２０１ １年６月 第２期（总第１５１期） 草食家畜（季刊） 几种牛结核病检疫方法在结核污染 牛群中的应用研究 徐敏‘，许礼义２王六合 ，王文秀‘，马卫平 ，呼西旦 ，徐志光 ，孙国林 乌鲁木齐８３００６３； （１．乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心，２．畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐８３００００） 摘 要：牛结核病主要是由牛分枝杆茵引起的一种人畜共患病，皮内变态反应是牛结核病检疫国家规定 的检疫方法和有效手段，本文阐述了皮内变态反应与比较变态反应、 一干扰索检测及病理剖检的相关性 和符合率，对确诊结核病阳性牛有一定的指导作用。 关键词：牛结核；国产ＰＰＤ检测；＾ｙ一干扰素；比较变态反应；剖检 中图分类号：￥８１５．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００３—６３７７（２０１ １）ｏ２—００７１—０３ 牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种牛的慢 性消耗性传染病，该病可以传染给人类Ⅲ。近年来，我国 的牛结核疫情加重，严重威胁着人类的健康［２１。皮内变态 反应诊断是我国的法定诊断方法，也就是用单纯的牛型 提纯结核菌素（ＰＰＤ）颈部皮肤变态反应来进行牛结核 检疫的，如果结果是阳性，则要进行隔离或扑杀。但是很 （ＰＰＤ）和Ｂｏｖｉｇａｍ禽型提纯结核菌素（ＰＰＤ）均购于北京测 迪科技有限公司。 ＢＯＶＩＧＡＭＴＭ牛结核分枝杆菌 一干扰素检测试剂盒， 购于北京测迪科技有限公司。 １．１．２牛群户牛群。 ２６６７头活畜，来源于乌鲁木齐周边地区散 多被扑杀的阳性牛，没有任何可见的病理变化，对牛结 核病检疫造成了很大阻力。’ １．２ 方 法 在很多发达国家，通常使用欧盟比较皮内变态反应 和 一干扰素试验进行检疫。欧盟比较变态反应在国外 已经具有很长的应用历史，如英国、加拿大、美国、澳大 利亚和新西兰等国家［３．－７１，均采用比较变态反应作为扑杀 １＿２＿１牛结核菌素皮内变态反应试验参照依据中华人 民共和国国家标准《动物结核病诊断技术（ＧＢｔ＂Ｆ １８６４５— ２００２）｝进行。 １．２．２欧盟比较变态应 与牛ＰＰＤ变态反应试验相同， 在注射牛ＰＰＤ的同时，在牛颈部的另一侧同时注射进 口的牛型和禽型ＰＰＤ，两者间隔约１２～１５ｃｍ处，剂量分 别为３０００ＩＵ／头份和２５００ＩＵ／头份。注射前和后试验结果 测量应由同一个人完成。 结核阳性牛的试验依据，并有相关的法案规定强制执 行。牛全血干扰素试验是牛结核诊断的一种新型的牛结 核诊断方法，很多学者对其进行深入的研究。目前，该方 法在欧盟和美国等发达国家已经得到了承认 ｌ，成为继 变态反应之外的唯一的法定活畜诊断试验。我们将该方 １．２．３＾ｙ一干扰素试验 １．２＿３．１抗原刺激每头牛采集５ｍＬ血液肝素抗凝血液， 室温下于３０ｈ内运送到实验室。将采集的每份抗凝全血 各取１．５ｍｌ加入３个不同孔中，然后取１００ｌｘＬ的牛型 ＰＰＤ、禽型ＰＰＤ和阴性对照磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），分别 加入至抗凝全血中，充分混匀后置于含５％ＣＯ 的培养 箱中３７℃培养１６ｈ。用移液器小心吸取培养的上清，转 入至１．５ｍＬ离心管中，即为刺激产生的 一干扰素上清。 这些上清可以立即用ＥＬＩＳＡ进行检测，也可以冷冻保 法引进并与欧盟比较皮内变态反应和我国常用的单纯 颈部牛型ＰＰＤ皮试进行比较，从而为改进我国的牛结 核检疫方法积累数据。 ｌ材料与方法 １．１材料 １．１．１ ＰＰＤ与试剂盒 国产牛ＰＰＤ购于黑龙江省生物制 品一厂。比较变态反应试剂包括进口牛型提纯结核菌素 收稿日期：２０１１－Ｏ１—２１ 存，待时问方便后再进行检测。 １．２．３．２牛 一干扰素酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）单抗 包被板上每孔加入５０１￣Ｌ样品稀释液，然后加入５０１￣Ｌ 待测样品或对照，混匀后室温作用ｌｈ；洗涤，每孔加入 １００ｔｘＬ酶标抗体，室温作用ｌｈ；洗涤后每孔加入１００￣Ｌ 底物，室温避光作用３０ｍｉｎ后，加入终止液，测定 基金项目：乌鲁木齐市科技局应用研究项目（Ｐ０７１２１ Ｏ００１）。 作者简介：徐敏（１９６９一），男，硕士，农业推广研究员， 主要从事动物疾病预防与控制工作。 通讯作者：呼西旦，女，研究员，主要从事牛结核病诊断 和核酸疫苗的研究与应用。 ＯＤ４５０ｎｍ值。当牛型ＰＰＤ刺激上清的ＯＤ值一ＰＢＳ刺激 上清的ＯＤ值≥０．１，且牛型ＰＰＤ刺激上清的ＯＤ值一禽 ７１ ２０１１年６月 第２期（总第１５１期） 型ＰＰＤ刺激上清的ＯＤ值＞１０．１是为阳性，反之为阴性。 １．２．４国内单纯颈部变态反应试验对乌鲁木齐周边地 区散户牛群，共计１２６６７头活畜，进行国内单纯颈部变 草食家畜（季刊） 部皮肤试验，检出阳性牛即进行扑杀或隔离，但该方法 也存在不足，最主要的原因就假阳性问题造成的没必要 的扑杀引起的经济损失。用 一干扰素试验和比较变态 反应试验与我国常用的牛型ＰＰＤ皮试进行比较结果显 示：单纯的牛型ＰＰＤ皮试，与国外通用的比较变态反应 和 一干扰素试验相比，其特异性差。这是由于比较皮试 和 一干扰素试验剔除掉的一部分禽型ＰＰＤ阳性牛，在 单纯的牛型ＰＰＤ皮试中多为阳性。我国常用的ＰＰＤ皮 试检疫为阳性的而 一干扰素试验检测却为阴性，可能 态反应检疫。 １．２．５欧盟比较变态反应对国内常规牛型ＰＰＤ单纯颈 部变态反应检疫为阳性的牛，进行进口比较变态反应试 验、＾ｙ一干扰素试验及病理剖检试验，统计数据，计算出 这几种牛结核病检疫方法之间的阳性符合率。 ２结 果 ２．１ 国内单纯颈部变态反应试验 对乌鲁木齐周边地区散户牛群，共计１２６６７头活 畜，进行国内单纯颈部变态反应检疫，共检出４２头牛为 由于皮试检测人为因素造成的。另一方面其它非致病性 分支杆菌感染牛机体也可以造成ＰＰＤ皮试检疫为阳 性，这样就造成了非阳性牛的扑杀，造成一定的经济损 阳性。 ２．２比较试验 ２．２．１对国内单纯颈部变态反应检疫的４２头阳性牛进 行进口比较变态试验、 一干扰素试验和病理剖检，试验 结果如表ｌ。 表１ ４２头阳性牛试验结果 ２．２．２国内单纯颈部变态反应检疫结果、进１３比较变态 试验结果、＾ｒ一干扰素试验结果和病理剖检结果对比阳 性符合率如表２。 表２对比结果 ３讨论 ３．１ 关于牛结核活畜检疫中的方法选择问题 牛结核病的诊断方法主要有病原学诊断和免疫学 诊断。病原学诊断包括传统的细菌学检测和分子生物学 诊断技术。细菌学检测在发达国家常作为诊断牛结核病 的确诊试验唧，但由于分枝杆菌生长缓慢，该方法需要耗 费较长时间才能做出诊断。很多科学家建立了ＰＣＲ用 于诊断牛结核病ｏ－ ，但试验结果均认为其敏感性较差， 这可能与体内分支杆菌的繁殖特征有关。而且这些方法 大多需要采集死亡家畜的病料来检测，因此病原学诊断 并不适合大规模的活畜检疫。牛结核病的免疫学诊断方 法包括细胞免疫学诊断方法和抗体检测方法，由于牛结 核病的免疫以细胞免疫为主，注定了抗体检测方法较低 敏感性，因此目前临床上使用最为广泛的只能是细胞免 疫学诊断方法。 ３．２关于国内常规ＰＰＤ变态反应 我国牛结核病检疫使用《动物结核病诊断技术（ＧＢ／ Ｔ １８６４５—２００２）＞）的国家标准进行，即单纯的牛型ＰＰＤ颈 ７２ 失。 ３－３关于干扰素试验 牛＾ｙ一干扰素试验被认为是除变态反应以外的最具 有应用前途的一种新型试验方法，已经成为很多发达国 家的法定牛结核病检疫方法 。＾ｙ一干扰素试验与进口 比较变态反应试验很好的符合率。该方法可以在实验室 内进行，判定结果更为客观，而且与皮试相比，试验所需 时间较短。如果以 一干扰素试验为金标准对检疫阳性 牛进行扑杀，会减少扑杀牛的头数，减少不必要的经济 损失。同时，该方法还可以同布病检疫结合起来，一次抽 血可以同时检测２种疾病。因此， 一干扰素试验在牛结 核病检疫中具有广阔的应用前景。但该方法也存在着很 多缺陷，主要是成本偏高，而且需要较高水平的实验室 才能进行操作，因此基本排除了近期将其作为我国牛结 核病初步筛检方法的可能性。 ３．４关于进口比较变态反应 发达国家均以比较变态反应作为扑杀结核阳性牛 的依据 。我们的试验也证实，进口比较变态反应可以 剔除一部分禽型ＰＰＤ阳性牛，而通常认为禽型ＰＰＤ阳 性是由禽分支杆菌等引发的非特异反应。本试验中进口 比较变态反应阳性符合率（４７．６ｌ％）低于 一干扰素试验 阳性符合率（６６．６７％），且它的禽型检出率高于 一干扰 素试验，可能由于人为操作及主观判断等方面的因素造 成的。 ３．５关于病理剖检 通过对尸体的剖检，直接观察结核病灶的部位，此 方法直接明了。在本实验中病理剖检与国内常规ＰＰＤ 变态反应符合率低，而与 一干扰素试验及进口比较变 态反应试验的符合率高，说明可能是由于禽型结核的干 扰，也证明了 一干扰素试验及进口比较变态反应试验 的准确性。另一方面，病理剖检未发现结核病灶的，也不 能就说一定没有感染结核，而且病理剖检具有一定的危 险性不适于临床普查。 ３．６总论 本次试验通过用进１：３比较变态反应、 一干扰素试 验、及病理剖检检测同一批４２头国产ＰＰＤ检测为结核 病阳性的牛，统计出它们之间的阳性符合率，说明国产 ＰＰＤ检测仍然是我国目前牛结核病快速、准确的普查方 法。该方法可以尽可能检出结核病阳性牛，但也存在假 阳性问题，如果能辅以其它方法，这一问题将得到改 善。 ２０１１年６月 第２期（总第１５１期） 草食家畜（季刊） 参考文献： 【７】刘思国，王春来，张秀华，等．牛结核病病原生态学 【ｌ】王忠仁．牛结核病与人结核病的相互关－系【ＪＪ．中国 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Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３００００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｚｏｏｎｏｓｉｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｓｐｒｅａｄ ｔｏ ｈｕｍａｎｓ。Ｄｅｌａｙｅｄ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｉａｇｎｏｓｅ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｏｕｒ ｃｏｕｎｔｒｙ．Ｗｅ ｅｘｐｌａｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ，ＩＦＮ一 ｔｅｓｔ，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｔｏｍｙ ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｓｓａｙ，ｗｈｉｃｈ ｇｉｖｅ ｓｏｍｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｉｎａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｏｖｉｎｅ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；ｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ；ＩＦＮ一 ｔｅｓｔ；Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｔｅｓｔ；ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎａｔｏｍｙ ７３
