甘薯愈伤组织及其再生丛生芽诱导的试验研究

甘薯愈伤组织及其再生丛生芽诱导的试验研究

作者：刘春月 孟祥锋 来源：《硅谷》2008年第19期

[摘要]以甘薯品种红心王为材料，通过正交实验，筛选出了甘薯愈伤组织的最佳诱导培养基为MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L BA，外植体为茎段；通过在不定芽诱导培养基

MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT中添加AgNO3，提高了愈伤组织的分化率，并且诱导出再生丛生芽，其中AgNO3的最佳含量为4mg/L。实验显示，诱导出的不定芽可以在MS培养基中多次继代，实现扩繁。

[关键词]甘薯 组织培养 愈伤组织诱导 丛生芽诱导 正交试验

中图分类号：Q94 文献标识码：A 文章编号：1671－7597(2008)1010009－02

甘薯的组织培养是一个重要的研究领域，已在甘薯的快速繁殖、脱病毒及遗传改良等领域得到了较广泛的应用。在甘薯的组织培养中，一般要经过愈伤组织诱导，然后通过形态发生(器官发生或体细胞胚胎发生)再生出完整植株[1、2]。目前，虽然已由甘薯的叶片、叶柄、茎段、块根、茎尖等外植体诱导出愈伤组织并再生出植株，但分化的不定芽都是单个芽，没有再生丛生芽的分化。据张鹏[3]等报道，AgNO3可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎发生；可以促进一些再生困难种芽的产生；可以增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率。在诱导不定芽的培养基中加入适量的AgNO3可以增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率，并且可诱导出再生丛生芽[4]。

一、材料和方法

（一）植物材料

以甘薯品种红心王为材料。 （二）试验方法

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

1．试管苗的培养。剪取生长旺盛的茎尖3～5cm，在室内切去叶片，然后消毒。消毒时将材料先用75%乙醇浸泡30s，无菌水冲洗1遍，然后用HgCl2(0.1%)浸泡8min，无菌水冲洗4遍。接种时，在解剖镜下剥取0.2～0.3mm大小的生长点(带1片叶原基)，接种在MS+1.0mg/L6-BA+0.1mg/L IAA+0.1 mg/L GA3培养基上[5]。

2．愈伤组织的诱导及增殖培养。取经上述培养获得的无菌苗，在无菌条件下，将叶柄和茎(节间)切成长约0.5～1.0cm的切断，叶片切成切断面积约为0.5cm2的小块，分别接种于附加NAA和BA的MS培养基中。

采用3因素各3个水平试验，正交表选用L9(33)，表头设计见表1。正交表中A，B，C分别对应于NAA，BA，外植体3个因素，A，B两因素的3个水平1，2，3分别对应浓度为0.1mg/L，0.5mg/L和1.0mg/L，C因素的3个水平1，2，3分别是叶柄、叶面向上和茎段。正交表和9种培养基及3因素的详细配比见表2。

接种20d后，观察愈伤组织的质地、色泽和生根情况，统计外植体愈伤组织的诱导率，并测量愈伤组织的大小，对试验结果进行分析[6]。

将诱导的愈伤组织移栽到MS培养基中进行增殖培养。

表1 L9(33)正交试验表头设计表

3．不定芽的诱导。将增殖培养的愈伤组织分别移栽到MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT和MS+0.02mg/L2,4-D+1.0mg/L KT+AgNO3(AgNO3的含量依次为2mg/L、4mg/L、6mg/L、8mg/L)两种培养基上，进行愈伤组织不定芽的分化，统计愈伤组织分化率。 （三）培养条件

培养温度为28±2℃，光照强度为1500～2000lx，光照时间为16h/d，pH = 5.6～5.8。

二、结果与分析

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

（一）甘薯组织培养愈伤组织诱导正交试验L9(33)的试验结果见表2

表2 甘薯组织培养L9(33)试验结果

（二）甘薯外植体愈伤组织的诱导和生长

培养3d后，外植体的切口处膨大，尤其以叶柄最为明显，6d左右，切口处出现肉眼可见的浅黄色愈伤组织。随后，愈伤组织继续生长，在茎段和叶柄外植体两端形成愈伤组织块，而使其呈哑铃状，在叶片的四周切口出现带状愈伤组织。

试验结果表明（表2），激素种类及浓度和外植体的类型对愈伤组织的诱导均有明显影响，所诱导的愈伤组织在颜色、质地等方面都表现出明显的差异，随着BA浓度的增高，愈伤组织生长有不断增加的趋势，实验筛选出愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0mg/L NAA+0.5mg/L BA，外植体为茎段。 （三）愈伤组织的继代增值培养

将诱导的愈伤组织移栽到MS培养基中，水浸状的愈伤组织生长缓慢，逐渐褐化；致密状的愈伤组织生长良好，表面带有白色颗粒，但生长缓慢；疏松状的愈伤组织增殖速度最快，是其它愈伤组织的2～3倍，且增殖后仍保持浅绿色、质地疏松、颜色鲜艳，在MS培养基中连续继代培养多次，生长状态依然良好。 （四）愈伤组织不定芽的分化

愈伤组织在培养基MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT中培养23天左右，有部分愈伤组织分化出单个芽，如图1所示，表面带有白色颗粒的致密状的愈伤组织分化率为23.4%，疏松状的愈伤组织分化率为19.5%。致密状的愈伤组织分化率大于疏松状的愈伤组织分化率，这两种愈伤组织都没有诱导出丛生芽，实验显示，诱导出的不定芽可以在MS培养基中多次继代，实现扩繁。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

愈伤组织在附加AgNO3的MS+0.02mg/L 2,4-D+1.0mg/L KT的培养基中培养20天左右，有部分愈伤组织分化出单个芽，在AgNO3的含量为4mg/L的培养基中愈伤组织的分化率明显提高，表面带有白色颗粒的致密状的愈伤组织分化率为35.3%，疏松状的愈伤组织分化率为21.6%，同样是致密状的愈伤组织分化率大于疏松状的愈伤组织分化率；同时疏松状的愈伤组织分化出再生丛生芽，如图2所示，分化出的再生丛生芽的叶片、叶柄、茎不明显，颜色较浅，再生丛生芽的长势也有差异，它们不能同时生长，将先生长的再生丛生芽移栽到MS培养基中，接下来又有再生丛生芽生长，这样诱导的再生丛生芽依次都移栽到MS培养基中，并且都能够在MS培养基中多次继代，实现扩繁。

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

三、讨论

甘薯愈伤组织的形成和生长受多种因素影响，通过正交试验表明，激素种类及浓度和外植体类型对愈伤组织的诱导均有明显影响。本实验以甘薯品种红心王为材料，筛选出愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+1.0mg/L NAA+0.5mg/L BA，外植体为茎段，同时筛选出适合愈伤组织继代增殖的培养基是MS培养基，这与前人筛选出的培养基不同，这可能是由于所用的品种不同所致。

植物组织培养过程中产生大量的乙烯，累积的乙烯可以抑制器官发生及体细胞胚胎发生，多胺则可促进它们的发生，乙烯的生物合成与多胺的生物合成是相互抑制的，乙烯抑制多胺生物合成中的重要酶ADC(精氨酸脱羧酶)和SAMDC(S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶)的活性。在培养基中加入适量的AgNO3，由于Ag+的存在，乙烯不能干扰多胺的合成，从而使ADC酶活性增加。AgNO3通过促进多胺的合成，提高器官发生和体细胞胚胎发生的频率。AgNO3可以促进愈伤组织的器官发生与体细胞胚胎发生；可以促进一些再生困难种芽的产生；可以增加外植体产生不定芽的数目及提高植株再生频率[3]。

另外，愈伤组织诱导的再生丛生芽不能同时生长，这可能与培养基的配方有关，有待于进一步试验研究。

参考文献：

[1]龚一富，高峰，张平波等.我国甘薯离体培养研究进展[J].作物研究，1998，2:46-48. [2]Sihachakr D，Haicour R，Cavalcante Alves J M，et al.Plant regeneration in sweet potato (Ipomoea batatas L.Convolvulaceae) . Euphytica，1997，96(1):143-152.

[3]张鹏，王爱国等.AgNO3在植物离体培养中的作用及可能的机制[J].植物生理学通讯，1997，33(5)：376-379.

[4]YANGWen-Yu，BAIYong-Yan.Stimulation of Shoot Regeneration in Leaf Tissue Culture of Solanum tuberosum by Silver Nitrate.Acta Phytophysioligica Sinica，1998，24(1):86-90.

[5]何凤发，王季春，张启堂等.甘薯茎尖脱毒与快速繁殖技术研究[J].西南农业大学学报，2002，24(6 )：509-511，528.

龙源期刊网 http://www.qikan.com.cn

[6]周丽艳，高书国等. 甘薯愈伤组织诱导及植株再生的研究[J].中国农学通报2003，19(3):61-68 .