein release rate of the microspheres were observed while higher drug loading ratio and more hydrophilic materials were applied. Keywords: lysozyme microsphere; PLGA-mPEG; optimization; additive; degradation

主要符号对照表

ACE DCM EA LCST LZ Mw MP O-CMC PEG PLGA PLGA-mPEG PVA RLZ U UV λ

丙酮二氯甲烷乙酸乙酯极低临界相变温度溶菌酶质量平均分子量微球羧甲基壳聚糖聚乙二醇

乳酸/羟基乙酸共聚物

聚乙二醇改性聚乳酸/羟基乙酸共聚物乙酸乙酯聚乙烯醇溶菌酶的释药率酶的活度紫外光谱波长

第1章引言........................................................................................................1

1.1 蛋白类药物简介............................................................................................................1 1.2 新型给药系统................................................................................................................1 1.2.1 口服缓控释系统......................................................................................................1 1.2.2 经皮给药系统..........................................................................................................1 1.2.3 埋植给药系统..........................................................................................................1 1.2.4 微粒给药系统..........................................................................................................1 1.3 蛋白类药物的缓释微球................................................................................................1 1.3.1 微粒给药系统特点及应用.......................................................................................1 1.3.2 微球制备方法..........................................................................................................1 1.3.3 微球载体材料..........................................................................................................1 1.4 课题的研究内容和方案................................................................................................1

第2章实验技术和研究方法............................................................................1

2.1 主要实验设备................................................................................................................1 2.2 实验药品........................................................................................................................1 2.2.1 溶菌酶......................................................................................................................1 2.2.2 乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA）与聚乙二醇改性聚乳酸/羟基乙酸共聚物

（PLGA-mPEG）.....................................................................................................1 2.2.3 聚乙烯醇（PVA）...................................................................................................1 2.2.4 司盘80（Spanum 80）...........................................................................................1 2.2.5 二氯甲烷..................................................................................................................1 2.2.6 其他..........................................................................................................................1 2.3 复乳法制备溶菌酶微球................................................................................................1 2.4 微球的特性分析方法....................................................................................................1 2.4.1 微球的收率、包封率和载药量...............................................................................1

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2.4.2 表面形态观察..........................................................................................................1 2.4.3 微球的粒径分布......................................................................................................1 2.4.4 微球的体外释放......................................................................................................1 2.4.5 溶菌酶浓度的测量..................................................................................................1 2.4.6 材料分子量的测定..................................................................................................1 2.4.7 PEG含量测定..........................................................................................................1 2.4.8 药物在微球中的分散情况......................................................................................1 2.4.9 微球表面积及孔径测定..........................................................................................1 2.4.10 微球表面积及孔径测定......................................................................................1

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备.......................................................1

3.1 引言...............................................................................................................................1 3.2 溶菌酶微球的复乳法制备工艺...................................................................................1 3.3 制备工艺参数的调整和优化.......................................................................................1 3.3.1 制备过程优化实验方案..........................................................................................1 3.3.2 聚合物材料性质对微球性质的影响......................................................................1 3.3.3 药材比的影响..........................................................................................................1 3.3.4 外水相浓度的影响..................................................................................................1 3.4 PLGA-mPEG微球与PLGA微球比较.........................................................................1 3.5 本章小结......................................................................................................................1

第4章附加剂添加对微球性能影响.................................................................1

4.1 引言...............................................................................................................................1 4.2 附加剂的选择...............................................................................................................1 4.2.1 内水相中添加附加剂PEG/O-CMC.......................................................................1 4.2.2 油相中添加乙酸乙酯（EA）/丙酮（ACE）........................................................1 4.2.3 外水相中添加盐类..................................................................................................1 4.3 实验方案.......................................................................................................................1 4.3.1 内水相中添加PEG/O-CMC...................................................................................1 4.3.2 油相中添加EA/ACE...............................................................................................1 4.3.3 外水相添加盐类NaCl.............................................................................................1

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4.4 结果与讨论....................................................................................................................1 4.4.1 附加剂对包封率影响...............................................................................................1 4.4.2 附加剂对微球表面形态与粒径大小影响...............................................................1 4.4.3 附加剂对溶菌酶微球体外释放影响.......................................................................1 4.5 本章小结........................................................................................................................1

第5章材料降解对微球释药行为影响考查....................................................1

5.1 引言................................................................................................................................1 5.2 实验方案........................................................................................................................1 5.3 结果与讨论....................................................................................................................1 5.3.1 微球释药前的表面形态...........................................................................................1 5.3.2 微球释药前的DSC分析.........................................................................................1 5.3.3 材料降解行为研究...................................................................................................1 5.3.4 不同载药量微球释药行为.......................................................................................1 5.4 本章小结........................................................................................................................1

第6章结论和建议............................................................................................1

6.1 结论................................................................................................................................1 6.2 建议................................................................................................................................1

插图索引................................................................................................................I 表格索引................................................................................................................I 参考文献................................................................................................................I 致谢................................................................................................................I 声明................................................................................................................I 附录A ..................................................................................................................I 缓冲溶液配制方法及标准曲线的测定...............................................................I 溶菌酶280nm下吸光度标准曲线的测定..........................................................I

第1章引言

1.1 蛋白类药物简介

随着基因工程日益成熟，大分子类药物即多肽类、蛋白类、疫苗药物比例逐年增大，多肽、蛋白质类药物是药用生物活性大分子物质，它们与体内正常生理物质十分接近，更易为机体吸收、且药理活性高、针对性强，毒性低，随着生物技术的飞速发展，此类药物已成为生物技术新药的主要品种[1]。

多肽蛋白类药物为活性大分子。与天然或合成小分子药物相比，具有如下特点：

a.相对分子质量大，常为几千至几十万，颗粒较大，扩散速度较慢； b. 多数亲水性较强，不易透过生物膜；

c.性质不稳定，在体内外环境可能经受多种复杂的化学降解和物理变化而失活，如凝聚、沉淀、消旋化、酶解等，二级、三级结构也影响其生物活性；

d.体内半衰期短、清除率高、降解代谢途径多样。

多肽蛋白类药物若不加任何修饰或剂型改造，通过常规给药方式的生物利用度很低，故注射给药仍是主要的给药方式。但是注射给药存在一定弊端，因为大多蛋白质药物在血液中半衰期很短，需要进行高剂量频繁给药来达到药效。然而过高剂量会导致毒副效应，而且病人顺应性较差，从而造成许多痛苦和不便。

非注射给药如肺部、眼部、鼻腔、口服等给药途径由于给药简便，病人顺应性好，是目前研究的热点。其中口服给药是病人最易接受的给药途径，具有很大的研发潜力。但蛋白质直接口服给药的生物利用度非常低，只有百分之几，临床使用价值不大。主要原因是：

a. 在胃液酸性环境和消化道中各种蛋白酶对蛋白类药物的破坏失活； b. 分子量较大，难以通过扩散被胃肠壁的上皮细胞层吸收; 且大多水溶

性，不易透过亲脂性肠壁粘膜屏障；存在肝脏首过效应； c. 蛋白质自身性质的不稳定性也是一大原因。

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1.2 新型给药系统

药物传输系统(Drug Delivery Systems ,DDS) 系指人们在防治疾病的过程中所采用的各种治疗药物的不同给药形式,在60 年代以前的药剂学中称为剂型。如注射剂、片剂、胶囊剂、贴片、气雾剂等。随着科学的进步,剂型的发展已远远超越其原有的内涵,需要用药物传输系统或给药器(Device) 这类术语加以表述,即原由药物与辅料制成的各种剂型已满足不了临床治疗的需要,有的将药物制成输注系统供用,有的则采用钛合金制成给药器植入体内应用,使临床用药更理想化。为克服普通制剂的有效血浓维持时间短的缺陷,出现了长效注射剂,口服长效给药系统或缓控释制剂、经皮给药系统等一系列新的制剂[2]。

由于缓/控释制剂的特点,它的市场前景看好。缓释制剂通常是指口服给药后能在机体内缓慢释放药物,使达有效血浓,并能维持相当长时间的制剂

[3]

。控释制剂系指释药速度仅受给药系统本身的控制,而不受外界条件,如

pH、酶、离子、胃肠蠕动等因素的影响,是按设计好的程序控制释药的制剂,如零级释药的渗透泵,脉冲释药的微丸,结肠定位释药的片剂或胶囊以及自动调节释药的胰岛素给药器等等。

1.2.1 口服缓控释系统

口服缓释和控释系统是发展最快的新型给药系统，传统剂型包括采用片剂和胶囊剂口服或口腔给药。近年来，除了对药物的释放速度进行有效控制外，也出现了控制释药部位和控制释药时间的缓释、控释系统，例如结肠定位给药系统和脉冲给药系统等。在这些给药系统中包含了多种物理化学原理。随着新技术、新材料和新设备的应用，出现了如水凝胶骨架片、水不溶性膜控包衣片，微丸包衣技术及胶囊，利用渗透压原理及激光技术的渗透泵片或胶囊，利用离于交换原理制备的液体控释制剂以及利用高分子粘附特性的胃滞留片、胶囊及口腔粘贴片等新型口服给药系统。

口服多肽或蛋白质后在胃肠道降解成小分子氨基酸吸收，其生物活性消失。阻止大分子口服吸收进入的主要屏障是致密的肠上皮细胞膜、胃酸和各种消化酶。目前解决的方法主要有蛋白酶抑制剂或促渗透剂等,但前者长期使用会使营养蛋白质的吸收发生紊乱，致使胃肠道的酶分泌产生抑制等不良影响，后者的非特异性吸收促进，也会促使非药物类物质的吸收。改进给药剂型是当前研究的另一热点，其中微粒作为近年来的新型载体，因取材广泛、

第1章引言

具有独特的保护功能及药物的缓控释特性，在蛋白质口服给药方面受到广泛关注 [4]。

1.2.2 经皮给药系统

经皮给药系统(transdermal drug delivery system)是指是指在皮肤或黏膜表面给药,使药物以恒定速度(或接近恒定速度)通过皮肤各层或黏膜,进入体循环,产生全身或局部治疗作用的新制剂。避免了口服给药可能发生的肝脏首过效应及胃肠道消化液对药物的灭活,提高制剂的生物利用度和治疗效果,也可减少药物对胃肠的刺激作用; 一次给药可以长时间使药物以恒定速率进入体内,减少给药次数,延长给药间隔;药物可按需要的速率输入体内,维持恒定有效的血药浓度,避免口服给药等引起的血药浓度峰谷现象,降低不良反应;使用方便,患者可以用药,有任何不适可随时中断给药;尤其是作为生物大分子药物的给药途径,可有效解决生物大分子在体内易失活及半衰期短等问题[5]。

1.2.3 埋植给药系统

植入型药物释放系统（Implantable Drug Delivery Systems）为一类经手术植入体内或皮下或经穿刺导入皮下的控制释药制剂，是一种长期给药体系。它具有以下优点:(1)消除因问歇给药和药量不均匀而产生的峰、谷现象，可在特定的作用部位以恒定的速率持续释药并维持治疗浓度，具有较小的剂量即可达到疗效的作用;(2)药物作用于靶位，可避免对体内其它组织的副作用;(3)避免一些药物的迅速代谢，延长其体内半衰期;（4）难以用其它途径给药的药物可通过植入途径给药;（5）可避免某些剂型给药后引起的不适感、损伤及痛苦等，若发现有严重的过敏反应或副作用可迅速取出。

随着医药技术的发展，载体材料及其应用范围等多方面的研究都取得了很大进展。载体由最初单一的硅橡胶，发展到目前包括聚酸酐、聚乳酸、聚氨基酸等生物降解性材料在内的数十种，还有报道的硅溶胶[6]磷石[7]等。药物应用范围也由当初的避孕治疗扩展到抗肿瘤、胰岛素给药、心血管疾病、眼部疾病、抗结核、骨髓炎、疫苗等多种治疗领域。

1.2.4 微粒给药系统

微球(microsphere) 是指药物溶解或者分散在高分子材料基质中形成的微小球状实体,属于基质型骨架微粒。微球用于药物载体的研究始于20 世纪

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70 年代中期,发展十分迅速。药物制成微球后,因其对特定器官和组织的靶向性及微粒中药物释放的缓释性,已经成为近年来缓控释剂型研究的热点[8]。

它具有以下优点：

（a）控制药物的释放速度以达到长效缓释目的（b）增加药物的靶向性

（c）减少药物刺激,降低毒副作用,提高疗效

（d）提高药物的稳定性：一些疫苗、蛋白类药物在微球制剂的制备过程、贮存和释放过程中,某些不利条件常导致蛋白质失活。因此提高蛋白质的稳定性十分重要。

1.3 蛋白类药物的缓释微球

1.3.1 微粒给药系统特点及应用

采用高分子聚合物为材料，将蛋白类药物包封制成微粒（微球或微囊），尤其是制备成纳米粒（具有独特的纳米级性质），可以解决蛋白质口服给药存在的诸多问题。其优点如下：

a. 通过载体材料对蛋白药物进行包封，保护蛋白药物泄漏被蛋白酶降解 b. 微粒自身的小尺度效应，可以通过肠粘膜屏障；

c. 可以改变蛋白类药物的组织间分布。纳米粒可以直接通过广泛发布于

胃肠粘膜上皮中毛细血管末端以完整的形式被吸收，一定粒径的纳米粒具有靶向作用，可透过小肠上皮细胞，经派伊尔淋巴结(Peyer's patch)到达肝脾等各组织，使胰岛素浓集于肝脏，发挥降糖作用； d. 微粒具有控缓释功能，可实现胰岛素在靶部位以一定速度释放，实现

长效给药；

e. 微粒制备取材广泛，可以进行多种修饰。通过修饰可以改变微粒的性

能，如表面电荷性、亲水性、粘附性等，延长微粒在胃肠道停留时间，促进药物吸收； 1.3.2 微球制备方法

微球作为药物载体主要存在的问题：（1）药物表面吸附引起的“突释效应”严重，药物释放曲线呈三相结构；（2）微球的载药量有限，用药量大的药物不易制成微球；（3）尚未有一种类型的微球能定位于病变区。

第1章引言

微球常用的制备方法主要有乳化-化学交联固化法、溶剂蒸发法、喷雾干燥法、超临界流体法等等[9]。 a) 乳化-化学交联固化法

该法是利用带有氨基的高分子材料易和其他化合物相应的活性基团发生反应的特点，交联制得微球。这些高分子材料包括明胶、壳聚糖和蛋白类等，交联剂用戊二醛、甲醛等，由于交联剂中的醛基可以和高分子材料的氨基发生缩合作用使微球固化，药物则溶解或者分散在材料溶液中。这种方法对成球的材料有较大的， b) 溶剂蒸发法

此法又称为液中干燥法，常用于聚乳酸（PLA）、PLGA等α-羟基酸类微球的制备。即将材料单体溶于可挥发且在水中可适当溶解的有机溶剂中。药物溶解或者分散在材料溶液中，如连续相及乳化剂溶液制成乳浊液，挥发除去溶剂，分离得微球。本法操作简单，适于实验室操作，但要放大生产有一定难度，通常分为单乳法和复乳法，其中复乳法应用较广泛。

单乳法可分为 O/W和O/O型。一般来说，O/W型单乳法适用于脂溶性药物，水溶性药物采用该工艺所得微球的包封率很低， O/O与O/W型单乳法的工艺类似，适用于水溶性药物。

复乳法W/O/W用于制备水溶性药物微球。一般将聚合物溶解在二氯甲烷、氯仿等有机溶剂中。另外复乳法更适合制备性质不稳定的药物，特别是可避免多肽蛋白类药物与有机溶剂长时间接触而失活，且包封率及得率较高，药物释放也较理想[10]。 c) 喷雾干燥法

将药物和聚合物用适当的溶剂溶解，或制成乳液、混悬液后以雾滴形式喷出，溶剂在热空气的作用下快速挥发，形成微粒。本法工艺简单、重现性好、易扩大生产，所得微球表面光滑、包封率较高，可有效保护生物样品的活性，可用于性质不稳定药物和温度敏感的药物的制备，但得率较低、粒径较小，不适合分子量大的药物。 d) 超临界流体法

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前述方法中均使用大量有机溶剂，并需进行洗涤、千燥等后处理，易造成有机溶剂残留，影响产品质量。目前，基于超临界流体的相分离技术-雾化溶剂萃取系统(aerosol solvent extractionsystem)已用于微球的制备。该系统主要包括超临界溶液快速膨胀法RESS、气体抗溶剂重结晶法GAS和压缩流体抗溶剂析出法PCA。本工艺可达到避光、隔绝空气、防水、无菌等要求，且可扩大生产，但是对设备要求较高，实验成本高，而不能广泛应用。

1.3.3 微球载体材料

要解决蛋白类药物的控制释放问题，首先必需找出适合这一类亲水性大分子释放的基材与相应结构形态的载体。目前，在制备微球所用的载体材料中，可生物降解的合成高分子材料受到普遍的重视并得到广泛的应用。如聚酯类、聚氰基丙酸烷酯(PACA)、聚合酸酐、羟甲基葡聚糖等[11]。

其中聚酯类是迄今为止研究最多、应用最广的可生物降解的合成高分子材料，它们基本上都是羟基酸或其内酯的聚合物。常用的羟基酸是乳酸(lactic acid)和羟基乙酸(glycolic acid)。聚乳酸(PLA)及其与聚羟基乙酸的共聚物(PLGA)是一种生物相容性良好的可降解材料，此类材料在体内酯键水解生成乳酸单体，并在乳酸脱氢酶作用下氧化为丙酮酸，作为能量代谢物质参与体内三酸循环，终产物为水和二氧化碳，经肺、肾、皮肤排泄。大量实验证明PLA具有良好的生物相容性，不会引起明显的炎性反应、免疫反应和细胞毒性反应。用PLA和PLGA为材料制得的微球、纳米囊、凝胶等注射剂可以起到保护药物、增溶、提高生物利用度的作用，达到较长时间的缓释、控释目的，是具有广阔开发前景的缓释控释制剂，尤其是对于目前研究开发较多的多肽、疫苗、激素等生物技术药品。采用聚酯材料如PLA、PLGA作为载药微粒、纳米粒的载体，可以起到保护药物、增溶、提高生物利用度的作用，尤其是对于目前研究开发较多的多肽、疫苗、激素等生物大分子药物。此类药物经PLA或PLGA包埋制备成缓释微球注射剂，可有效拓宽给药途径，提高药物的生物利用率。在药物释放方面，可以根据药物的性质、给药途径和释药时间，选用不同聚合程度的聚酯材料，采用相应的制备工艺，通过调整聚合物的组成、分子量、载药量及粒径的大小等因素，来控制药物达到不同的释放模型。聚酯类载药微粒在药物的释放方面具有诸多优点：

1) 缓释速率对药物性质的依赖性较小。缓释速率主要由载体的降解速率

控制，从而使对微粒的载药量和几何形状等参数的选择范围更广；

第1章引言

2) 释放速率更为稳定。在扩散控释体系中，释放速率一般都会随时间而

递减。如使用可降解材料作载体，随着材料的降解，药物的渗透率加快，可抵消扩散速率的降低。在理想情况下，释放速率可维持恒定，达到零级释放动力学模式；

3) 材料降解和释药速率可控性。不同的药物需要不同的释放速度，聚酯

材料在体内的降解时间可以根据其制备单体的比例来调节，从而调节药物的释放速度。

尽管PLA /PLGA已是一类被广泛应用在伤口缝合、药物释放等方面已有临床应用。但由于PLA和PLGA的疏水性较强，它的应用仍受到一定。与水溶性蛋白结合力低,口服后持续作用时间短和免疫增强效果不明显等不足。

聚乙二醇(PEG)是由乙二醇单体聚合而成的线性高分子材料。具有优越的物理化学以及生物性质,包括亲水性、在水或有机溶剂中的溶解性及无毒性等。这类嵌段共聚物具有亲水的PEG链段和疏水的PLA链段，可以通过改变共聚物组成大幅度调节材料的亲疏水性能和降解融蚀速率，为生物医药和组织工程领域的研究提供了一种有意义的新载体材料[12]。

1.4 课题的研究内容和方案

材料PLGA由于疏水性较强，与水溶性蛋白结合力低，而引入亲水性片断的材料PLGA-mPEG则可以解决材料与药物结合力低的问题。本课题主要是希望通过一种大分子蛋白药物溶菌酶，对这一材料进行研究，研究内容主要分以下几个方面：

1）优化和完善溶菌酶微球的制备，进行配方和制作工艺的改进。

采用聚乙二醇改性聚乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA-mPEG）作为微球的成球材料，采用复乳法来尝试微球的制备，复乳法是制备大分子药物常用的方法，它操作简单，成球又有相对高的包封率和得率，有利于保证药物的活性，使药效果一般也较好。

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对制备的微球通过包封率、得率、微球表面形态、粒径分布，体外释放实验等进行评价和配方的改进，改进大方向主要以下几个方面： a) 聚合物材料分子量的影响：

它与其玻璃相变温度有关[14] 。一般，低相对分子质量的聚合物包裹的蛋白有较大的突释。这主要是由于低相对分子质量的聚合物在有机溶剂中溶解性较好，固化时间较长，因此生成的微球具有较高的多孔性。另一力面，相同条件下低相对分子质量的聚合物生成的微球粒径较小，有较大的表面积促进药物的扩散[15]。但也有文献报道当相对分子质量大到一定的程度后，聚合物分子和药物分子之间的相互作用在其中起了重要的作用。此时相对分子质量越大，与药物之间的相互作用越弱，则微球突释程度越严重。

通过调节PLGA-mPEG中PLGA与PEG的分子量，可以大幅度调节材料亲疏水性，并可以改变材料的降解时间[16]。

b) 材料中LA/GA的比例[17]：共聚物中GA含量增加，释放加快。通过调节LA/GA的配比可控制载体的降解时间，籍以与药物的释放时间保持同步。

c) 药材比的影响：降低聚合物对分散体系的比例将减少密实聚合物部分的形成。这就使得蛋白在微球固化过程中向微球表面转移成为可能，并可能形成大的空洞，而药物在这些区域的扩散已不受聚合物控制，造成突释程度增加。

d) 表面活性剂用量和浓度的影响。常规采用的水相表面活性剂是聚乙烯

醇（PVA），但是这种表面活性剂的作用对蛋白质药物的活性带来较大的影响，有文献报道[18]，对BSA复乳法制备微球采用0.1%（w/v）Tween-80释药效果比用PVA好。同时油相的乳化剂采用Span-80，但是其用量和浓度尚没有定量研究。 2）制备过程中添加附加剂

（a）内水相添加附加剂：

第1章引言

溶菌酶在油水界面聚集变性是造成其失活的主要原因。添加剂保护蛋白活性原因是添加剂对蛋白质的两种稳定机制：一种是稳定剂(O-CMC)以各种作用(疏水作用、氢键)代替蛋白质水化层，增大了药物溢出的阻力，起到保护作用。此外，本实验中考虑添加O-CMC，还因为它可以改变内水相粘度来改善乳化效果，以获得高质量的微球。内水相的粘度通常也是包封率的影响因素,内水相的粘度越高,包封率也就越高,可能是因为提高了初乳的稳定性。另一种是稳定剂分子(PEG)优先吸附于油水界面，减少了蛋白质与疏水界面的相互作用。本实验重点考察这两者对蛋白类微球活性包封率，体外释放的影响。

（b）有机相添加附加剂：

DCM直接与蛋白质药物结合易使蛋白质发生变性。改变有机相的组成可以改善药物的释放性能。溶剂DCM由于本身有毒性而具有一定的危险。相对而言，乙酸乙酯和丙酮毒性则相对较低，是可供选择的比较合适的替代溶剂。它们的水溶性以DCM、乙酸乙酯、丙酮顺序递增。

（c）外水相添加附加剂：

在外水相中添加盐类可以通过改变内外水相渗透压，而改变微球的表观特性，本实验中选择添加NaCl。

3）研究载药量与材料降解对释药行为的影响

通过以上的实验和研究，主要达到以下的目的：

a）溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备，总结出较优的制备配方和方法。 b）添加附加剂使药物更为长效，平稳和高活性的释放。

c）通过研究载药量以及材料亲水性能对微球降解以及释药行为的影响，为今后开展大分子载药微球降解行为研究提供一定的基础。

第2章实验技术和研究方法

2.1 主要实验设备

本实验使用的主要仪器有：扫描电镜（JSM7401）；6010紫外-可见分光光度计（安捷伦上海）；高效液相色谱（LC-10AT）；示差扫描量热仪（DCS 6200 Seiko Instrument）；超声波细胞粉碎机（YJ92-Ⅱ）； Sanyo冻干机；HZS-1水浴振荡器。

2.2 实验药品

微球的制备所需要药物、柠檬酸钠、二氯甲烷、聚乙烯醇（PVA）、成球聚合物材料及其它一些辅助化学试剂。实验中选用的大分子模型药物为溶菌酶（分子量14700），选用的微球成球材料是乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA，各种型号）与聚乙二醇改性聚乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA—mPEG，各种型号）。

2.2.1 溶菌酶

溶菌酶（lysozyme），又称胞壁质酶，化学名：N -乙酰胞壁质聚糖水解酶。本实验中使用的溶菌酶平均分子量14700。溶菌酶的最适温度是50℃ 最适pH 值是6.0，溶菌酶是较耐热的酶在酸性条件下受热稳定，碱性条件下受热不稳定，等电点为11.1，可逆热变性温度一般不高于70℃。

溶菌酶能够水解构成细菌细胞壁成分的多糖胞壁质中N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4 糖苷键，在作用时可观察到溶菌现象，故因、动物此而得名[18]。它存在于人体组织及其分泌物中（如泪水、唾液和尿）组织和植物组织中也都有，尤以鸡蛋的蛋清中含量最多。

溶菌酶具有抗菌、抗病毒和消炎作用，与抗生素复合应用能增强抗生素疗效。它还是人体内的非特异性免疫因子，可提高机体的免疫力，并且与其他阳离子抗菌肽类天然防御因子有很好的协同作用[19]。另外，它本身是一

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种天然蛋白质，能在胃肠道作为营养物质消化、吸收，无毒性，也不在体内残留，是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品。溶菌酶也常用于各种加工食品和饮料中，集药理、保健和防腐等功能于一体。还可用于生物工程研究中的工具酶。

2.2.2 乳酸/羟基乙酸共聚物（PLGA）与聚乙二醇改性聚乳酸/羟基乙酸

共聚物（PLGA-mPEG）通过乳酸和羟基乙酸共聚所得的共聚物（PLGA）[20]，可生物降解剂，无毒。能溶于二氯甲烷，三氯甲烷，丙酮等有机溶剂中，常用作缓释骨架材料、微囊囊膜材料和微球成球材料，在体内能缓慢降解，最终成为水和二氧化碳。PLGA具有良好的安全性、生物相容性和生物降解性，美国FDA己批准用于临床。通常作用的单体为丙交脂和乙交脂，在羟基铝催化剂进行开环缩合，其化学式为：

不同的丙交脂和乙交脂比例，即不同的LA/GA比例可以影响共聚物的结晶度，聚乳酸和聚羟基乙酸都是高度结晶性聚合物，前者的熔点在180℃，玻璃化温度67℃，结晶度在37%左右，后者的熔点在230℃，玻璃化温度36℃，结晶度高达50%。PLGA的降解属水解反应，水解的速率很大程度上取决于共聚单体的配比，共聚物的结晶度均低于各自的均聚物。在等摩尔配比时，共聚物的结晶度最低。

PLGA-mPEG是在PLGA上引入嵌段mPEG。实验中使用PLGA-mPEG为白色透明块状固体，其中PLGA分子量20,000~200,000不等，其中LA/GA的比例有50/50和75/25两种，PEG分子量有3,000与5,000。

第2章实验技术和研究方法

2.2.3 聚乙烯醇（PVA）

本实验中使用的PVA[24]聚合度为1350，醇解度98％，平均分子量66,000 化学结构式：

性状：白色至奶油色无臭颗粒

药用PVA的分子量在30000～200000，平均聚合度n为500～5000。 PVA是一种水溶性聚合物，其物理化学性质与醇解度、聚合度以及结构中的羟基有很大关系。一般PVA溶于热水或冷水中，分子量越大，结晶性越强，水溶性越差，但水溶液的粘度相应增加。其玻璃化温度约为85℃，在100℃开始缓慢脱水，180～190 ℃熔融。

PVA化学结构上可以看成是在交替相隔碳原子上带有羟基的多元醇，可以发生羟基的化学反应，与环氧乙烷、丙稀腈、各种无机酸和有机酸均可反应制得水溶性大分子醚或酯，但与各种饱和或不饱和醛反应大多形成不溶性交联聚合物。由于它由亲水的极性基团和疏水的非极性基团构成，可以使互不相溶的油－水两相，转变为相当稳定难以分层的乳浊液，因此PVA也是常用和理想的乳化剂。

2.2.4 司盘80（Spanum 80）

司盘80，又称去水山梨醇单油酸酯、油酸清凉茶醇、Sorbitan Monooleate。

主要成分：C24H44O6

为去水山梨醇单油酸酯和一部分双去水山梨醇单油酸酯的混合物。琥珀色粘性油状液体；有脂肪臭。不溶于水，但能分散于水，能与乙醇混合。溶于液状石蜡或固定油，但溶液浑浊，微溶于乙醚，不溶于丙酮和丙二醇。HLB值为4.3，是高级亲油型乳化剂。

具有优良的乳化、增溶、分散等性能，用于医药、化妆品、纺织、石油、乳化炸药、油漆、皮革等行业。

实验所用的Span-80为化学纯。

HOH2

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2.2.5 二氯甲烷

二氯甲烷（Methylene chloride）又名亚甲基氯，化学式为CH2Cl2，为无色透明液体，易挥发，较惰性，沸点为40.1℃，有似乙醚气味，相对密度为1.325，溶于苯、氯仿、乙醚，微溶于水。对皮肤粘膜有刺激性，一般有甲烷与氯反应而得。常用作溶剂，脂肪和油的萃取剂，制冷机、灭火剂和麻醉剂。

本实验所用的二氯甲烷为分析纯。 2.2.6 其他

磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，聚乙二醇（PEG1100）、柠檬酸钠等，均为分析纯或色谱纯，溶壁微球菌(Microccus lysodekticus, Sigma，-20℃保存)。

2.3 复乳法制备溶菌酶微球

用复乳法制备溶菌酶微球的方法为将一定质量溶菌酶溶于内水相缓冲体系中。在称取一定量的PLGA 溶于二氯甲烷中作为油相，将内水相加入油相中，用探头超声乳化（功率100W, 32s）。将乳化液倒入40mL PVA乳化剂的水溶液中,用磁力搅拌器搅拌5min。之后迅速将混合液倒入400mL水中，磁力搅拌4h。用0.45μm的微孔滤膜抽滤收集微球，采用冻干方法干燥4h，即可得到微球。

2.4 微球的特性分析方法

2.4.1 微球的收率、包封率和载药量

微球的收率、包封率和载药量是考察微球制备方法的几个重要的参数，主要测定和计算的方法如下：

所得微球的总质量

微球的收率=

投入的溶菌酶的质量+PLGA材料的质量

公式 2-1

第2章实验技术和研究方法

称取一定质量（m）微球，加入CH2Cl2震荡溶解15min，6000rpm离心15min，除去有机溶剂，加入一定量磷酸缓冲溶液，充分溶解后在波长280nm测定吸光度值，在标准曲线下得到溶菌酶的含量m1。试管底部还有以变性的溶菌酶蛋白质，除去上清液后再加入含有6mol/l尿素的磷酸缓冲液，取上清在280nm波长下测定吸光度值，在标准曲线下得到变性的溶菌酶量m2。通过以上两个值求得为求得包封率和载药量[28]：

(m1+m2)×所得微球总质量

包封率=×100%

称取的微球质量×投入的溶菌酶质量

公式 2-2

(m1+m2)

载药量=×100%

称取的微球质量

公式 2-3

2.4.2 表面形态观察

将制备完成的微球，通过扫描电镜进行观察，通过放大200倍可以观察微球粒径大小和球形度，2000倍以上就可以看到微球表面的微球表面的纹理。

2.4.3 微球的粒径分布

微球的粒径大小不一，对于靶向作用的微球很大程度上取决于其粒子大小，对于凝胶体系中的微球对粒径分布没有太高要求，但是分布适当的微球有利于验证制备工艺的优劣，有利于体外释放的平稳。由于微球的粒径对药物释放特性有较大的影响，粒径分布过窄，容易造成某一时间段药物突释；而粒径分布过宽，或不规则分布不仅在凝胶中不宜结合，在注射过程中会给病人增加一定的痛苦，对平稳释放也是不利的。因此对微球粒径分布的要求为大小适中，一定程度的正态分布[29]。

粒径的检测方法有：显微镜法，电子显微镜法，激光散射法和库尔特计数仪法等等，本实验中采用激光散射法，所用激光粒度分析仪（mioro-plus）散射角范围：0.03～135度，4秒钟完成2000次标准信号采集。

粒径分布的表示方法有质量分布、体积分布、数目分布法等。Torrado等采用跨度（Span）评价粒径分布，定义为

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Span=(D90%−D10%)/D50% 公式 2-4

其中D90%、D50%、D10%分别指低于一定百分率的微球粒径，Span越大，粒径的分布越广。

2.4.4 微球的体外释放

药物体外释放实验是评价和发展给药系统有效的研究方法，在实验设计中必须考虑到模拟体内吸收环境、分析方法的灵敏度、释放的重现性、释放介质的选择以及维持“漏槽”状态所需要的介质体积和搅拌速度等诸多因素。释放介质常见有蒸馏水、乙醇、生理盐水、磷酸盐缓冲液等。体外释放方法有静态法、水平振荡法、介质连续流动法、恒速旋转法及微透析法等。考虑到释放药物为具有一定生物活性的大分子，存在活性丧失和蛋白膜吸附作用，无法采用透析的方法，只能采用水平震荡法，将微球直接投入PBS释放介质中。方法如下：

称取20mg微球，置于4mL PBS（0.016mol/l，pH=7.4），置于37℃的水浴中进行体外释放试验，第一天在6h和24h分别取两次释放液，测定酶的活性，以后根据释药的情况调整取样的间隔。每次取样后除去所有的缓冲液，并补充新鲜的缓冲液。

因为每次制备的微球质量有限，改用小管体直接释放的形式，微球直接投入缓冲体系中，每次换液时通过离心除去上清液，并补充新鲜介质。根据微球的载药量（一般<8%），在释放过程中释放液中溶菌酶的浓度<0.2mg/mL，事实证明也远小于这个值，溶菌酶在缓冲液中的溶解度>50mg/mL，小管释放完全符合漏槽条件。

2.4.5 溶菌酶浓度的测量

本实验中溶菌酶的浓度测定主要用其活度换算来表示。溶菌酶活性测量选择舒加法测定。舒加法测定原理是溶菌酶溶解细菌的细胞壁，从而降低细菌悬浊液的浊度，利用分光光度计测定溶液在一定波长下的吸光度变化来测定这一反应。

首先定义F.T.P.溶菌酶单位[[44]]，其相当于在规定条件下于450nm处每分钟使吸光度降低0.001时所需的酶量。在实际操作中，以原始天然活性溶

第2章实验技术和研究方法

菌酶的活性作为测定基准，每次在测量酶活用天然活性溶菌酶校正F.T.P.溶菌酶单位，从而回归出吸光度的降低值。

采用的缓冲体系为Na2HPO4- NaH2PO4磷酸盐缓冲溶液，其pH值为6.24。底物溶液采用磷酸盐缓冲溶液溶解的黄微球菌溶液，以磷酸盐缓冲溶液为参比，调节底物溶液吸光度值在1.30后使用。由于小球菌自身能发生分解，该底物溶液应在配置后一个小时内使用。测活过程中，一般用磷酸盐缓冲溶液将溶菌酶稀释到0.01mg/mL测量吸光度的变化，尽量保证每15s吸光度改变0.01～0.04。

用取液器将2.5mL底物溶液滴入一只1cm比色皿，加0.5mL酶溶液，将这两种溶液充分混合，用分光光度计于450nm处以磷酸盐缓冲液为参比测定吸光度。在大约3min内每隔15s读取一次吸光度。

溶菌酶酶活计算公式如下：

ΔE450

=U/mg

0.001×Ew

公式 2-5

式中：ΔE450——在450nm处每分钟吸光度的变化 Ew——每0.5mL所用酶溶液中含有酶的重量 0.001——一个单位在每分钟内使吸光度下降0.001

每批小球菌均采用一定浓度的溶菌酶标准溶液作为测定基准，再测定样品中溶菌酶的酶活，对比求出样品中溶菌酶浓度。

2. 溶菌酶释放量的计算

配置标准的溶菌酶溶液10mg溶解到10mL的pH值为7.4的Na2HPO4- NaH2PO4磷酸盐缓冲溶液中)，后稀释100倍（0.01mg/mL），舒加法检测其吸光度随时间的变化，得到标准样品斜率k。

舒加法检测样品吸光度随时间的变化，得斜率为k’。根据标准溶菌酶溶液的浓度（0.01mg/mL），计算PBS溶液(4mL)中溶菌酶释放量n(mg)公式如下：

n=*0.01*4

公式 2-6

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2.4.6 材料分子量的测定

材料分子量的测定方法多种多样，常见的两种有是粘度测定法和凝胶色谱法。凝胶侧谱法又称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography GPC）

[37]

，是对不同分子量的分子的分离过程。高分子材料通过合适的过孔渗水

柱时，小分子量的可以进入凝胶住的孔中，大分子量的无法进入，因此较大的分子会比小分子从凝胶住上洗脱的时间更短，不同的分子量就被区别开了。不同的计算方式可以得到不同的平均分子量，摩尔平均分子量和质量平均分子量。

nM∑Mn=

∑n

iii

w∑=

∑wM

公式 2-7

nM∑Mw=

∑nM

2ii

wM∑=

∑w

公式 2-8

式中，ni代表i成分的摩尔数，Mi表示i成分的分子量，wi代表i成分的质量，因此Mn的值很大程度上受小分子的影响，而Mw值受大分子的影响，若材料的分子量分布较广则Mn << Mw。

测量PLGA分子量分布和平均分子量，采用四氢呋喃为流动相和溶剂，材料浓度为1mg/mL，标准分子量聚苯乙烯作为分子量标定。实验中以Mw为主要参考。用荧光分光光度计来测量蛋白的内在荧光。分光光度计的型号

F-2500。一般使用波长扫描，激发光280nm，波长扫描范围250～500nm。

溶菌酶通过波长扫描在 340nm处有较强的荧光发射峰，该发射峰主要是由于包埋在蛋白结构内部的两个色氨酸碱基在280nm的条件下被激发。

该发射峰的高低与酶中受到激发的碱基数量有关，天然活性的溶菌酶三级结构一定，峰高直接与酶的浓度相关。经过一定处理的溶菌酶，三级结构发生改变，包埋在蛋白内部的碱基暴露到分子表面，易受到激发而产生荧光，测得的峰高和位置也将有一定的变化，通过这点可以判断溶菌酶变性情况，是酶稳定性检测的一个重要方面。

第2章实验技术和研究方法

2.4.7 PEG含量测定

PLGA-mPEG在降解过程中释放的mPEG含量用比色法测定。样品（1ml 药物释放介质）用2ml PH7.4,0.1M的PBS稀释并加入75μl用碘饱和的碘化钾溶液（0.02g/ml）。样品用玻璃棒搅拌5min后用紫外分光光度计在500nm处测定吸光度。线性范围是mPEG的浓度为1-15μg/ml。

2.4.8 药物在微球中的分散情况

采用差示扫描量热法（defferential scanning calorimetery DSC）让试样和参比样在程序升温或降温的相同环境中，用温度补偿其测量时两者温度差保持为零所必需热量对温度的依赖关系。通过观察药物和成球材料的吸放热峰，来确定药物和材料存在的形式，有晶体存在则有吸热峰，晶体越多吸热峰面积越大。

高聚物在某一给定温度下的物理性质，特别是力学性质，强烈的依赖其分子链的柔性。因此，对高聚物分子链运动状况的研究，如象聚合物组成结构与分子链运动的关系，以及温度对分子链运动影响的研究,无论在理论上或实用都有其重要的意义。与高聚物聚集态分子链运动伏态有关的玻璃化转变，仍是高分子主链链段在观察的时间范围内来得及自由内旋转的松弛转变过程，因此作为转变特征的玻璃化转变温压自然与分子链的柔性有关。通过对高聚物玻璃化转变的研究，能使我们获得有关高聚物分子链结构与运动的知识，提示我们有关高聚物分子链柔性的概念，以及结构与性能，特别是力学性能间的关系[13]

本实验中溶菌酶的热变性温度70℃左右[31]，而PLGA的玻璃化温度为

50℃左右，因此对溶菌酶微球的DSC升温范围25℃～120℃，升温速率定为5℃/min[29]。

2.4.9 微球表面积及孔径测定

微球的表面积[29]的大小对药物的释放和材料的降解起着很大的作用，通过气体吸附可以测定其比较面积和内部微孔的孔径，它主要是通过样品表面的气体的吸附和脱附作用，测定吸附剂的吸附量，确定表面积。它的优势在于能够测定微球包括细小、曲折的微孔在内的所有表面状况。

本实验中采用氮气为吸附剂，吸附温度为77.5K，绝对压力为33.5atm，脱附材料为活性炭。微球在真空状态下先脱气6个小时以上后进行吸附试验

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和测量，数据直接输入计算机通过BET，BJH和DH三种计算方法计算结果，实验过程中，由于数值较小，采用BJH计算方法取得结果。

2.4.10 微球表面积及孔径测定

材料分子量的测定方法多种多样，常见的两种有是粘度测定法和凝胶色谱法。凝胶侧谱法又称为凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography GPC）

[37]

，是对不同分子量的分子的分离过程。高分子材料通过合适的过孔渗水

Mn=

∑niMi∑n

∑w

∑wi

公式 2-9

Mw=

∑niMi2∑nM

∑wiMi∑w

公式 2-10

式中，ni代表i成分的摩尔数，Mi表示i成分的分子量，wi代表i成分的质量，因此Mn的值很大程度上受小分子的影响，而Mw值受大分子的影采用四氢呋喃为流动相和溶剂，响，若材料的分子量分布较广则Mn << Mw。材料浓度为1mg/mL，标准分子量聚苯乙烯作为分子量标定。实验中以Mw为主要参考。用荧光分光光度计来测量蛋白的内在荧光。分光光度计的型号

F-2500。一般使用波长扫描，激发光280nm，波长扫描范围250～500nm。

溶菌酶通过波长扫描在 340nm处有较强的荧光发射峰，该发射峰主要是由于包埋在蛋白结构内部的两个色氨酸碱基在280nm的条件下被激发。

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

3.1 引言

常见的微球制备方法有相分离法、喷雾干燥法、超临界流体沉淀法、界面聚合法和乳化-溶剂挥发法等。其中，乳化-溶剂挥发法中的复乳法(w/o/w)具有对水溶性药物普适性强、膜材聚合物取材广泛等优点，并且制备条件相对温和，不易使蛋白质发生变性，最常应用于多肽和蛋白质类药物的微包埋。因此，本研究采用复乳法(w/o/w)进行溶菌酶载药微球的制备。

复乳法(w/o/w)制备微球过程中，影响微球特性的制备工艺参数主要包括微球成球材料的种类和用量、药材比、乳化剂浓度、乳化过程中超声的功率和时间、乳化搅拌速度以及溶剂挥发的温度、搅速和时间等等。实验室在前期制备小分子甲氨蝶呤载药微球的研究中，已经考查过乳化过程中超声功率和时间、乳化搅拌速度以及溶剂挥发速度等基本工艺参数对微球制备和性质的影响，并对这些工艺参数进行了优化。本章将在此基础上重点考查微球成球材料的种类和用量、药材比、乳化剂的用量等，来进一步优化蛋白类载药微球的制备过程。因为对于大分子蛋白类载药微球来说，材料与蛋白的相容性非常重要，而且大分子药物的含量对微球的形态以及载体材料的降解均有所影响，从而直接影响到药物的释放情况。而乳化剂PVA的存在，对水溶性药物微球的包封率等性质影响较大。从收率、包封率、载药量、表面形态以及体外释放实验等方面对微球性质进行考查，分析上述三个重要参数对微球的影响作用，并最终确定利于蛋白包载的材料分子量、药材比以及PVA浓度的范围，为后续实验工作的开展奠定基础。

3.2 溶菌酶微球的复乳法制备工艺

采用复乳法(w/o/w)制备聚酯类微球过程中多用二氯甲烷为囊材溶剂，将成球材料如PLGA溶于二氯甲烷中，形成油相。蛋白类药物在缓冲体系中

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溶解，作为内水相，内水相在油相中超声乳化后形成初乳，初乳在高速搅拌情况下加入到乳化剂的水溶液中，形成w/o/w的复乳。油相溶剂在搅拌过程中逐渐向外水相扩散挥发，乳滴开始硬化呈球形，通过过滤或离心并冻干收集得到微球。

复乳法制备溶菌酶微球的过程如图3.1所示：

溶菌酶易溶于水，在水中的溶解度可以达到100mg/mL以上，最适pH 值溶剂中离子浓度较高时，是6.0。溶剂中的离子浓度对酶活性有较大的影响，

酶的构象容易发生改变，析出团聚，形成白色浑浊。因此内水相的缓冲体系为离子浓度0.01M的柠檬酸缓冲液（pH=5.1）,以保证高浓度的酶溶液可以稳定保存。实验中内水相溶菌酶的溶度为75～100mg/mL用量在0.2～0.3mL,使得每一批微球的投药量≥15mg。

油相的囊材溶剂为二氯甲烷，其中加入少量Span-80作为乳化剂，并起到保护酶活性的作用。3mL油相中溶有200mgPLGA-mPEG。

内水相在油相中通过超声乳化，乳化的时间和功率直接影响乳化效果和酶的活性。超声产生的大量热量通过冰浴带走。本文中100W功率超声s（超声4s，间隔2s，共16次）。

油相加到外水相中搅拌乳化，外水相为PVA的水溶液，转速为800rpm，乳化5min。

在溶剂挥发的步骤里，在搅拌的情况下将w/o/w的复乳倒入400mL浓度为0.1%（w/v）的PVA水溶液，搅拌转速为400rpm。搅拌时间为4h，若搅拌时间过长，药物向外水相的扩散量加大，将减小药物在微球中的包封率；若搅拌时间过短，溶剂挥发不完全，一方面影响微球形态，在干燥过程中微球容易破裂和形成褶皱，另一方面也会加大突释。

用0.45μm直径微孔滤膜抽滤上述溶液收集微球，用去离子水冲洗微球

3次以上，将微球置于-55℃，20Pa下冻干。

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

图3.1 复乳法制备溶菌酶微球示意图

3.3 制备工艺参数的调整和优化

3.3.1 制备过程优化实验方案

微球制备工艺参数的优化方案如表3.1所示，采用PLGA-mPEG为主要的微球成球材料，考察该共聚物中PLGA与PEG嵌段的分子量大小和其中乳酸和羟基乙酸的比例以及外水相PVA浓度和药材比对微球特性的影响。

表3.1 微球制备工艺优化方案

Mw（PLGA-mPEG）LA/GA 外水相PVA浓度（w/v）药材比药物投入量/mg 23

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A B C D E F G H I J K L

20,000-3,000 200,000-3,000 A,B 1:1混合 200,000-3,000 200,000-3,000 200,000-3,000 100,000-3,000 200,000-3,000 200,000-5,000 200,000-3,000 100,000-5,000 200,000-3,000

75:2575:2575:2575:2575:2575:2575:2550:5075:2575:2575:2575:25

1% 1% 1% 1.5% 0.5% 1% 1% 1% 1% 1% 1% 1%

1:13 1:13 1:13 1:13 1:13 1:6 1:6 1:13 1:6 1:6 1:6 1:20

15 15 15 15 15 30 30 15 30 30 30 10

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

3.3.2 聚合物材料性质对微球性质的影响

3.3.2.1 LA/GA对微球性质的影响

表3.2 LA/GA对微球性质的影响

实验方案 LA/GA 微球收率/% 包封率/% 平均粒径/μm

B 75/25 74.8 68.1 180 H 50/50 .1 77.3 93

图3.1 B、H组体外释药曲线

LA/GA比例为50/50时，收率与包封率都比较理想，前期释药速度较快，但突释也较为严重。而LA/GA比例为75/25时，在15天内蛋白释放量不到

4%，收率和包封率也相对较低。分析原因如下：提高单体GA比例后，材料的亲水性能有所提高[21]，材料亲水性的增强导致了其在有机溶剂中的溶解度降低,从而使聚合物固化加快,药物渗漏降低; 此外，亲水的聚合物与多肽及蛋白类药物的相互作用更强,更有利于包裹亲水的大分子。需要指出的

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是，LA/GA比例为50/50时，微球粒径也显著变小，这也是导致药物释放较快的因素之一。

可见，适当提高材料中单体GA的比例，更有利于对水溶性蛋白质的包载，并在一定程度上提高释药速率。

3.3.2.2 聚合物中PLGA分子量的影响

表3.3 PLGA分子量对微球性质的影响

实验方案 PLGA-mPEG分子量

微球收率/% 包封率/% 平均粒径/μm

A 20,000-3,000 78.5 B 200.000-3,000 78.1 C A和B1:1混合 83.3

.5 68.1 57.1

48 191 98

图3.2 A、B、C组体外释药曲线

PLGA分子量的改变对微球收率影响不大；不同分子量时，包封率和粒径变化较大。模型药物溶菌酶的分子量为14700，采用与之分子量相近的共聚物材料进行包埋时，药物不易包覆，所得的微球粒径较小。采用相对大分子量的共聚物材料进行包埋时，可以提高药物的包封率。从释药情况来看，

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

虽然随着PLGA分子量的提高，微球的粒径有所提高，但释药情况却无明显差异。材料混合后，释药情况改变较大，前期释药量增大，这可能是由于材料与材料混合不好，与药物之间的相互作用变弱。因此对于溶菌酶来说，选择较高分子量的材料进行包载效果更好。

3.3.2.3 PEG分子量的影响

表3.4 PEG分子量对微球性质的影响

实验方案 PEG分子量微球收率/% 包封率/% 平均粒径/μm

I 5,000 84.4 80.2 188 J 3,000 68.4 74.4 192

图3.3 I、J组体外释药曲线

嵌段PEG分子量的提高，使得材料的亲水性提高，因此微球的收率和包封率均有所提高，但对微球粒径的影响不是很大。从释药情况来看，

PEG分子量较大时，制备的微球释药量较大，而且还有不断增加的趋势，可以达到长效缓释的目的。

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3.3.3 药材比的影响

表3.5 药材比对微球性质的影响

实验方案药材比微球收率/% 包封率/% 平均粒径/μm

F 1:6 78.1 67.9 147 B 1:13 78.2 68.1 191 L 1:20 75.5 81.0 163

图3.4 F、B、L组体外释药曲线

从实验结果看，药材比对微球的收率影响不大，对包封率影响较大。药材比越高，水溶性蛋白向外水相扩散的比例也越高，因此包封效果越差。但从释药情况分析，药材比越低，药物释放速率越低，当药材比低至1：20时，虽然微球的包封率较高，但在15天内几乎没有蛋白释放。这很可能是由于药材比较低时，聚合物材料对整个体系比例较大，有助于形成密实的内部形态，而使药物不易释放。而当药材比为1：6时，释药速率有所提高，有望实现长效缓释。

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

在实际微球制备过程中，载药量高时，能有效减少给药时载体材料的用量，但也容易导致药物的包封率过低，容易造成药物的浪费，对于价格较高的大分子蛋白药物，不符合经济性原理。载药量低时，药物的包封率能得到一定程度的提高，但给药时微球的用量就要相应提高。因此，也要结合实际需要选取合适的药材比例。

3.3.4 外水相浓度的影响

表3.6 外水相浓度对微球性质的影响

实验方案 PVA浓度微球收率/% 包封率/% 平均粒径/μm

E 0.5% 71.4 72.6 248 B 1% 78.2 68.1 191 D 1.5% 78.1 .8 260

图3.5 E、B、D组体外释药曲线

外水相乳化剂PVA浓度改变对微球收率影响不大，对包封率和微球粒径影响较大。随着PVA浓度的升高，微球的包封率逐渐降低。PVA的浓度

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过小时乳化效果差，影响微球形态的圆整性，适当增加外水相浓度可以减少微球的粒径；但进一步增加外水相浓度时，获得的微球粒径反而增加。粒径较大的微球初期释放量较大，选择适当大小的PVA浓度可以减少初期释放量。

3.4 PLGA-mPEG微球与PLGA微球比较

表3.7 PLGA-mPEG微球与PLGA微球比较

方案材料收率/% 包封率/%

A PLGA 66．4 82．8

50:50,200,000

B PLGA-mPEG 66．9 82．0

50:50,200,000-5,000

图3.6 PLGA-mPEG微球与PLGA微球释药曲线

从表3.7可以看出，用相同PLGA分子量的两种材料制备的微球收率以及包封率没有太大差别。但是释药情况差别较大，使用PLGA制备的微球

第3章溶菌酶PLGA-mPEG微球的制备

初期药物释放量较大，缓释效果差，而且累积药物释放百份含量比较低，相对而言，PLGA-mPEG制备的微球，突释情况有所缓解，药物释放也比较快，缓释时间可达2周左右。这一结果说明PLGA-mPEG作为微球载体材料，在实现药物缓释功能方面具有比PLGA更好的优势。

3.5 本章小结

1、由于实验中使用的是大分子蛋白，因此材料与药物相容性是影响微球性能的重要因素，由实验结果也发现了材料的性质对微球性能影响最大，故在本章实验中重在选择合适的材料来包裹药物。实验结果显示，采用LA/GA为50/50时，PLGA分子量为20,000,PEG分子量为

5,000的材料PLGA-mPEG作为载体材料时，微球的收率、包封率，以及释放情况均较为理想，故在后期实验中选择该材料来包裹药物； 2、外水相乳化剂PVA的浓度对溶菌酶微球的包封率影响较大。外水相用1%的PVA浓度有利于药物的包封，高于1%或低于1%时，得到的微球性质均不理想；

3、药材比对溶菌酶微球的释药情况影响较大。当药材比较低时，虽然包封率较高，但是存在释药速度过慢的情况；药材比较大时，药物释放速率较高并可以实现药物的缓释；

4、将优化后的溶菌酶PLGA-mPEG微球与溶菌酶PLGA微球对比，采用PLGA-mPEG作为载体材料时，虽然在改善收率、包封率方面没有较大作用，但是前者可以显著提高药物的释放率并且有效的降低了突释，达到一定程度的缓释效果。

第4章附加剂添加对微球性能影响

4.1 引言

PLGA-mPEG亲水性与生物相容性优于PLGA，第三章中用复乳法制得的溶菌酶PLGA-mPEG微球虽然可以在一定程度起到缓释作用，但运载蛋白质、多肽等药物时，在生物介质中，扩散速度快，难以实现长效缓释。复乳法制备水溶性蛋白的载药微球时，内水相与外水相的融合是造成微球形成过程中包封的蛋白质损失的主要因素。一般来说，蛋白质的包封率受以下因素影响：1）w/o和w/o/w乳化液的稳定性；2）溶剂移除速度；3）聚合物、药物、溶剂和附加剂之间的相互作用；4）粒径大小。而且，若蛋白质在微球制备过程中，在油水界面聚集变性是造成其失活的主要原因，不仅其生物活性降低，在体内释放不完全，还会引起免疫反应，应尽可能避免。

在本章中，为了解决这些问题，我们仍以溶菌酶为药物模型,应用复乳油相、外水相中添加附加剂法制备溶菌酶PLGA—mPEG微球,探讨内水相、

对溶菌酶微球包封率、溶菌酶活性的保护及微球释药特性的影响。

4.2 附加剂的选择

4.2.1 内水相中添加附加剂PEG/O-CMC

研究表明，在内水相添加一定量的亲水性大分子附加剂，可以有效的维持蛋白活性，降低微球的突释。附加剂保护蛋白活性原因可能在于它们对蛋白质的两种稳定机制：一种是附加剂以各种作用(疏水作用、氢键)代替蛋白质水化层，增大了药物溢出的阻力，起到保护作用，比如在内水相添加海藻酸钠；另一种是附加剂分子优先吸附于油水界面，减少了蛋白质与疏水界面的相互作用。本实验将重点考查两种亲水性附加剂聚乙二醇(PEG)以及羧甲基壳聚糖(O-CMC)对蛋白类微球活性包封率，体外释放的影响。PEG是一种常见的蛋白保护剂，可以提高蛋白质自身的稳定性。而O-CMC是壳聚糖的衍生物，能溶于水，而壳聚糖只能溶于稀酸，因此对O-CMC对水溶性蛋白

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质活性的保护要优于壳聚糖。此外，本实验中考虑添加O-CMC，还因为它可以改变内水相粘度来改善乳化效果，以获得高质量的微球。内水相的粘度通常也是包封率的影响因素,内水相的粘度越高,包封率也就越高,可能是因为提高了初乳的稳定性。

4.2.2 油相中添加乙酸乙酯（EA）/丙酮（ACE）

第三章中使用DCM作为有机溶剂，一方面DCM直接与蛋白质药物结合易使蛋白质发生变性。改变有机相的组成可以改善药物的释放性能。

本实验中使用的溶剂DCM由于本身有毒性而具有一定的危险。相对而言，乙酸乙酯和丙酮毒性则相对较低，是可供选择的比较合适的替代溶剂。而且，有机溶剂的水溶性对微球固化有影响：有机溶剂水溶性越强，在分散相和连续相之间转移越快，从而加快聚合物材料的固化速度，使得微球的包封率得到提高。实验所选用的三种有机溶剂，水溶性以DCM，乙酸乙酯，丙酮顺序递增。

4.2.3 外水相中添加盐类

在外水相中添加盐类可以通过改变内外水相渗透压，而改变微球的表观特性，本实验中选择添加NaCl。

4.3 实验方案

4.3.1 内水相中添加PEG/O-CMC

内水相中添加附加剂实验方案如表4.1所示。考查PEG的含量分别为

2%，6%，10%,O-CMC的含量分别为2%，0.4%，0.08%的情况。

表4.1 内水相中添加附加剂实验方案

方案

内水相添加附加剂

PEG/%（w/v） O-CMC/%（w/v）

A 2 B 6 C 10 D 2 34

第4章附加剂添加对微球性能影响

E 0.4 F 0.08 X

4.3.2 油相中添加EA/ACE

油相中添加附加剂实验方案如表4.2所示。考查ACE的体积含量分别为70%，30%，10%,EA的含量分别为50%，80%，100%的情况。

表4.2 油相中添加附加剂实验方案

方案

油相中添加附加剂

ACE%（v/v） EA%（v/v）

G 70 H 30 I 10 J 50 K 80 L 100

4.3.3 外水相添加盐类NaCl

外水相中添加附加剂实验方案如表4.3所示。考查NaCl质量含量分别为1.2%，0.9%，0.6%的情况。

表4.3 外水相中添加附加剂实验方案

方案

外水相中添加附加剂 NaCl/%（w/v）

M 1.2 N 0.9 O 0.6

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4.4 结果与讨论

4.4.1 附加剂对包封率影响

PEG和O-CMC对包封率的影响明显不同。本实验数据显示，当使用复乳法制备时，PEG会降低LZ的包封率，而O-CMC可以提高包封率，尤其是选择适宜的O-CMC浓度0.4%包封率提高最大（表4.4）。这是由于PEG是亲水性较强，内水相中，有它的存在时，会加速内外水相的融合而造成微球形成过程中蛋白质损失，虽然说它在一定程度上可以保持蛋白活性，但在本实验的条件下显然是前者起了主导作用，最后导致包封率下降。而O-CMC粘性比较大，内水相中它的存在可以减少本实验中的水溶性的模型蛋白LZ向外水相流动而提高了包封率。

有机溶剂对包封率的影响也十分复杂。当使用丙酮含量为70%或纯乙酸乙酯作为有机溶剂时，都无法成球。实验过程中发现，前者是由于丙酮的水溶性而导致乳化失败，而后者是因为乙酸乙酯粘度过大，在乳化过程中产生絮凝现象而导致成球失败。丙酮的含量低至10%时，对包封率的提高十分明显。乙酸乙酯对包封率的改变对包封率的改变相对于丙酮而言不那么明显，但从实验数据可以发现还是略有提高的（表4.5）。可见只有选择合适的丙酮

/乙酸乙酯浓度才可以获得较高的包封率。外水相中NaCl的添加对包封率的改善不大。

表4.4 内水相附加剂对包封率的影响

方案 X

内水相附加剂及含量/%（w/v）

包封率/%

无 82.0 A PEG2% 76.2 B PEG6% 75.0 C PEG10% 71.1 D O—CMC2% 87.7 E O—CMC0.4% 93.7 F O—CMC0.08% 87.3

第4章附加剂添加对微球性能影响

表4.5 有机相附加剂对包封率的影响

方案 X

内水相附加剂及含量/%（v/v）

包封率/%

无 82.0 G ACE /70 不成球

H ACE/30 72.9 I ACE/10 92.5 J EA/50 71.1 K EA/80 87.8 L EA/100 不成球

表4.6

方案 X

外水相附加剂对包封率的影响

包封率/%

外水相附加剂及含量/%（w/v）

无 82.0 M 1.2 75.6 N 0.9 81.1 O 0.6 79.7

4.4.2 附加剂对微球表面形态与粒径大小影响

内水相中添加PEG/O-CMC会使产生的微球粒径变小。本实验结果显示

2%的PEG含量不足以使它发挥这个功效。事实上，添加2%的PEG得到的微球表面及内部甚至比未使用PEG时孔隙率降低。将PEG的比率提高至

10%时，微球表面及内部的孔隙率得以显著提高。而随着O-CMC含量增加，孔隙减少。对微球形态的影响正好相反。它的含量低至2%时，反而会形成的孔比高浓度时高，这可能是由于高浓度的这种附加剂可以提高微球内部的粘度，减缓外水相水的流入。

有机相中添加丙酮时，对微球粒径改变不大；相比聚合物而言，溶剂对微球性质的影响主要取决于溶剂的挥发速度。微球的固化本质上来说可分为两部分：溶剂萃取后是溶剂挥发。在这两个步骤中，溶剂的性质都起到了关键作用。溶剂在水中的溶解度决定了它的萃取速度，而他的挥发速度由它的沸点决定。一般来说，萃取速度快表明它在水中的溶解度大，挥发速度快则

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表明其沸点较低，这些都会使微球固化速度加快。因此，聚合物液滴不易破乳而形成更大的微球。根据溶解度和沸点，溶剂丙酮，乙酸乙酯，DCM的萃取速度递减：而DCM的挥发速度在本实验中是最快的。本实验中，将乙酸乙酯和丙酮以不同比率和DCM混合。图4.3所示为乙酸乙酯或丙酮的含量增加时，所得微球的粒径减小。这些表明溶剂挥发速度直接影响微球粒径。我们可以推断出，在本实验条件下，溶剂挥发在溶剂移除过程中起决定作用。挥发速度快，微球固化加快，表面光滑，内部结构致密；而挥发速度较慢时，微球内部可能由于溶剂快速挥发导致聚合物液滴内部局部破裂而形成多孔和粗糙表面的微球。因此，溶剂对微球形态改变是十分复杂的。添加乙酸乙酯，产生的微球表面都比较光滑。当使用70%水溶性的丙酮作为溶剂时，无法产生微球。而其他比例的丙酮与DCM,则有可能产生较粗糙的表面。

外水相中添加盐类，由扫描电镜照片可见，外水相盐浓度对微球形貌具有较大影响。随着外水相盐浓度的增大，微球表面突起由细小颗粒状向粗糙树枝状转化，外水相盐浓度越大，微球表面突起分布越疏松。

图4.1 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）

A- 不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球 B- 内水相添加2%PEG的PLGA-mPEG微球

第4章附加剂添加对微球性能影响

C- 内水相添加6%PEG的PLGA-mPEG微球 D- 内水相添加10%PEG的PLGA-mPEG微球

图4.2 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）

A-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球 B-内水相添加2%O-CMC的PLGA-mPEG微球 C-内水相添加0.4%O-CMC的PLGA-mPEG微球 D-内水相添加0.08%O-CMC的PLGA-mPEG微球

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图4.3 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）

A-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球 B-有机相添加30%ACE的PLGA-mPEG微球 C-有机相添加10%ACE的PLGA-mPEG微球 D-有机相添加50%EA的PLGA-mPEG微球 E-有机相添加80%EA的PLGA-mPEG微球

第4章附加剂添加对微球性能影响

图4.4 有机相添加附加剂微球表面形态（放大2500倍）

A-添加ACE的PLGA-mPEG微球 B-添加EA的PLGA-mPEG微球

图4.5 外水相添加不同浓度NaCl低倍下微球表面形态（放大60倍）

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A-外水相添加1.2%NaCl的PLGA-mPEG微球 B-外水相添加0.9%NaCl的PLGA-mPEG微球 C-外水相添加0.6%NaCl的PLGA-mPEG微球

图4.6 外水相添加不同浓度NaCl高倍下微球表面形态（放大2500倍）

A-外水相添加1.2%NaCl的PLGA-mPEG微球 B-外水相添加0.9%NaCl的PLGA-mPEG微球 C-外水相添加0.6%NaCl的PLGA-mPEG微球

4.4.3 附加剂对溶菌酶微球体外释放影响

内水相中添加PEG/O-CMC时，有助于提高药物的释放率，添加10%的

PEG可以使药物释放至90%，但相对而言前期释放过快。添加6%PEG既可以提高释放率又可以达到2周左右的缓释。添加O-CMC的效果不是很好，可能是由于它的粘度过大，阻碍了药物的释放。

第4章附加剂添加对微球性能影响

由于有机溶剂对微球的很多性质，譬如粒径大小、形态和包封率的影响较复杂，而药物的体外释放实际上受到以上性质的影响，因此溶剂对LZ的体外释放影响更加复杂。溶剂配比变化时，释放速度没有显著变化。因此我们认为通过改变溶剂混合比率来控制释放速率并非明智的选择，尽管如前面所讨论的那样，生物相容性、粒径大小、形态、包封率等微球的性质可以通过选择适当的溶剂配比来改进或调整。

制备微球时通过增加外水相盐浓度能够加快微球的蛋白质释放速度，这是由于：首先，外水相NaCl浓度可影响复乳液滴内外水相渗透压差，由于外水相盐浓度增加，渗透压增大，内水相中的水会进人外水相，使内水相小液体积缩小，形成小粒径的微球。对于小粒径微球，药物扩散的路径缩短，而且由于其具有较大的比表面积，使得药物的扩散速度加快。第二，外水相

NaCl浓度升高，油相粘度增加速度减慢，延长了油相达到凝胶状态的时间，由此内水相小液滴之间发生碰撞的机会增多，易于相互融合，有利于油相中聚合物之间形成较为疏松的结构。第三，制备微球时，外水相中NaCl可能沉积于微球中。在药物释放过程中，盐帮助微球吸水溶胀，从而有利于增加蛋白的释放与扩散速度。因此增加外水相盐浓度可以明显加快微球的释药速度。

图4.7 内水相添加PEG对微球体外释药的影响 A-内水相添加2%PEG的PLGA-mPEG微球 B-内水相添加6%PEG的PLGA-mPEG微球 C-内水相添加10%PEG的PLGA-mPEG微球 D-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球

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图4.8 内水相添加O-CMC对微球体外释药的影响 X-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球 D-内水相添加2%O-CMC的PLGA-mPEG微球 E-内水相添加0.4%O-CMC的PLGA-mPEG微球 F-内水相添加0.08%O-CMC的PLGA-mPEG微球

图4.9 有机相添加ACE/EA对微球体外释药的影响 X-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球

第4章附加剂添加对微球性能影响

A-有机相添加30%ACE的PLGA-mPEG微球 B-有机相添加10%ACE的PLGA-mPEG微球 C-有机相添加50%EA的PLGA-mPEG微球 D-有机相添加80%EA的PLGA-mPEG微球

图4.10 外水相添加NaCl对微球体外释药的影响 X-不添加任何附加剂的PLGA-mPEG微球 A-外水相添加1.2%NaCl的PLGA-mPEG微球 B-外水相添加0.9%NaCl的PLGA-mPEG微球 C-外水相添加0.6%NaCl的PLGA-mPEG微球

4.5 本章小结

在本章中，我们研究了附加剂对蛋白类药物LZ微球的影响。研究发现，在内水相中添加PEG/O-CMC，有机相中添加EA/ACE，外水相添加NaCl，会大大改变微球的性质和释药行为。

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1．在内水相添加亲水性较强的PEG，可以有效维持蛋白的活性，同时会导致微球孔隙增多，加速水相向微球内部的侵入，从而加快蛋白的释放速率。但PEG的强亲水性，也会导致内外水相的融合而造成微球形成过程中蛋白质损失，使得包封率下降；而在内水相添加具有一定粘度的O-CMC，可以减少本实验中的水溶性的模型蛋白LZ向外水相流动，从而提高了材料对蛋白药物的包封。但由于粘度较大，影响了乳化效果，微球的释药速率明显下降。因此从本实验结果来看，单独添加这两种附加剂，对微球的性质和释放行为的调节均不是很理想。今后的实验工作开展将考虑将PEG和O-CMC同时添加，来考查对微球释药行为的影响；

2．在油相中添加亲水性不同的有机溶剂，可以在微球制备过程中，对微球的性质产生影响，进而影响微球的释放情况。实验发现，溶剂的粘度对微球制备过程中的乳化效果影响很大。因此，油相附加剂的添加只能在一定范围内才能获得形态较为理想的微球。在一定附加剂添加浓度范围内，附加剂的溶解度以及挥发速度是影响微球性质的主要因素。溶剂的溶解度越大，挥发速度越快，微球固化加快，表面光滑，内部结构致密；反之则形成多孔和粗糙表面的微球。从释药曲线来看，油相添加EA或ACE后，微球的释放速率均有所降低，这也是由于二者的存在使有机相挥发速度提高，制备的微球表面更加致密所致；但改变EA或ACE的添加比例，对微球的蛋白质释放调节范围不是很大。因此本研究中所选用的EA或ACE作为油相添加剂，也不是很理想的改善大分子溶菌酶微球释药行为的手段；

3．在外水相添加不同浓度的NaCl，可以有效调节溶菌酶微球的释药行为，而且在本实验所选用的NaCl浓度范围内，对微球的包封率以及收率影响都不大，只是对微球的表面形态有所影响：外水相盐浓度越大，微球表面突起分布越疏松。当外水相盐浓度增大至1.2%时，蛋白的释放率会显著提高，但药物初期释放速度过快，而当添加的盐浓度为

0.9%时，虽然蛋白释放率但缓释效果较好，可达21天。因此是一种较好的加快微球释药速率的途径，可以通过选择适当的外水相NaCl添加比例，达到所期望的药物释放速率。

第5章材料降解对微球释药行为影响考查

5.1 引言

一般来说，材料的降解是调节药物释放速率的主要因素，对材料降解行为和降解速率的控制可以影响控释系统的药物释放行为和释放速度。材料的理化性质如分子量、材料聚合物比例、结晶度等是与降解行为有关的重要参数。生物可降解性高分子的降解机制主要有两种，一种为主体溶蚀降解，另一种为表面溶蚀降解，降解为化学反应，由高分子化学键断裂所造成。而溶蚀为一种物理现象，主要依赖溶解以及扩散的速率来决定。聚酯类材料主要以主体溶蚀降解为主。聚酯材料载药微粒在制备过程中会形成多孔结构，体外释放实验中，材料的降解为水解反应，与酶反应无关。

但是材料的降解并不是决定药物释放速率的唯一机制，药物同时从微球固化过程中形成的孔隙中实现扩散控制的释放。尤其对大分子药物来说，药物的理化性质如溶出速度、结晶度、药物在载体内的分布状态、载体的载药量、孔隙及孔隙率以及粒径等均对药物的释放行为起着重要的作用。

本章在制备溶菌酶PLGA-mPEG微球的基础上，重点考查不同材料亲水性和不同载药量时的微球降解行为以及对微球释药的影响。

5.2 实验方案

表5.1 释药行为考查实验方案

批次材料载药量/mg 药材比

A PLGA-mPEG 0 0

50:50 20万-5000-B PLGA-mPEG 15 1:13

50:50 20万-5000

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C PLGA-mPEG 30 1:6

50:50 20万-5000

D PLGA 50:50 0 0

20万

E PLGA 50:50 30 1:6

20万

对A、B、C、D四批微球进行释放，每隔一周取一次样。过滤并冻干微球后，比较释放前后重量损失情况和分子量变化，观察微球表面形态。

5.3 结果与讨论

5.3.1 微球释药前的表面形态

图5.1 不同载药量微球释药前表面孔隙

A- 空白PLGA-mPEG微球

第5章材料降解对微球释药行为影响考查

B- 药材比为1:13的PLGA-mPEG微球 C- 药材比为1:6的PLGA-mPEG微球

由图5.1可以看出，药材比较高时所制备的微球，表面孔隙较多，而且微球的载药量较高。这是因为药材比增加时，相对的聚合物比例将减少，这就使得药物蛋白在微球固化过程中向微球表面转移成为可能，并形成较大的空洞。

5.3.2 微球释药前的DSC分析

表5.2 不同材料及微球玻璃化温度

PLGA-mPEG

空白

1:6 MP 51.9

1:13 MP 51.5

PLGA PLGA

55.7

51.9

50.4

50.5

Tg/oC

图5.2 不同载药量微球DSC分析

从DSC分析可以看出(表5.2），在材料PLGA中引入亲水性片断PEG后，玻璃化温度降低了5度，这说明材料分子链柔性增加，结晶性降低，在药物释放时材料更容易降解。

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材料PLGA在制备成球后，玻璃化温度降低了将近4度，而PLGA-mPEG却几乎没有变化。而且由图5.2我们可以看到空白球与载药球，热分析曲线，峰值与曲线形状基本一致，这表示材料与药物融合情况较好；改变不同的药材比例，材料的Tg变化也不大，说明大分子蛋白在微球制备过程中对

PLGA-mPEG材料的物理形态影响不大。

5.3.3 材料降解行为研究

表5.3 微球质量/mg随释药时间变化

批次微球质量/mg随释药时间变化

0 5D 10D 15D

A 40 31.6 30.2 29.4 B 40 36.3 36.1 35.0 C 40 33.5 32.5 31.5 D 40 33.3 32.5 32.0 250000200000150000100000 ABCD0246810121416 50000 0 图5.3 材料分子量下降曲线 A- 空白PLGA-mPEG微球

B- 药材比为1:13的PLGA-mPEG微球 C- 药材比为1:13的PLGA-mPEG微球 D- 空白PLGA微球

第5章材料降解对微球释药行为影响考查

表5.4 材料降解曲线拟合后参数

批次

kdegr

A 0.0187 0.9829 B 0.0197 0.9906 C 0.0243 0.9651 D 0.015 0.9995

图5.4 载药微球PEG释放曲线

据文献报道，PLGA材料降解符合公式[47]

Mw(t)=Mwexp(−kdegrt) 其中kdegr代表材料降解速率

公式 5-1

根据上述公式对图4.3的四条曲线拟和得到表5.4

实验结果显示，在本实验考查的释药阶段，微球的表面形态没有明显变化,微球的质量几乎没有流失；在本实验的取样间隔内，材料的降解是从一

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开始就开始的，主要发生的酯键断裂并不影响原有的状态和重量。这一实验结果证明PLGA-mPEG材料是遵循主体溶蚀降解过程的。

由表5.4结果显示，PEG的引入，材料的降解速度加快，这与文献报道的亲水性片断引入可以加快降解溶蚀作用是相符合的。此外，对于

PLGA-mPEG微球而言，随着载药量增加，初期材料降解速率增加，这可能是由于制备的微球表面及内部孔隙较多，释放介质可以进入微球内部，材料溶蚀降解加快，这也是加速高载药量微球初期释放速率的原因。而且由图

5.4显示，载药量高的微球，PEG释放速率也比较快。

5.3.4 不同载药量微球释药行为

图5.5 不同载药量微球释药曲线

B-药材比为1:13的PLGA-mPEG微球 C-药材比为1:6的PLGA-mPEG微球

第5章材料降解对微球释药行为影响考查

图5.6 不同亲水性材料制备的微球释药曲线

由释药曲线可以看出，蛋白载药量的增加会加快初期释药速率。而药物蛋白在这些区域的扩散已经不受聚合物控制。随表面相关蛋白的洗脱产生的水性通道使随后微球内部的蛋白易被洗脱，通过这些通道结构的帮助，可使较高的蛋白载药量产生较高的初期释放速率。但在平稳期两者的释药速率差别不大，此时药物蛋白的释放速率主要受材料的主体降解溶蚀来控制。因此可以认为载药量对药物初期释放速度影响较大，而对于中后期药物释放影响不大。微球释药后期主要受材料降解所控制，分析释药曲线，载药量高的微球释药速率要快于载药量较低的微球，这与材料的降解行为是一致的。

5.4 本章小结

本章主要讨论了载药量与材料的降解对释药行为的影响。结果表明：材料PLGA-mPEG与药物结合情况比PLGA好，前者在制备成载药微球后，材料晶形基本没有发生改变。

载药量不同的微球药物初期释放速率差别较大，载药量高时，初期释放速率较大，这一方面是由于这是因为药材比增加时，相对的聚合物比例将减少，这就使得药物蛋白在微球固化过程中向微球表面转移成为可能，并形成较大的空洞，而药物蛋白在这些区域的扩散已经不受聚合物控制。随表面相关蛋白的洗脱产生的水性通道使随后微球内部的蛋白易被洗脱，通过这些通

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道结构的帮助，使较高的蛋白载药量产生较高的初期释放速率；另一方面，高载药量微球表面及内部孔隙较多，释放介质可以进入微球内部，材料溶蚀降解加快，载药量越高，材料初期降解越快，进一步加快了药物释放。但两者在稳定释放期释药速率差别不大，此时药物蛋白的释放速率主要受材料的主体降解溶蚀来控制。

在本章实验考查的时间内，微球的表面形态没有很大的变化;微球的质量几乎没有流失。材料的降解是从一开始就开始的，这一实验结果再次证明

PLGA-mPEG材料是遵循主体溶蚀降解过程的。PEG的引入，材料的降解速度加快，这与文献报道的亲水性片断引入可以加快降解溶蚀作用是相符合的。

可见，材料的亲水性与载药量对微球的释药行为，尤其是初期释放速率影响较大，选择适当的材料与载药量可以调节释药速率。

第6章结论和建议

6.1 结论

1、采用复乳法制备PLGA-mPEG微球，与PLGA微球相比，药物释放率显著提高并且达到更好的缓释效果；采用LA/GA为50/50时，

PLGA分子量为20,000,PEG分子量为5,000的材料PLGA-mPEG时，收率，包封率，释放情况较为理想，故在后期实验中选择该材料来包裹药物。外水相用1%的PVA浓度有利于药物的包封。

2、在内水相中添加PEG/O-CMC，有机相中添加EA/ACE，外水相添加NaCl，会大大改变微球的性质和释药行为。在内水相添加亲水性较强的PEG，可以有效维持蛋白的活性，加快蛋白的释放速率。但PEG的强亲水性，也会导致内外水相的融合而造成微球形成过程中蛋白质损失，使得包封率下降；而在内水相添加具有一定粘度的O-CMC，可以减少本实验中的水溶性的模型蛋白LZ向外水相流动，从而提高了材料对蛋白药物的包封。但由于粘度较大，影响了乳化效果，微球的释药速率明显下降。在油相中添加亲水性不同的有机溶剂，可以在微球制备过程中，对微球的性质产生影响，进而影响微球的释放情况。实验发现，溶剂的粘度对微球制备过程中的乳化效果影响很大。因此，油相附加剂的添加只能在一定范围内才能获得形态较为理想的微球。在一定附加剂添加浓度范围内，附加剂的溶解度以及挥发速度是影响微球性质的主要因素。溶剂的溶解度越大，挥发速度越快，微球固化加快，表面光滑，内部结构致密；反之则形成多孔和粗糙表面的微球。从释药曲线来看，油相添加EA或ACE后，微球的释放速率均有所降低，这也是由于二者的存在使有机相挥发速度提高，制备的微球表面更加致密所致；但改变

EA或ACE的添加比例，对微球的蛋白质释放调节范围不是很大。因此本研究中所选用的EA或ACE作为油相添加剂，也不是很理想的改善大分子溶菌酶微球释药行为的手段；在外水相添加不同浓度的NaCl，可以有效调节溶菌酶微球的释药行为，而且在本实验所选用的NaCl浓度

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范围内，对微球的包封率以及收率影响都不大，只是对微球的表面形态有所影响：外水相盐浓度越大，微球表面突起分布越疏松。当外水相盐浓度增大至1.2%时，蛋白的释放率会显著提高，但药物初期释放速度过快，而当添加的盐浓度为0.9%时，虽然蛋白释放率但缓释效果较好，可达21天。因此是一种较好的加快微球释药速率的途径，因此可以通过选择适当的外水相NaCl添加比例，达到所期望的药物释放速率。

3、材料的亲水性与载药量对微球的释药行为，尤其是初期释放速率影响较大，选择适当的材料与载药量可以调节释药速率。

6.2 建议

本课题以PLGA-mPEG为载体材料包裹大分子蛋白类药物溶菌酶，实现模型药物的长效缓释给药。可以有效避免了药物突释，缓释时间长，释放率高，释药平稳，在保护大分子药物的活性上也起到较好的作用。

在今后的进一步研究工作中，还应注意以下几个方面：

1、实验发现，用于小管体释放实验的微球质量由20mg增加为40mg时，平行样间误差显著减小，释药情况也略有改善。在以后的工作中考虑增加用于释药的微球质量，考查释药情况是否仍有改善；

2、本实验中，添加附加剂时，考查的浓度范围较宽，在以后的工作中考虑继续缩小浓度调节范围，以得到更准确的结论；

3、从本实验结果来看，单独添加PEG和O-CMC，对微球的性质和释放行为的调节均不是很理想。今后的实验工作开展将考虑这两种附加剂同时添加或选择添加其它亲水性不同的材料来考查对微球释药行为的影响；

4、降解实验时间较短，而且对降解的研究比较表面，仅考察了分子量、PEG释放的变化，在今后的工作中，考虑从微球内部形态变化进一步来考查材料的降解。

插图索引

图3.1 复乳法制备溶菌酶微球示意图............................................................1 图3.1 B、H组体外释药曲线..........................................................................1 图3.2 A、B、C组体外释药曲线...................................................................1 图3.3 I、J组体外释药曲线............................................................................1 图3.4 F、B、L组体外释药曲线....................................................................1 图3.5 E、B、D组体外释药曲线...................................................................1 图3.6 PLGA-mPEG微球与PLGA微球释药曲线......................................1 图4.1 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）...........................1 图4.2 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）...........................1 图4.3 PLGA-mPEG微球的扫描电镜图（放大250倍）...........................1 图4.4 有机相添加附加剂微球表面形态（放大2500倍）..........................1 图4.5 外水相添加不同浓度NaCl低倍下微球表面形态（放大60倍）...1 图4.6 外水相添加不同浓度NaCl高倍下微球表面形态（放大2500倍）1 图4.7 内水相添加PEG对微球体外释药的影响..........................................1 图4.8 内水相添加O-CMC对微球体外释药的影响....................................1 图4.9 有机相添加ACE/EA对微球体外释药的影响...................................1 图4.10 外水相添加NaCl对微球体外释药的影响.........................................1 图5.1 不同载药量微球释药前表面孔隙........................................................1 图5.2 不同载药量微球DSC分析..................................................................1 图5.3 材料分子量下降曲线............................................................................1 图5.4 载药微球PEG释放曲线......................................................................1

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图5.5 不同载药量微球释药曲线.....................................................................1 图5.6 不同亲水性材料制备的微球释药曲线.................................................1

表格索引

表3.1 微球制备工艺优化方案........................................................................1 表3.2 LA/GA对微球性质的影响...................................................................1 表3.3 PLGA分子量对微球性质的影响........................................................1 表3.4 PEG分子量对微球性质的影响...........................................................1 表3.5 药材比对微球性质的影响....................................................................1 表3.6 外水相浓度对微球性质的影响............................................................1 表3.7 PLGA-mPEG微球与PLGA微球比较..............................................1 表4.1 内水相中添加附加剂实验方案............................................................1 表4.2 油相中添加附加剂实验方案................................................................1 表4.3 外水相中添加附加剂实验方案............................................................1 表4.4 内水相附加剂对包封率的影响............................................................1 表4.5 有机相附加剂对包封率的影响............................................................1 表4.6 外水相附加剂对包封率的影响............................................................1 表5.1 释药行为考查实验方案........................................................................1 表5.2 不同材料及微球玻璃化温度................................................................1 表5.3 微球质量/mg随释药时间变化.............................................................1 表5.4 材料降解曲线拟合后参数....................................................................1

III

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致谢

感谢我的导师丁富新教授在我从事研究期间给我的指导，丁老师严谨的科学作风，丰富的工程实践经验，平易近人的态度让我终生难忘，同时在生活及实验工作等方面丁老师也给予我极大的帮助与支持。此外，袁先生渊博的学识，独特的创新思想给我的研究工作提供了许多新的思路与宝贵的意见。

感谢李近师姐对我研究工作所给予的悉心辅导和热情的帮助，整个研究工作凝聚了她大量的心血。实验及论文撰写过程中每个细都得到了李近师姐的支持和指导，在此深表感谢。同时感谢本实验室蒋国强老师、林莹师姐、孙佳丽师姐、严鸿飞师兄以及其他老师和同学的关心和帮助。

感谢所有关心和帮助过我的人。

声明

关

图6.1

于论文内容没有侵占他人著作权的声明，放在致谢页后。请认真阅读声明内容，全面审视自己的论文，是否严格遵守《中华人民共和国著作权法》，对他人享有著作权的内容是否都

进行了明确的标注，慎重签名。

签名：_____________

日期：______________

XIII

附录A

缓冲溶液配制方法及标准曲线的测定

磷酸盐缓冲溶液 (PBS, pH=7.4，0.02M) 的配制方法

配制800mL PBS溶液的药品如下表：

药品

分子量 (g/mol)

质量 (g)

0.11 0.68

NaH2PO4·2H2O 156.01 Na2HPO4·12H2O 358.4

NaCl 58.44 0.84

磷酸盐缓冲溶液 (pH=6.24) 的配制方法

配制500mL PBS溶液的药品如下表：

药品

分子量 (g/mol)

质量 (g)

6.3 3.3

NaH2PO4·2H2O 156.01 Na2HPO4·12H2O 358.4

柠檬酸盐缓冲溶液 (pH=5.1，0.01M) 的配制方法

配制20mL PBS溶液的药品如下表：

药品

分子量 (g/mol)

质量 (g)

C6H8O7•H2O 210.14 0.016 Na3 C6H5O7·2H2O 294.12

0.041

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