中药分析学实验讲义
主 编：张 丽 单鸣秋 副主编：曹雨诞 包贝华 编 委：张爱华 邵 霞
裴玉琼
南京中医药大学中药分析教研室
2014年2月
目 录
南京中医药大学药学院教学实验中心实验室学生守则 南京中医药大学药学院教学实验中心学生实验守则
实验一、山楂的鉴别、检查和含量测定…………………………1 实验记录部分……………………………………………3 检验报告书………………………………………………6 实验二、珍视明滴眼液的鉴别、检查和含量测定………………7 实验记录部分 …………………………………………10 检验报告书 ……………………………………………13 实验三、荆感胶囊的鉴别、检查和含量测定 …………………14 实验记录部分 …………………………………………17 检验报告书 ……………………………………………20
南京中医药大学药学院教学实验中心
实验室学生守则
1. 学生进入实验室应严格掌握、认真执行本室相关安全制度、防火制度、“三废”处理办法、仪器管理、试剂管理及玻璃器皿管理等制度。
2. 进入实验室必须穿工作服及平底防滑皮质或合成皮满口鞋，不得穿拖鞋及高跟鞋。进入无菌室换无菌衣、帽、鞋、戴好口罩，非实验室人员不得进入实验室，严格执行安全操作规程。
3. 禁止使用实验室的器皿盛装食物，不允许用茶杯、食具盛装药品，更不允许用烧杯等当茶具使用。
4. 对于有毒、有害、易燃、腐蚀的物品和废弃物应按有关要求执行，严禁随地抛弃实验中产生的有毒有害或腐蚀性废弃物、污水要妥善集中处理。对违反操作规程造成事故者，应给予严肃处理。
5. 加强安全工作，确保人身安全，防止触电、中毒、爆炸等危险事故发生，离开实验室前，应认真检查水、电、气、汽和正在使用的仪器设备，关好门窗。
6. 任何人不得将实验室任何物品转送他人，其他部门借用仪器需经上级同意后，办理借用手续。
7. 进行高压、干烤、消毒等工作时，工作人员不得擅离现场，认真观察温度、时间、压力等。
8. 严禁用口直接吸取药品和菌液，如发生菌液等溅出时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方可离开现场。
南京中医药大学药学院教学实验中心
学生实验守则
1. 实验前应认真预习实验指导书，明确实验目的、掌握实验原理及步骤、熟悉仪器性能和使用方法。不迟到、早退，未经预习或无故迟到者，指导教师有权责令其停止实验。 2. 进入实验室要遵守实验室各项规章制度，保持环境卫生，不吸烟，不随地吐痰，不乱抛纸屑杂物，不大声喧哗，不随便串走。不得将与实验无关的物品带入实验室，未经允许不得将实验室物品带出实验室。
3. 实验中要遵守所使用设备的操作规程，未经指导教师允许，不准搬弄或动用与本实验无关的仪器设备。要注意节约用水、用电和易耗品，爱护器材。凡违反操作规程致使仪器损坏者应按有关管理规定赔偿。
4. 实验准备就绪后，必须经指导教师同意，方可进行正式实验，实验过程中如对实验设备有疑问，应及时向指导教师提出，不得自行拆卸。
5. 实验时要注意安全，严格遵守实验室安全制度。实验中如出现故障，应立即向指导教师报告，并停机检查原因，保护现场。
6. 实验时必须严格遵守操作规程，服从教师指导，认真观察、记录实验现象，如实记录实验数据，实验结果（数据）必须交指导教师审阅。
7. 实验完毕，应整理清点好仪器、设备、工具、量具及附件，盖好仪器罩，切断水、电源，搞好清洁卫生，保持室内整洁，经指导教师同意后，方可离开实验室。
8. 按规定时间和要求，认真分析、整理和处理实验结果，撰写实验报告，不得抄袭或臆造，按时交教师批阅。
9. 进行综合性、设计性实验的学生，在进入实验室前必须做好有关准备工作，认真阅读与实验相关的文献资料，理解实验原理，熟悉仪器性能；凡设计性实验，应预先拟订设计方案，经教师认可后，方可进行实验。
10. 对不遵守本守则的学生，指导教师和实验技术人员视情节给予批评教育，直至责令停止其实验。
实验一 山楂的鉴别、检查和含量测定
一、实验目的
1. 掌握山楂鉴别、检查和含量测定的方法。 2. 熟悉滴定法测定中药含量的注意事项和操作方法。 3. 了解山楂质量分析的目的和主要内容。 二、实验内容
1. 鉴别：薄层定性鉴别 2. 检查：醇溶性浸出物
3. 含量测定：酸碱滴定法测定本品中总有机酸的含量 三、实验原理
本品为蔷薇科植物山里红或山楂的干燥的成熟果实，具有消食健胃，行气散瘀等功效，主要含有有机酸类成分。在山楂的质量标准中，以熊果酸为对照品作为薄层鉴别的依据；以枸橼酸为代表，采用酸碱滴定法测定总有机酸含量。 四、实验步骤
【鉴别】取本品粉末1g，加乙酸乙酯4ml，超声处理15分钟，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取熊果酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录Ⅵ B）试验，吸取上述两种溶液各4µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（20:4:0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇溶液（3→10），在80℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点；置紫外光灯（365nm）下检视，显相同的橙黄色荧光斑点。
【检查】 水分 不得过12.0％(附录Ⅸ H第一法)。
取供试品2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，厚度不超过5mm，疏松供试品不超过10mm，精密称定，打开瓶盖在100～105℃干燥3小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，冷却，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品
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中含水量（%）。
【浸出物】 取供试品2g，精密称定，150ml锥形瓶中，精密加乙醇50ml，塞紧，称定重量，静止1小时后连接回流冷凝管，加热至沸腾，保持微沸1小时。放冷后取下锥形瓶密塞，再称定重量，用乙醇补足减失重量，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液10 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴中蒸干。于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30分钟，迅速精密称量。除另有规定外，供试品中醇溶性浸出物含量，不得少于21.0%。
【含量测定】酸碱滴定法测定本品中总有机酸的含量。
取本品细粉约1g，精密测定，精密加水100ml，室温下浸泡1小时，时时振摇，滤过。精密量取续滤液25ml，加水50ml，加酚酞试剂2滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）滴定即得。每1ml氢氧化钠滴定液（0.1mol/l）相当于6.404mg枸橼酸。
本品含有机酸以枸橼酸（C6H8O7）计，不得少于5.0%。 五、操作要点和注意事项 1. 重点掌握滴定法的规范操作。 2. 掌握滴定度在滴定实验计算中的应用。 六、思考题
1. 在【含量测定】项中，如果以熊果酸计算所得结果是否与以枸橼酸计算相等？请简述理由。
2. 在浸出物检查项中，为何需要微沸1小时后用乙醇补足重量？是否在所有的提取实验结束后都需要用溶剂进行补足？请简述理由。
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实验记录部分
【鉴别】（贴TLC照片） 【检查】水分 【浸出物】
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【含量测定】 WKHP（g） 标定起点读数（ml） 标定终点读数（ml） VNaOH（ml） CNaOH（mol/L） 平均CNaOH（mol/L） W山楂（g） 滴定起点读数（ml） 滴定终点读数（ml） VNaOH（ml） 总有机酸含量（%） 总有机酸平均含量（%） RSD（%） MKHP=204.22g/mol 1 2 3 计算公式：
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检验报告书
报告书编号： 检品编号： 检品名称 批 号 生产单位 检验目的 检验项目 检验依据 鉴别、检查和含量测定 2010年版中国药典一部 规 格 包 装 检品数量 送检日期 报告日期 检验项目 【鉴别】 标准规定 应检出熊果酸 检验结果 检验结论 【检查】 不得过12.0% 【浸出物】 醇溶性浸出物含量≥21.0% 【含量测定】 本品含有机酸以枸橼酸（C6H8O7）计，不得少于5.0% 结论：本品按照2010年版《中国药典》“山楂”饮片质量标准检验， 检验人
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复核人 实验二 珍视明滴眼液的鉴别、检查和含量测定
一、实验目的
1．掌握珍视明滴眼液鉴别、检查和含量测定的方法。 2．熟悉气相色谱仪的使用方法和注意事项。 3.了解珍视明滴眼液质量分析的目的和主要内容。
二、实验内容
1．鉴别：试管反应、薄层定性鉴别。 2．检查：pH值、重金属、砷盐。
3．含量测定：气相色谱法测定珍视明滴眼液中龙脑的含量 三、实验原理
本品由珍珠层粉、天然冰片、硼砂和硼酸四味药组成。本实验利用硼砂在碱性条件下与硫酸铜反应形成紫红色的配合物，从而鉴别珍视明滴眼液中的硼砂。天然冰片中的主要成分为右旋龙脑，以右旋龙脑化学对照品为对照，通过薄层层析鉴别制剂中的冰片，同时，通过气相色谱法测定样品中右旋龙脑的含量，根据测定结果，判断珍视明滴眼液质量的优劣。 四、实验步骤
【鉴别】（1）取本品1ml，加10%的氢氧化钠溶液2滴，摇匀，滴加0.5%硫酸铜溶液，摇匀，应显紫红色。
（2）取本品15ml，用乙醚振摇提取2次，每次10ml，合并乙醚液，挥至约2ml，作为供试品溶液。另取右旋龙脑对照品2mg，加乙醚制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各2μl,分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛的10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】（1）pH值 应为7.0～7.8。 （2）重金属检查
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除另有规定外，取25ml纳氏比色管三支，甲管中加标准铅溶液一定量与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml后，加水或各品种项下规定的溶剂稀释成25ml，乙管中加入按各品种项下规定的方法制成的供试品溶液2ml，丙管中加入与乙管相同量的供试品，加配制供试品溶液的溶剂适量使溶解，再加与甲管相同量的标准铅溶液与醋酸盐缓冲液（pH3.5）2ml后，用溶剂稀释成25ml；若供试品溶液带颜色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其他无干扰的有色溶液，使之与乙管、丙管一致，再在甲、乙、丙三管中分别加硫代乙酰胺试液各2ml，摇匀，放置2分钟，同置白纸上，自上向下透视，当丙管中显出的颜色不浅于甲管时，乙管中显示的颜色与甲管比较，不得更深。
（3）砷盐检查（古蔡法）
标准砷斑的制备 精密量取标准砷溶液（1µg/ml）2ml，置试砷瓶中，加浓盐酸5ml与蒸镏水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氯化亚锡试液5滴。在室温下放置10分钟后，加锌粒2g，迅速将瓶塞塞紧（瓶塞上已置有醋酸铅棉花及溴化汞试纸），并在25~40℃的水浴中反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得标准砷斑。
样品砷斑的制备 取本品1ml置试砷瓶中，加水22ml稀释后，加浓盐酸5ml，照上述方法，自“再加碘化钾试液5ml……”起依法操作，将生成的砷斑与标准砷斑比较，颜色不得更深。
【含量测定】气相色谱法测定本品中右旋龙脑的含量
色谱条件与系统适用性试验 以聚乙二醇（PEG）-20M为固定相，涂布浓度为10%；程序升温：初始温度为140℃，保持12分钟；以每分钟10℃的速率升至170℃，保持10分钟。理论板数按右旋龙脑峰计算，应不低于1900。
校正因子测定 取水杨酸甲酯适量，精密称定，加乙酸乙酯制成每1ml约含1mg的溶液，作为内标溶液。另取右旋龙脑对照品约12.5mg，精密称定，置25ml量瓶中，加内标溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，吸取2μl,注入气相色谱仪，计算校正因子。
测定法 精密量取本品5ml，置具塞试管中，精密加入内标溶液5ml，振摇提取，静置使分层，分取上清液，吸取2μl，注入气相色谱仪，测定，即得。
本品每1ml含天然冰片以右旋龙脑（C10H18O）计，不得少于0.28mg。
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五、操作要点和注意事项
1．重点掌握气相色谱仪的使用方法（SOP）。
2．pH值测定时应注意缓冲溶液的选择和pH计的校正。 3．重金属检查中，应注意：
（1）根据杂质限量计算公式，计算出标准铅溶液的取用量。
（2）加醋酸盐缓冲液前，注意比较样品管与标准管的溶液颜色，若样品管带色，应在标准管中滴加少量稀焦糖液，使两管的颜色一致，然后依法操作。
（3）标准铅溶液应在临用前精密量取标准铅贮备液新鲜配制，以防止铅的水解而造成误差。 4．砷盐检查中，应注意：
（1）取用的标准管与样品管应力求一致，管的长短、内径一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影响比色。
（2）预先安装好试砷管，醋酸铅棉花用于吸收硫化氢（锌粒及供试品中可能含有少量硫化物，在酸性溶液中即产生硫化氢），从而免除了与溴化汞作用生成硫化汞色斑的干扰。
（3）锌粒的大小以通过20目筛为宜，过细则作用太快，过粗则作用太慢。 （4）加锌粒后，应立即将试砷管插上，塞紧，以免砷化氢气体逸出。如果试砷管口试纸未装就加锌粒加塞，易发生砷化氢逸失，应重做。 六、思考题
1．影响气相色谱法定量准确性的主要因素有哪些？
2．重金属检查时，若样品管和对照管中溶液颜色不一致，为什么要调色？ 3．pH值测定和砷盐检查中还应注意哪些问题？
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实验记录部分
【鉴别】 （1） （2） 【检查】 （1）pH值 （2）重金属检查
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（3）砷盐检查 【含量测定】 C龙脑对照（mg/ml） A龙脑对照 A水杨酸甲酯对照 A龙脑供试 A水杨酸甲酯供试 C龙脑供试（mg/ml） 龙脑含量（mg/ml） 平均龙脑含量（mg/ml） RSD（%） 计算公式：
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检验报告书
报告书编号： 检品编号： 检品名称 批 号 生产单位 检验目的 检验项目 检验依据 鉴别、检查和含量测定 2010年版中国药典一部 规 格 包 装 检品数量 送检日期 报告日期 检验项目 【鉴别】 标准规定 （1） 应显紫红色 检验结果 检验结论 （2） 应检出右旋龙脑 【检查】 （1） pH值 应为7.0～7.8 （2） 重金属 不得过百万分之二 （3） 砷盐 不得过百万分之二 【含量测定】 本品含天然冰片以右旋龙脑（C10H18O）计，不得少于0.28mg/ml 结论：本品按照2010年版《中国药典》“珍视明滴眼液”质量标准检验， 检验人 复核人
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实验三 荆感胶囊的鉴别、检查和含量测定
一、实验目的
1．掌握荆感胶囊鉴别、检查和含量测定的方法。 2．熟悉高效液相色谱仪的使用方法和注意事项。 3.了解荆感胶囊质量分析的目的和主要内容。
二、实验内容
1．鉴别：薄层定性鉴别。
2．检查：含量均匀度、溶出度、水分、装量差异。
3．含量测定：高效液相色谱法测定荆感胶囊中胡薄荷酮的含量。 三、实验原理
本品为荆芥穗挥发油与适量的β-环糊精加水经过包合、喷雾干燥、灌装制得的硬胶囊剂，具有散寒解表的功效，用于风寒感冒。每粒装0.25g。 四、实验步骤
【鉴别】取本品内容物0.5g，置25ml具塞锥形瓶中，加甲醇10ml，超声处理20分钟，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取胡薄荷酮、荆芥油对照品，加石油醚（60～90℃）制成每1ml含胡薄荷酮4mg、荆芥油5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（37:3）为展开剂，展开，展距8cm，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，在90℃加热5分钟。供试品色谱中，在与胡薄荷酮对照品和荆芥油对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
【检查】含量均匀度 精密称取萘适量，加甲醇制成每1ml含3.0mg的溶液，作为内标溶液。取本品1粒，内容物置25ml具塞锥形瓶，加入10ml甲醇，囊壳用少量甲醇洗涤，洗涤液合并入25ml具塞锥形瓶中，超声处理（功率250W，频率 50kHz）20分钟，抽滤；滤渣和滤纸再加10ml甲醇，超声处理(功率250W，频率 50kHz)20分钟，抽滤，用适量甲醇洗涤2次，合并两次滤液、洗涤液至50ml
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量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取该溶液和内标溶液（萘）各1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。照含量测定胡薄荷酮项下方法测定含量，按内标法以平均含量计算，应符合规定。
溶出度 取本品，照溶出度测定法，以0.3%十二烷基硫酸钠的水溶液900ml为溶出介质，转速为每分钟100转，依法操作，经45分钟时，取溶液适量，高速离心（每分钟15000转，3分钟），倾取上清液作为供试品溶液。另精密称取胡薄荷酮对照品适量加甲醇制成每1ml约含0.02mg的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，照含量测定胡薄荷酮项下测定方法，依法测定。计算每粒中胡薄荷酮的溶出量。限度为胡薄荷酮平均实际含量的70%，应符合规定。
水分 取直径12cm左右的培养皿，加入五氧化二磷干燥剂适量，使铺成0.5～1cm的厚度，放入直径30cm的减压干燥器中。取供试品3g，混合均匀，分取约1g，置已在供试品同样条件下干燥并称重的称量瓶中，精密称定，打开瓶盖，放入上述减压干燥器中，减压至2. 67kPa（20mmHg）以下持续半小时，室温放置24小时。在减压干燥器出口连接无水氯化钙干燥管，打开活塞，待内外压一致，关闭活塞，打开干燥器，盖上瓶盖，取出称量瓶迅速精密称定重量，计算供试品中的含水量（%）。
装量差异 取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物（不得损失囊壳），硬胶囊囊壳用小刷或其他适宜的用具拭净，再分别精密称定囊壳重量，求出每粒内容物的装量。每粒装量与标示装量相比较，装量差异限度应在标示装量的±10％以内，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度1倍。
【含量测定】 照高效液相色谱法测定。
色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（80:20）为流动相；检测波长为252nm。理论板数按胡薄荷酮峰计算应不低于3000。
内标溶液的制备 精密称取萘适量，加甲醇制成每1ml含3.0mg的溶液，即得。
对照品溶液的制备 精密称取胡薄荷酮对照品适量，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液。精密量取该溶液和内标溶液各1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻
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度，摇匀，即得（每1ml含胡薄荷酮0.1mg，含萘0.3mg）。
供试品溶液的制备 取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约1.0g，精密称定，置25ml具塞锥形瓶中，加入10ml甲醇，超声处理（功率250W，频率50kHz） 20分钟，抽滤；滤渣和滤纸再加10ml甲醇，超声处理（功率250W，频率50kHz） 20分钟，抽滤，用适量甲醇洗涤2次。合并滤液和洗液至25ml量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取该溶液和内标溶液各1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.45µm）滤过，即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，按内标法以峰面积计算，即得。
本品每粒含胡薄荷酮（C10H16O），不得少于10.0mg。 五、操作要点和注意事项
1．重点掌握高效液相色谱仪的使用方法（SOP）。
2．掌握含量均匀度和溶出度的操作、计算方法和测定意义。 六、思考题
1．胡薄荷酮为挥发性成分，为何在本次试验多个项目中均采用HPLC法进行测定，而非GC法？有何优点？
2．常见的水分测定有几种方法？分别适用于什么对象？
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实验记录部分
【鉴别】 【检查】 （1）含量均匀度 （2）溶出度
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（3）水分 （4）装量差异 1 2 3 4 5 W1(g) W2(g) W(g) 6 7 8 9 10 W1(g) W2(g) W(g) 允许范围 【含量测定】 C胡薄荷酮对照（mg/ml） A胡薄荷酮对照 A萘对照 A胡薄荷酮供试 A萘供试 C胡薄荷酮供试（mg/ml） 胡薄荷酮含量（mg/粒） 平均胡薄荷酮含量（mg/粒） RSD（%） 计算公式：
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检验报告书
报告书编号： 检品编号： 检品名称 批 号 生产单位 检验目的 检验项目 检验依据 鉴别、检查、含量测定 荆感胶囊质量标准 规 格 包 装 检品数量 送检日期 报告日期 检验项目 【鉴别】 标准规定 在与胡薄荷酮对照品、荆芥油对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。 检验结果 检验结论 【检查】 含量均匀度 溶出度 不低于平均实际含量的70% 水分 不得过9.0% 装量差异 ，不每粒含胡薄荷酮（C10H16O）得少于10.0mg。 【含量测定】 结论：本品按照荆感胶囊质量标准检验， 检验人
复核人 20
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