响应面法优化谷胱甘肽发酵生产培养基的研究

食品科学※生物工程

响应面法优化谷胱甘肽发酵生产培养基的研究

郑丽雪１，林　霄２，朱益波１，齐　斌１，＊

（１．常熟理工学院生物与食品工程系，江苏　常熟　　　　　　２１５５００；２．长春中医药大学第一附属医院，吉林　长春　　　　　　１３００２１）摘　　　要：本研究以酿酒酵母变异株为出发菌株，利用Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心组合设计和响应面法对该菌株产谷胱甘肽的培养基组成进行优化。实验结果表明：在１０°Ｂｅ′麦芽汁中添加３８ｇ／Ｌ葡萄糖、６．３ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４及１．９ｇ／Ｌ　Ｌ－半胱氨酸盐酸盐时，谷胱甘肽产量达到１２０ｍｇ／Ｌ，生物量达到１１．０２ｇ／Ｌ，比优化前分别提高了７１．３６％、３９．６７％。关键词：谷胱甘肽；发酵；响应面法；中心组合设计

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｂｙ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ

Ｕｓｉｎｇ　Ｒｅｓｐｏｎｓｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ

ＺＨＥＮＧ　Ｌｉ－ｘｕｅ１，ＬＩＮ　Ｘｉａｏ２，ＺＨＵ　Ｙｉ－ｂｏ１，ＱＩ　Ｂｉｎ１，＊

（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｈａｎｇｓｈｕ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｃｈａｎｇｓｈｕ　　　　　　２１５５００，　Ｃｈｉｎａ；

２．Ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　　　　　　１３００２１，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ＇ｓ　ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ｗｅｒｅ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｈｅｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｕｔａｎｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔｔｈｅ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｙｉｅｌｄ　ａｎｄ　ｂｉｏｍａｓｓ　ａｒｅ　１２０　ｍｇ／Ｌ　ａｎｄ　１１．０２　ｇ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，　　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｂｙ　７１．３６％　ａｎｄ　３９．６７％，　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ・ＨＣｌ　ｂｅｉｎｇ　ａｄｄｅｄ　ｔｏ　１０°Ｂｅ′　ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　３８　ｇ／Ｌ　ｇｌｕｃｏｓｅ，　６．３　ｇ／Ｌ　（ＮＨ４）２ＳＯ４　ａｎｄ　１．９　ｇ／Ｌ　Ｌ－Ｃｙｓ

Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｓｕｒｆａｃｅ　ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ；ｃｅｎｔｒａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　ｄｅｓｉｇｎ

中图分类号：Ｑ８１５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００８）０８－０４５６－０４

谷胱甘肽（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ，简称ＧＳＨ）是一种具有γ－谷氨酰基和活性巯基的生物活性三肽化合物，在生物体中具有重要的生理功能，广泛存在于动植物体内。谷胱甘肽可以迅速提高机体免疫力，在抗氧化、抗辐射、清除自由基、解毒、促进铁质吸收等方面具有良

［１－４］

１．１１．１．１

材料菌种

酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＣＳ１０５１５－１为本实验室保存。１．１．２

培养基

斜面固体培养基采用ＰＤＡ琼脂培养基；种子培养基采用５°Ｂｅ′麦芽汁。１．１．３

试剂

谷胱甘肽标准品购自美国Ｓｉｇｍａ公司，其余为国产分析纯试剂。１．２１．２．１

方法种子培养

好的效果；它具有增强食品营养价值和强化食品风味等功能［５－６］。

发酵法生产谷胱甘肽具有反应条件温和、成本低、反应步骤简单等优点，具有广阔的发展前景。其关键环节是性能优良的生产菌株的筛选。国内外学者已开展了利用细菌和酵母生产ＧＳＨ的研究［７－１１］。其中酵母具有易培养、生长速度快和ＧＳＨ含量高等优点，已日渐成为ＧＳＨ工业化生产的首选菌株［１２］。本实验以一株高产谷胱甘肽的酿酒酵母变异菌株ＣＳ１０５１５－１为生产菌株，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ的中心组合试验法对其培养基进行优化，以期为工业化生产提供理论依据。１

材料与方法

用接种环挑取一环活化菌种接入种子培养液中，３０℃，摇床转速１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养１８ｈ，备用。１．２．２

生物量测量

取１０ｍｌ发酵液于６０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，弃上清液，

收稿日期：２００８－０４－２１

作者简介：郑丽雪（１９８２－），女，硕士，研究方向为食品生物技术。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｂｉｎ６５＠１２６．ｃｏｍ

＊通讯作者：齐斌（１９６５－），男，教授，博士，研究方向为食品质量与安全。Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｉｂｉｎ６５＠１２６．ｃｏｍ※生物工程

菌体洗涤三次后，１０５℃烘干至恒重，称量。１．２．３

食品科学2008, Vol. 29, No. 08457

在添加葡萄糖的麦汁培养基中，分别加入不同氮源，考察了不同氮源对ＧＳＨ产量和生物量的影响，结果见图２。由图２可以看出，（ＮＨ４）２ＳＯ４最有利于ＧＳＨ的积累，（ＮＨ４）２ＳＯ４为无机态氮，易被微生物利用，另外可能ＳＯ２－４的存在为含硫氨基酸（半胱氨酸、蛋氨酸等）的合成提供了有效成分，最适添量为０．６％（图３）。以尿素为氮源时，得到最大生物量，但ＧＳＨ的产量不高。

１１０ＧＳＨ产量（ｍｇ／Ｌ）１０５１００９５９００

生物量（ｇ／Ｌ）０．２

０．４

０．６

０．８

１

１．２

（ＮＨ４）２ＳＯ４浓度（％）

图　３　　　　　(NH4)2SO4浓度对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Fig.3 Effects of (NH4)2SO4 concentration on glutathione yield and

biomassＧＳＨ产量

生物量

１２１１１０９８７１．４

生物量（ｇ／Ｌ）ＧＳＨ含量的测定［１３］

发酵液离心（６０００ｒ／ｍｉｎ、１５ｍｉｎ）、洗涤除去上清液，

得到湿菌体，加入４０％乙醇溶液于３０℃振荡抽提２ｈ，离心，Ａｌｌｏｘａｎ法测定上清液中的ＧＳＨ含量。２２．１

结果与分析培养基组成的优化

２．２．１碳源对酵母合成谷胱甘肽的影响

碳源是各种代谢产物和细胞内部物质碳架结构的重要来源。在预实验中确定的１０°Ｂｅ′麦汁中分别添加不同浓度的葡萄糖，测定ＧＳＨ的产量和生物量，结果见图１。

１００ＧＳＨ产量（ｍｇ／Ｌ）９５９０８５８０

１

２

３４

葡萄糖（％）

５

６

ＧＳＨ产量

生物量

１２１１１０９８７

２．２．３金属离子对酵母合成谷胱甘肽的影响

图１　　　葡萄糖浓度对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Fig.1 Effects of glucose concentration on glutathione yield and

biomass

金属离子是微生物生长必不可少的一类营养物质［５－６］。在麦芽汁中添加不同的金属离子，３０℃、１８０ｒ／ｍｉｎ振荡培养２４ｈ，测定ＧＳＨ的产量和生物量，结果见表１。从表１可以看出，金属离子的添加对酵母产ＧＳＨ的影响不大，表明麦芽汁中的金属离子及无机盐含量完全能够满足酵母的生长及谷胱甘肽的产生。２．２．４

前体氨基酸对酵母合成谷胱甘肽的影响

酵母可利用培养基中的氮源合成氨基酸，用于谷胱甘肽的合成，但酵母细胞内能用于谷胱甘肽合成的氨基酸是有限的，且受代谢，因此，前体氨基酸的添加有可能促进谷胱甘肽的积累［１２］。本实验考察了Ｌ－半胱氨酸盐酸盐、谷氨酸、甘氨酸对ＧＳＨ产量的影响，结果见表２。

表２　　　不同前体氨基酸对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Table 2 Effects of precurosor amino acids on glutathione yield

and biomass

氨基酸

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＳＨ产量

（ｍｇ／Ｌ）１１１．２６１０４．４８１００．２９１０４．５４

（％）１０６．４３９９．５４９５．９３１００

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生物量

（ｇ／Ｌ）１１．３７１０．８９１０．７２１０．８５

（％）１０４．７９１００．３６９８．８１００

由图１可见，随着葡萄糖浓度增加，ＧＳＨ产量和生物量增加，当葡萄糖添加量为４％时，ＧＳＨ产量和生物量都达到最大。继续提高葡萄糖浓度，ＧＳＨ产量和生物量逐渐下降，表明葡萄糖添加量超过４％时产生了葡萄糖效应２．２．２

［１４］

。

氮源对酵母合成谷胱甘肽的影响

１１０ＧＳＨ产量（ｍｇ／Ｌ）１００９０８０

ＧＳＨ产量

生物量

１２１１１０９８

酵母膏牛肉膏蛋白胨硫酸铵尿素氨水７

生物量（ｇ／Ｌ）Ｌ－Ｃｙｓ・ＨＣｌ谷氨酸氨基乙酸对照

氮源

图２　　　氮源对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Fig.2 Effects of nitrogen source on glutathione yield and biomass

表１　　　不同无机盐对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Table 1 Effects of mineral salt on glutathione yield and biomass

无机盐ＧＳＨ产量（ｍｇ／Ｌ）生物量（ｇ／Ｌ）

空白１０４．５４１０．８５

ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ

１０５．３７１０．９８

ＮａＣｌ１０４．５７１０．８２

ＣａＣｌ２１０４．８７１０．９６

ＦｅＳＯ４１０４．６７１０．８９

ＫＨ２ＰＯ４１０４．９８１０．９３

ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ

１０４．３７１０．６３

ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ

１０４．５１１０．９２

ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ

１０４．５２１０．５９

458 2008, Vol. 29, No. 08

食品科学※生物工程

表４　　　Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ的中心组合试验设计及ＧＳＨ产量

由表２可以看出，添加Ｌ－Ｃｙｓ・ＨＣｌ，ＧＳＨ产量和生物量明显提高，最适添加量为０．２％，超过０．２％时ＧＳＨ产量和细胞干重都急剧下降（图４），ＭａｗＧＡ认为可能是半胱氨酸－金属复合物会影响包括同化乙醇在内的某些呼吸关键酶的活性

［１５］

Table 4 Box-Benhnken's central composite design and

glutathione yield

试验号１２３

Ｘ１－１－１１１００００－１１－１１０００

Ｘ２－１１－１１－１－１１１０００００００

Ｘ３００００－１１－１１－１－１１１０００

Ｙ１０５．５０１０８．６２９８．２４１００．０２９０．３５７０．２３９２．３２６８．２９８０．７６８２．０５７２．１９７０．２０１１８．２５１１９．４３１２１．７４

。

ＧＳＨ产量

生物量

４

１２１１１０９８

生物量（ｇ／Ｌ）５６７８９１０１１１２１３１４１５

１２０ＧＳＨ产量（ｍｇ／Ｌ）１１５１１０１０５１００

０．１００．１５０．２００．２５０．３０

Ｌ－Ｃｙｓ・ＨＣｌ浓度（％）

０．３５

图４　　　Ｌ－Ｃｙｓ・ＨＣｌ浓度对ＧＳＨ产量和生物量的影响

Fig.4 Effects of L-Cys・HCl concentration on glutathione yield

and biomass

２．３

Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ　的中心组合试验结果及响应面分析在单因素试验基础上，选择影响谷胱甘肽产生的三

合后得回归方程如下：

Ｙ１＝１１９．８０６７－２．０７Ｘ１＋０．６１６２５Ｘ２－８．０７１２５Ｘ３－１０．３５４５８Ｘ１

－０．８２Ｘ１Ｘ３－６．３５７０８３Ｘ２－０．９７７５Ｘ２Ｘ３－３３．１５２０８Ｘ３

运用ＳＡＳ程序对回归方程进行方差分析（表５）。方

２２

差分析结果表明，Ｘ３、Ｘ１、Ｘ３项影响极为显著（ｐ＜０．０１），由此所建立的模型也是极为显著（ｐ＜０．０１）；Ｘ２对ＧＳＨ

２

的产量的影响显著（ｐ＜０．５），其中Ｘ２的影响较为突出；Ｘ２、Ｘ１Ｘ２、Ｘ１Ｘ３、Ｘ２Ｘ３对ＧＳＨ的产量影响不显著（ｐ＞０．５）。因此各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次抛物面关系。复相关系数的平方（Ｒ２）为０．９３９３，说明由这三个因素及其二次项所建立的模型能解释ＧＳＨ产量变化的９３．９３％，因此回归方程给菌株发酵生产ＧＳＨ提供了一个合适的模型。

对回归方程求解得：Ｘ１＝－０．０９５　，　Ｘ２＝０．０５８　，　Ｘ３＝－０．１２１。

２

２

２

２

个主要成分葡萄糖、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐为自变量，以谷胱甘肽产量为考察指标，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ的中心组合试验设计，进行三因素三水平的ＲＳＭ试验。编码与因子对应关系见表３，试验设计及结果见表４。

表３　　　编码与因子的实际浓度的对应关系

Table 3 Corresponding relation ship between code and practical

concentration of factor

编码－１０１

Ｘ１　葡萄糖（ｇ／Ｌ）

２０４０６０

Ｘ２　（ＮＨ４）２ＳＯ４（ｇ／Ｌ）

０６１２

Ｘ３　Ｌ－Ｃｙｓ・ＨＣｌ（ｇ／Ｌ）

１２３

以ＧＳＨ平量为响应值，运用ＳＡＳ程序进行回归拟

表５　　　响应面试验方差分析

Table 5 Variance analysis results of response surface test主模型

自由度１１１

２１

方差来源

Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＸＸ

２１

预测模型

Ｆ值１．５８１３６６０．１４０１５４２４．０４２１５１８．２６２６９０．０２０７０９０．１２４０７６６．８８３５９６０．１７６３１７１８７．２０６６２５．０６０７２

Ｐｒ＞Ｆ０．２６４１０１０．７２３４８０．００４４６２０．００７９１２０．８９１１９６０．７３９０１５０．０４６８９０．６９１９９０．０００１０．００１２２２

自由度１１１１１１１１１９５１４

平方和３４．２７９２３．０３８１１２５２１．１６０６３９５．８７９６０．４４８９２．６８９６１４９．２１５４３．８２２０２５４０５８．０７４８８９．１６２１０８．３８４８４９９７．５４７

平均平方和３４．２７９２３．０３８１１２５２１．１６０６３９５．８７９６０．４４８９２．６８９６１４９．２１５４３．８２２０２５４０５８．０７５４３．２４０３２１．６７６９６

Ｆ值１．５８１３６６０．１４０１５４２４．０４２１５１８．２６２６９０．０２０７０９０．１２４０７６６．８８３５９６０．１７６３１７１８７．２０６６２５．０６０７２

Ｐｒ＞Ｆ０．２６４１０１０．７２３４８０．００４４６２０．００７９１２０．８９１１９６０．７３９０１５０．０４６８９０．６９１９９０．０００１０．００１２２２

平方和３４．２７９２３．０３８１１２５２１．１６０６３９５．８７９６０．４４８９２．６８９６１４９．２１５４３．８２２０２５４０５８．０７４８８９．１６２１０８．３８４８４９９７．５４７

平均平方和３４．２７９２３．０３８１１２５２１．１６０６３９５．８７９６０．４４８９２．６８９６１４９．２１５４３．８２２０２５４０５８．０７５４３．２４０３２１．６７６９６

１１１１１１９５１４

Ｘ１Ｘ２Ｘ１Ｘ３ＸＸＸＸ

２３２２

２２

Ｘ２Ｘ３

２３

模型误差总值

※生物工程食品科学2008, Vol. 29, No. 08459

葡萄糖浓度（Ｘ１）＝３８．１ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４浓度（Ｘ２）＝６．３４８ｇ／Ｌ，Ｌ－半胱氨酸盐酸盐浓度（Ｘ３）＝１．８７９ｇ／Ｌ，此时ＧＳＨ最大估计值Ｙ＝１２０．４１ｍｇ／Ｌ。为实际操作方便，确定培养基的最优配方为葡萄糖３８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４　６．３ｇ／Ｌ、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐１．９ｇ／Ｌ。五次重复试验结果与预测值拟合较好，说明回归方程为ＧＳＨ的发酵提供了一个合适的模型。３

结　　论

［４］［５］［６］［７］

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以１０°Ｂｅ′的麦芽汁为基础培养基，通过单因素试

验确定了添加葡萄糖、（ＮＨ４）２ＳＯ４和前体氨基酸Ｌ－半胱氨酸盐酸盐有利于谷胱甘肽的产生。通过Ｂｏｘ－Ｂｅｎｈｎｋｅｎ中心组合试验确定产谷胱甘肽的优化培养基配方为葡萄糖浓度３８ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４浓度６．３ｇ／Ｌ、Ｌ－半胱氨酸盐酸盐浓度１．９ｇ／Ｌ时，此条件下，谷胱甘肽的产量为１２０ｍｇ／Ｌ。通过对预测模型的验证实验，实际实验值与模型预测值基本一致，说明模型能较好的反应实际情况。

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