镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低分子量壳聚糖的联合作用

环境科学学报ActaScientiaeCircumstantiae

Vol．31，No．9Sep．，2011

．环境科学学报，31（9）：周妍英，李瑞金，任国锐，等．2011．镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低分子量壳聚糖的联合作用［J］2028-2032

ZhouYY，LiRJ，RenGR，etal．2011．EffectsofcadmiumandthecombinationofcadmiumwithlowmolecularweightchitosanonthemRNAexpressionofmetallothioneininthefreshwatercrabSinopotamonyangtsekiense［J］．ActaScientiaeCircumstantiae，31（9）：2028-2032

镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低

分子量壳聚糖的联合作用

11，211，*

周妍英，李瑞金，任国锐，王兰1．山西大学生命科学学院，太原030006

2．山西大学环境科学与工程研究中心，太原030006收稿日期：2010-11-09

修回日期：2011-01-12

录用日期：2011-01-13

摘要：采用实时荧光定量PCR法，研究了不同浓度镉（Cd2+）对长江华溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）金属硫蛋白（metallothionein，简称MT）在鳃、肌肉和心脏中mRNA表达的诱导作用及低分子量壳聚糖（lowmolecularweightchitosan，简称LMWC）的联合作用．镉浓度分别为29、肝胰腺、

58和87mg·L－1，·L－1Cd2++20mg·L－1LMWC、58mg·L－1Cd2++40mg·L－1LMWC和58mg·L－1镉与LMWC的联合作用组分别为58mgCd2++80mg·L－1LMWC；处理时间均是4d．结果显示，与对照组相比，在镉胁迫下，长江华溪蟹肝胰腺、鳃和肌肉组织中MTmRNA表达显著MTmRNA的表达在肝胰腺和鳃组织中比镉单独作用（58mg·L－1Cd2+）显著下降，增加，而心脏中的变化不显著．在LMWC和镉共同作用下，而肌肉和心脏中的变化没有统计学意义．镉能诱导长江华溪蟹4种组织中MTmRNA的表达，且具有组织差异性；在LMWC与镉联合作用下，MTmRNA的表达有一定程度的下降．

关键词：长江华溪蟹；金属硫蛋白mRNA表达；镉；低分子量壳聚糖2468（2011）09-2028-05文章编号：0253-中图分类号：X171．5

文献标识码：A

EffectsofcadmiumandthecombinationofcadmiumwithlowmolecularweightchitosanonthemRNAexpressionofmetallothioneininthefreshwatercrabSinopotamonyangtsekiense

2*

ZHOUYanying1，LIRuijin1，，RENGuorui1，WANGLan1，

1．SchoolofLifeScience，ShanxiUniversity，Taiyuan030006

2．ResearchCenterofEnvironmentalScienceandEngineering，ShanxiUniversity，Taiyuan030006Received9November2010；

receivedinrevisedform12January2011；

accepted13January2011

Abstract：InordertoinvestigatetheimpactofcadmiumonthemRNAexpressionsofmetallothionein（MT）inhepatopancreas，gill，heartandmuscleofthefreshwatercrabSinopotamonyangtsekienseanditseffectsincombinationwithlowmolecularweightchitosan（LMWC），individualcrabswereexposed29，58and87mg·L－1），orexposedtocadmium（58mg·L－1）plusdifferentconcentrationsofLMWC（20，todifferentconcentrationsofcadmium（0，

40and80mg·L－1）for4days．TheexpressionlevelsofMTweremeasuredbyreal-timequantitativePCR．TheresultsshowedthatcadmiumsignificantlyinducedmRNAexpressionsofMTinhepatopancreas，gillandmuscle，whilethealterationofmRNAwasnotsignificantintheheartofS．yangtsekiensecomparedwiththecontrol．Moreover，themRNAexpressionsinhepatopancreasandgillweremarkedlydecreasedinthegroupsofcadmiumplusLMWCcomparedwiththecadmiumgroup．ItisconcludedthatcadmiumcaninduceMTmRNAexpressionsinfourtissuesofS．yangtsekiense．Howevertheeffectsaredifferentinvarioustissues．ThecombinationtreatmentofLMWCandcadmiumcandecreasetheMTinS．yangtsekienseinacertainrange．Keywords：Sinopotamonyangtsekiense；metallothioneinmRNAexpression；cadmium；lowmolecularweightchitosan

30970361）；山西省自然科学基金资助项目（No．2008011069）；中国博士后基金资助项基金项目：国家自然科学基金资助项目（No．30870267，目（No．20100471580）

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No．30870267，30970361），theNaturalScienceFoundationofShanxiProvince（No．2008011069）andtheChinaPost-doctoralScienceFoundationFundedProject（No．20100471580）

E-mail：sxzhouyanying@yahoo．com．cn；*通讯作者（责任作者），E-mail：lanwang@sxu．edu．cn作者简介：周妍英（1983—），女，

Biography：ZHOUYanying（1983—），female，E-mail：sxzhouyanying@yahoo．com．cn；*Correspondingauthor，E-mail：lanwang@sxu．edu．cn

9期周妍英等：镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低分子量壳聚糖的联合作用

2029

1引言（Introduction）

镉（cadmium，

Cd）在水生生态系统中通过食物链的逐级放大，危害生态系统，最终对人体产生影响．研究表明，大多数重金属能诱导水生动物肝脏、肾脏和脑等一些重要器官金属硫蛋白

（metallothionein，简称MT）的生物合成增加（任宏伟等，

2001）．金属对MT的诱导作用发生在转录水平，它与MT基因上游序列中的金属效应元件（MREs）结合，从而启动MT的mRNA转录（Mahmoodetal．，2009），这种转录调节与重金属浓度密切相关，可反

映水环境中的重金属污染程度（陈春等，2009）．因此，

MTmRNA的转录水平可以作为一种监测水体受重金属毒害的生物标志物（Maetal．，

2009）．壳聚糖（chitosan）是甲壳素脱乙酰基后的降解产物，是自然界中唯一大量存在的碱性氨基多糖．

低分子量壳聚糖（1owmolecularweightchitosan，简称LMWC）是壳聚糖经降解形成的可溶于水的低分子聚合物，具有抗氧化、抗菌、抗肿瘤等作用（Yinetal．，2009）．在抗氧化作用方面，壳聚糖具有很强还原能力，能有效清除羟基自由基、超氧阴离子（Fengetal．，2007；Kimetal．，2007）等自由基，减少脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的生成量，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的活性．

本课题组吉晋芳等（2008）通过测定SOD、

CAT、GPx等抗氧化酶的活性发现，LMWC对镉引起的长江华溪蟹组织器官氧化损伤有一定的防护作用．MT

具有重金属解毒功能．那么，

LMWC对MTmRNA转录水平的作用又如何？鉴于此，

本实验采用实时荧光定量PCR法（Paul-Pontetal．，2010），研究了镉胁迫下长江华溪蟹（Sinopotamonyangtsekiense）4种

组织（肝胰腺、鳃、肌肉和心脏）MT在mRNA转录水平的变化，以及在镉和LMWC联合作用下表达的变化规律，从而阐明机体防护镉污染的机理与LMWC的防护机制，为LMWC作为重金属毒性的防护剂提供科学依据．2材料与方法（Materialsandmethods）2．1

实验材料

长江华溪蟹购于太原市五龙口水产批发市场，置实验室水缸中暂养两周以上，养殖用曝气48h的自来水，实验前24h停止喂食．实验时随机选取28

只活动正常、反应灵敏的个体（体重（21．97±3．97）

g）随机分成7组进行染毒．2．2

试剂与仪器

乙醇、氯仿、异丙醇（北京化工厂），CdCl·22．5H2O

（天津市博迪化工厂），LMWC（浙江金壳甲壳生物

公司），Trizol试剂盒（北京Biomed），反转录试剂盒（TaKaRa），HSTaq酶（TaKaRa），MT和β-actin基因

的引物与探针均由上海水源生物公司合成．低温冷冻离心机（ThermoMR23），凝胶成像系统（FluorChemHD2），实时荧光定量PCR仪（7500RealTimePCRsystem，ABI），酶标仪（SpectraMaxM5）．2．3实验方法2．3．1

染毒处理

采用体外暴露法对长江华溪蟹

进行染毒．实验设计7个处理组，分别是空白对照组，

29、58、87mg·L－1Cd2+组，Cd2+（58mg·L－1）与3个不同浓度的LMWC（20、40和80mg·L－1）联合作用组，每组4只个体，且均设平行．染毒时间4d．2．3．2提取RNA严格按照Trizol试剂盒说明书操作提取各组织中总RNA，所提取的RNA用酶标仪测定其A260、A280并且计算比值，其中A260/280在1．8～2．1之间为合格．2．3．3

引物与探针

MT与β-actin基因的引物和

探针序列见表1．

表1MT与β-actin基因的引物与探针序列

Table1SequencesofprimersandprobesofMTandβ-actin

基因引物与探针序列

MT正向引物5'-CCTAGACCTGCTCGCTGATC-3'MT反向引物5'-CCGCTGTCCCTGCTGATAG-3'MT探针5'-CGTCACCGCCACTACCGTCACACC-3'β-actin正向引物5'-ATGAAGGTTATGACTGAACGAGG-3'β-actin反向引物5'-GCAGCAGCTTGAGCCATTT-3'β-

actin探针5'-TCCTTCACTACCACAGCAGAGCG-3'

2．3．4

MTmRNA表达的测定将所有提取好的RNA反转合成cDNA第一链，再以cDNA为模板在

实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR．PCR反

应体系为20μL，其中ddH2O12．3μL，Mg2+2．0μL，10×PCRbuffer2．0μL，dNTP0．1μL，正义引物

（+）和反义引物（－）各为1．0μL，TaqDNA聚合酶（5u·L－1）0．2μL，模板cDNA1．0μL，MT探针0．4μL．PCR反应条件：预变性95℃：3min；94℃：30s，55℃：30s，72℃：30s，共45个循环；在72℃延伸阶段收集荧光信号．

2030

环境科2．3．5β-actinmRNA表达的测定用管家基因（β-

actin）作参照，实验方法同上．

2．4

数据分析

数据均为MTmRNA与β-

actinmRNA表达量的比值．实验所得数据用spss15．0软件分析，各处理

组与对照组的比较用单因素方差分析，

结果用平均值±标准误差表示，

p＜0．05表示有显著性差异；p＜0．01表示有极显著差异．3结果（Results）

3．1

镉对长江华溪蟹4种组织MTmRNA表达的

诱导

从图1看出，在较高浓度58mg·L－1Cd2+

胁迫下，长江华溪蟹肝胰腺中MTmRNA表达显著升高，为对照组表达量的1．83倍（p＜0．05）；鳃组织在浓

度58mg

·L－1Cd2+时其表达量为对照组的1．52倍（p＜0．05），MTmRNA的表达显著升高，在高剂量

（87mg·L－1Cd2+）下其表达没有进一步增加．肌肉

组织在29mg·L－1Cd2+

时，其MTmRNA的表达量

为对照组的1．29倍（p＜0．05），

随着镉浓度的增加，肌肉中MTmRNA的表达呈下降趋势，但无显著

性变化．而心脏组织中MTmRNA的表达在各个剂量组下均无显著性变化．

图1镉对长江华溪蟹4种组织MTmRNA表达的诱导作用（将对照组数值标准化为1，其它组数值为与对照组的比值；与空白对照组相比，

*p＜0．05表示有显著性差异）Fig．1MTmRNAexpressionlevelsinfourtissuesofS．yangtsekienseexposedtoCd2+（Thevaluesofcontrolgrouparestandardizedas1，theothervaluesofgroupsaretheratioswiththecontrolgroup；

significantdifferenceis

indicatedby*p＜0．05comparedwiththecontrolgroup）

3．2

低分子量壳聚糖对镉诱导长江华溪蟹4种组

织MTmRNA表达的作用

由图2观察到，与58mg·L－1Cd2+

单独作用相比，加入LMWC的3个浓度组中，长江华溪蟹肝胰腺组织中MTmRNA的表达均显著下降，分别是对

学学报31卷

照组的0．60、

0．59、0．56倍（p＜0．05）．鳃中MTmRNA的表达量比58mg·L－1Cd2+显著下降（p＜0.05）．但是，在LMWC作用下肌肉和心脏中MTmRNA的表达变化与58mg·L－1Cd2+单独作用相比均没有统计学意义．

图2LMWC对镉诱导长江华溪蟹4种组织MTmRNA表达的作用（注：将浓度组（58mg

·L－1Cd2+）数值标准化为1，其它组数值为与浓度组（58mg·L－1Cd2+）的比值；与浓

度组（58mg

·L－1Cd2+）相比，#

p＜0．05表示有显著性差异）Fig．2

MTmRNAexpressionlevelsinfourtissuesofS．yangtsekienseexposedtoLMWCplusCd2+（Note：

Thevaluesof

concentration（58mg

·L－1Cd2+）arestandardizedas1，theothervaluesofgroupsaretheratioswiththeconcentration（58mg

·L－1Cd2+）；significantdifferencecomparedwithCdgroup（58mg·L－1Cd2+）isindicatedby#p＜0．05）

4

讨论（Discussions）

镉通过呼吸道和消化道进入机体，在动物体内

的半衰期长达10～35年，

不仅对肝、肾、骨和生殖等多种器官系统产生损伤，还具有一定的致癌性和致

突变性．镉暴露引起机体细胞膜受到活性氧自由基攻击，会导致脂质过氧化．李涌泉等（2008）研究指

出，镉浓度29mg·L－1和58mg·L－1暴露4d显著降低了河南华溪蟹（Sinopotamonhenanense）肝胰腺和

鳃SOD、GPx酶活性，并增加了脂质过化产物MDA的含量，反映出镉对华溪蟹组织有氧化损伤作用．

因此，有必要深入研究机体预防镉毒性作用的机制．金属硫蛋白被认为是在重金属代谢和解毒中发挥极其重要作用的生物标志物．重金属诱导MT合成主要是通过其基因转录水平来实现的．MT是自然状态下已知的唯一的含镉的蛋白质，富含半胱氨酸，具有被镉诱导高效表达的特点，其基因表达水平更能灵敏的反应生物体受镉污染程度（Fangetal．，2010）．当机体中的MT被诱导后，一方面可与镉结合，降低镉浓度；另一方面可通过清除羟自

9期周妍英等：镉对长江华溪蟹金属硫蛋白mRNA表达的诱导及低分子量壳聚糖的联合作用

2031

由基，增强抗氧化酶的活性，阻断脂质过氧化链式反应，减少脂质过氧化损伤．本实验研究表明，在镉胁迫下长江华溪蟹肝胰腺和鳃组织中MTmRNA表达水平都有不同程度的升高，其中58mg·L－1镉诱导肝胰腺和鳃MTmRNA表达达到最大值，而87mg

·L－1镉浓度下MT表达量没有进一步增加；镉浓度29mg·L－1

时显著增加了

肌肉MTmRNA表达，但是随着镉浓度的增加肌肉

组织的变化与对照组相比没有显著性差异；镉对心脏MTmRNA表达的改变没有显著性差异．其原因

可能是MT作为应激蛋白，

其诱导表达是有一定限度的，在一定条件下，其表达量随重金属浓度增加及暴露时间延长而升高，

由于MT半胱氨酸残基上的巯基与有害重金属结合，减少了重金属对机体的

毒性；而当重金属浓度持续增加时，暴露时间持续延长，MT表达量不再增加，甚至有下降趋势．从本文结果还可以看出，镉在不同组织中诱导产生MTmRNA的水平有较大差异，其中肝胰腺MTmRNA的诱导量较大，其次是鳃和肌肉组织，且与对照组

相比有显著性变化，

而心脏中MTmRNA的诱导量较低．这主要是由于肝胰腺是重金属蓄积的主要组

织，

是MT合成的重要场所，而鳃是甲壳类动物的呼吸器官，鳃中镉吸收程度强于排泄及转移．何永吉等（2007）发现，镉暴露可诱导河南华溪蟹肝胰腺和鳃中MT蛋白大量表达，且肝胰腺中的诱导量高于

鳃和肌肉的，

这与本文结果一致．此外，镉对华溪蟹心脏组织MTmRNA表达的影响及相关机制有待于

进一步研究．

低分子量壳聚糖能吸附、螯合镉离子形成复合

物（丁纯梅等，2003），减少镉进入机体的浓度；另

外，

LMWC本身还具有抗氧化作用．Sun等（2007）报道，LMWC具有相对更强的抗氧化活性，短链壳聚糖分子中的活性官能团更容易暴露出来，有利于清除氧自由基，发挥其抗氧化能力．LMWC活性羟基上的H与·

OH作用从而清除·OH；其—NH2与·OH发生取代基反应，形成稳定的大分子自由基；LMWC对Fe

2+

和Cu

2+

的螯和还可以阻断氧化性最强的

·OH的生成．LMWC清除生物体内氧自由基（O

·－

2

和·OH），不仅降低了镉的毒性，还缓解了镉对SOD

和GPx活性的抑制（吉晋芳等，

2008）．多项研究表明，

LMWC能使实验动物肝组织中的SOD、CAT等抗氧化酶显著升高，

MDA明显降低（王鑫等，2007；金黎明等，2007；高晚霞等，2009），对肝损伤有较为

明显的防护作用．本文结果显示，

在LMWC与镉联合作用下，长江华溪蟹肝胰腺和鳃中MTmRNA表达水平明显下降，而心脏和肌肉中MTmRNA水平

的变化没有显著性差异．总之，

LMWC可以保护生物体组织细胞膜免受自由基攻击，间接降低MT在

镉胁迫下的应激压力，

提高机体的防护能力．水生无脊椎动物如溪蟹对水体重金属污染比

较敏感，其生长、发育、繁殖及种群变化都会受到重金属的影响．对于LMWC而言，

深入研究其对重金属引起的水生动物毒性作用的预防机制，不但能减轻水生动物受到重金属的危害，有利于水产养殖和

水生态系统保护，而且能为综合利用壳聚糖和控制镉污染提供科学依据．

致谢：感谢国家自然科学基金项目（No．30970361，30870267），山西省自然科学基金项目（No．2008011069）和中国博士后基金项目（No．20100471580）资助．

责任作者简介：王兰（1960—），女，教授，博士生导师，主要从事典型重金属污染物的生物学效应与分子机制方面的研究．E-mail：lanwang@sxu．edu．cn．参考文献（References）：

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