疫苗生产用细胞基质的技术审评一般原则

【S】GH疫苗生产用细胞基质的技术审评一般

原则

药品审评中心

二〇〇五年十二月

目 录

一、概述…………………………………………………3 二、细胞基质的分类……………………………………4 三、细胞基质存在的潜在危险性………………………6 四、细胞基质的一般技术要求和评价…………………8 五、新细胞系/株的技术要求…………………………13 六、参考文献……………………………………………14 七、起草说明……………………………………………15

八、著者………………………………………………17

一、概述

生产用细胞基质是指培育病毒时所需要的细胞，是生产病毒疫苗必不可少的原材料。任何微生物的生长、繁衍都有各自的最大体的条件，病毒的生长和繁衍必需在细胞内进行。病毒疫苗是以培育、收获足够量的病毒为基础。目前培育病毒的方式主要有二种，一种是通过病毒的细胞培育取得病毒，另一种是采用病毒感染动物（包括鸡胚）获抱病毒。

生物制品的质量控制不单单是对终产品的质量控制，而是对整个生产进程的质量控制，包括原材料、中间产品、终产品和生产进程的质控等等。细胞基质作为主要原材料，其质量的好坏，直接影响疫苗的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。一般以为，用细胞基质生产疫苗，主要关注的质量问题在于可能存在的外源因子污染和某些情况下细胞本身的特性，和细胞培育中各个环节的操作，因此，只有妥帖解决上述问题，才能达到对疫苗的质量控制。

本原则主要论述细胞基质的分类、各类细胞基质的优缺点、力求从科学的角度分析和熟悉潜在的危险性，和科学客观评价细胞基质安全性和有效性常常利用的方式等等。本原则仅为一般性技术要求和原则，非强制性。希望能够有助于疫苗类制品的审评工作，同时增进药品审评机构与疫苗生产企业、疫苗研制者之间的交流。另外，希望本

原则对疫苗研制开发工作有所启迪。

二、细胞基质的分类

本原则将细胞基质分为三类，即原代细胞、二倍体细胞和传代细胞。

（一）、原代细胞

原代细胞是指直接来源于动物组织的细胞，动物组织经胰酶消化培育成单层细胞（通常贴壁生长），用于病毒的培育。如地鼠肾细胞、猴肾细胞、兔肾细胞、鸡胚细胞等。原代细胞在疫苗的生产中已利用了40连年，证明是安全有效的。我国已上市的疫苗中，乙型脑炎疫苗、肾综合征出血热疫苗、狂犬病疫苗利用地鼠肾细胞，麻疹、腮腺炎疫苗利用鸡胚细胞，风疹疫苗利用兔肾细胞，脊髓灰质炎疫苗利用猴肾细胞。原代细胞具有的长处有：利用的细胞培育液相对简单， 很多病毒都可以在原代细胞上生长繁衍，具有普遍的敏感性；原代细胞的来源比较容易，尤其是地鼠，是哺乳动物中繁衍最快的动物之一；由于原代细胞属正常细胞，没有DNA突变，无致肿瘤性。原代细胞的缺点包括：存在潜在的病毒等外源因子污染问题；来自不同个体动物的细胞质量和敏感性有不同。鉴于原代细胞的上述缺点，生产减毒活疫苗的动物应尽可能达到SPF级，至少不该低于清洁级；生产灭活疫苗的动物应尽可能达到清洁级以上，至少应采用健康动物；采用等级动物的原代细胞或传代细胞和二倍体细胞是未来生产灭活疫苗的发展方向。

（二）、传代细胞

传代细胞是可在体外持续传代的细胞系，理论上具有无穷传代的寿命。传代细胞系可以通过以下方式衍生而来，（1）人或动物肿瘤细胞的原代细胞的系列培育，例如Hela细胞、Namalva细胞等；（2）携带致癌基因的病毒，将致癌基因转化给正常细胞，成为肿瘤细胞，例如EB病毒转化的B淋巴细胞；（3）骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，例如生产单克隆抗体的杂交瘤细胞株；（4）正常细胞群的持续传代，繁衍成一个新的具有无穷寿命的细胞群，例如非洲绿猴肾细胞的传代细胞系Vero细胞、幼仔地鼠肾的传代细胞系BHK21细胞、中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系（CHO细胞）等。目前尚无用于疫苗生产的来源于人类组织的传代细胞系。

由于肿瘤细胞或携带肿瘤基因的细胞具有致肿瘤的危险，所以该类细胞不能作为细胞基质用于疫苗生产；因此用于病毒组织培育的细胞系采用非肿瘤细胞系，即正常细胞群的持续传代后繁衍的细胞系，在必然传代限度内利用，利用最多的是Vero细胞。例如，人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活（纯化）、肾综合征出血热纯化疫苗、乙型脑炎纯化疫苗均已利用Vero细胞生产。

传代细胞具有的长处包括：能够充分鉴定和标准化； 利用细胞种子库系统生产，有利于质量控制；可用于微载体生物反映器，可大规模生产； 对培育基及牛血清的营养成份要求不高。传代细胞的缺点有，理论上有致肿瘤性的危险，但WHO以为Vero细胞在150代之内利用是安全的，无致肿瘤性。

（三）、人二倍体细胞

人二倍体细胞是采用人源细胞（一般为胚胎组织）成立的细胞株，可进行体别传代培育，但具有必然的传代寿命，超过必然代次，细胞衰老，如2BS细胞、KMB-17、MRC-5细胞等。上述细胞系在疫苗的生产中利用了30连年，证明是安全有效的，无致肿瘤性。我国已上市的疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗别离利用了2BS、KMB-17、MRC-5细胞。二倍体细胞与原代细胞相较，具有能够充分鉴定和标准化的长处，可实现细胞种子库系统，成立的细胞库可连年用于生产，有利于质量控制。二倍体细胞与传代细胞相较，理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。二倍体细胞存在的缺点是，与传代细胞相较，难于大规模生产；对培育液及牛血清的营养成份要求较高。

三、细胞基质存在的潜在危险性

动物细胞用于疫苗生产，应考虑其带来的潜在危险。重点考虑病毒与其他可传播因子、细胞DNA和促生长蛋白等。

（一）、携带潜在病毒和其他可传播因子

细胞系/株本身有可能携带内源性病毒和外界污染的病毒。若是细胞基质被病毒污染，则生产出来的疫苗也会含有污染的病毒，直接影响疫苗的安全性；尤其是减毒活疫苗，由于没有灭活工艺，内源性或外源性病毒的污染可能会致使严重的后果。

人类或灵长目动物细胞系可能携带潜在的病毒，例如乙型肝炎病毒、逆转录病毒等；还有可能含有整合在细胞DNA上的病毒基因。虽然人二倍体细胞用于疫苗生产30连年，未见有病毒性污染的报导，

但仍不能完全排除人类病毒潜在污染的风险。

禽类组织细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒，但目前没有证据表明这些细胞基质生产的疫苗可向人类传播疾病。例如连年前利用含有禽白血病病毒的鸡胚生产的黄热病疫苗、麻疹疫苗、流感疫苗。虽然如此，仍应防范禽类外源和内源性逆转录病毒给人类可能带来的危害。

啮齿类动物细胞隐藏着外源和内源性逆转录病毒及其他病毒，可能携带淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、出血热病毒等，其可以直接感染人类而致病。

（二）、细胞DNA

连年来，原代细胞和二倍体细胞已成功、安全地用于多种疫苗生产，已以为这类细胞的残余DNA无危险性。由于传代细胞生长的基因失调，使得传代细胞系具有无穷的寿命。因此，理论上以为传代细胞系的DNA具有使其他细胞生长失控和产生致肿瘤活性的潜在能力。

人类对传代细胞DNA的危险性有一个慢慢熟悉的进程。1986年WHO按照动物致癌基因模型提出危险性评估，在体内暴露1ng的细胞DNA（该基因组中含有1个活化致癌基因的100个拷贝），可引发1/109个受体发生转化。并以为疫苗中含有≤100pg/剂量的细胞DNA的危险性可忽略不计。在肯定此界限时，考虑的不是DNA本身，而是编码活化致癌基因的特殊DNA序列减少到最少。

细胞DNA可致使瘤变的嵌入突变的危险性极小。有报告结果显

示，通过嵌入诱变证明，10ugDNA可致使1/107个受体的一个细胞的2个的肿瘤抑制基因失活。

1998年发表的文章表明，含有活化基因的mg级DNA注射灵长类动物，10年内未引发肿瘤。

目前以为，传代细胞系的DNA是一种细胞污染，而不是一种需要降低到极低水平的严重危险因素，但鉴于疫苗的利用者为健康人群，而且采用传代细胞生产的灭活疫苗逐渐增多，因此应尽可能降低疫苗中残余DNA含量，最大限度地降低潜在的危险。生产工艺中必需有去除DNA的工艺，并进行工艺验证。另外，β-丙内酯既可以灭活病毒，也可以降解核酸。口服制剂的残余DNA含量的危险性可忽略不计。

（三）、促生长蛋白及细胞残留蛋白

传代细胞可分泌生长因子（称促生长蛋白），该生长因子可以增进细胞生长，但作用一般是短暂的、可逆的，危险性有限。它们不能复制，而且大部份在体内迅速失活。在异样情况下有致肿瘤作用，但需要持续作用。一般以为，疫苗中含有微量的已知的促生长蛋白不组成严重危险，但仍需关注其带来的潜在危险。同时，疫苗当中的细胞残留蛋白属异源蛋白，有可能引发机体的过敏反映。因此，利用传代细胞生产的疫苗，应进行纯化，尽可能去除细胞蛋白，而且要进行纯化工艺的验证。鉴于目前尚无特异性传代细胞蛋白（包括促生长蛋白）的检测手腕，现仍以疫苗蛋白总量进行间接质控。目前，我国部份生产企业的工艺可将个别疫苗蛋白总量降至10 ug/剂量以下，其细胞蛋

白残留量相对较少。

四、细胞基质的一般技术要求

本节所论述的细胞基质的一般技术要求和评价，是针对国内外已研究成功并连年用于疫苗生产的细胞系/株，企业利用或引进该细胞系/株时，需要重点考虑的问题和需要进行验证性工作。不适用于新的细胞系。

（一）、辨别实验

一般针对细胞的特点设计实验方式，以肯定该细胞的正确性。一般可采用1～2种方式，例如可采用核型分析，生物化学法（犹如功酶分析），免疫学方式，细胞遗传学实验（如染色体标记），基因标记实验（如DNA图谱）等。

（二）、细胞基质对病毒的敏感性：

细胞培育的目的是取得足够量的病毒，若是病毒不能在细胞上很好地适应和复制，就失去了细胞培育的目的；达不到规模化生产的能力，产品研制开发的前景不容乐观。因此，选择适宜的细胞基质是疫苗研制的基础。一般选择有充沛来源的、对研发的目的病毒敏感的、能够大规模生产的、可以进行质量控制的细胞基质。有些病毒对一些细胞基质不够敏感，但可以通过在该细胞基质上适应传代的方式，使病毒慢慢适应该细胞基质，最终在必然的代次后达到必然的滴度，知足生产疫苗的需求。由于每种病毒感染细胞的滴度不同，每种疫苗所需要的病毒量（免疫原）也不同，所以目前对于疫苗毒种的滴度要求没有统一的尺度，不同的疫苗有不同的标准。例如目前已上市的疫苗

中，麻疹减毒活疫苗毒株的滴度要求为≥ml，乙型脑炎减毒活疫苗毒株的滴度要求为≥ml。因此，对细胞基质敏感性的评价不单单是结果，一样重要的是病毒在细胞基质上适应的全进程。细胞基质的敏感性直接影响疫苗的产量，只有达到规模化生产，才有生产疫苗的可能，才能起到预防传染性疾病的作用。另外，应重点考虑在细胞培育中，接种尽可能少的病毒量，收获尽可能多的病毒量。

（三）、外源因子

一个合格的细胞系/株应无任何外源因子污染，所谓外源因子是指除细胞之外污染的细菌、真菌、支原体、病毒（包括细胞系/株本身携带的病毒和外界污染的病毒）。若是细胞基质被外源因子污染，则生产出来的疫苗也会含有被污染的外源因子，直接影响疫苗的安全性；另一方面，疫苗生产的目的病毒会被外源因子干扰，可严重影响疫苗的有效性。一般进行以下项目的外源因子检测：

1 .无菌实验（细菌、真菌、支原体）：依照国家规定的方式进行。 2. 细胞法检测病毒外源因子：至少用107细胞和培育上清液转种人二倍体细胞、本细胞系的其他批次、其他种属的细胞系，应无细胞病变产生和血无吸附现象。

3. 用动物和鸡胚检测病毒因子：

采用动物体内接种法检测外源病毒因子，对动物的要求、接种途径、接种剂量、观察时间、结果判定见表1。

表1 动物体内接种法检测外源病毒因子

动物组 乳鼠 成鼠 鸡胚* 鸡胚 豚鼠 要求 数量 10（2窝） 10 10 10 5 接种途经 脑内 腹腔 脑内 腹腔 尿囊腔 卵黄囊 腹腔 皮下 皮内# 细胞浓度（活细胞数量/ ml） >107 >2×106 >5×106 >2×106 >4×105 接种量（ml/只） ×10 观察天数 21 21 3～4 5 42 结果判定 应健存 应健存 尿液血凝试验阴性 应存活 应健存，解剖无结核病变 无异常. 健存 24h内 15～20g 9～11日龄 5～6日龄 350～500g ～2.5kg 家兔 5 >2×10 521 *经尿囊腔接种的鸡胚，在观察末期，应用豚鼠红细胞和鸡红细胞混合悬液进行直接活细胞凝集实验。

＃每只家兔于皮内注射10处，每处。

。乳鼠和成鼠脑内、腹腔注射，系检测嗜神经病毒；豚鼠腹腔注射，系检测结核杆菌；家兔皮下注射，系检测猴源性B病毒；鸡胚是检测正粘病毒和副粘病毒，如流感病毒、呼吸道合胞病毒等。

4. 逆转录病毒的检测：一般用高敏感性的细胞扩增待检细胞培育物中的逆转录病毒，以扩增浓度可能很低的任何逆转录病毒污染物，然后进行检测。

逆转录酶分析：可考虑采用最新的高敏感逆转录酶分析方式。对逆转录酶阳性结果判定应谨慎，因为逆转录酶不是逆转录病毒特有的，也有其他来源，例如不能编码完整基因的类逆转录病毒因子或细胞DNA聚合酶。因此，对逆转录酶阳性的样本应进一步进行联合培育，验证是不是存在逆转录病毒。

透射电镜检测。

感染性检测：主要用于鼠源性逆转录病毒的检查。

二倍体细胞和传代细胞应采用上述方式进行外源因子检定，原代细胞因不能成立种子库，其外源因子的检测只能在生产的同时，进行对照细胞的检测，一般采用细胞病变法和血吸附法，检测结果阴性，相应的疫苗外源因子合格。

由于目前的熟悉和查验方式存在的局限性，可能还有未知的微生物因子没有被发现。当这些因子能够被确认时，需要从头检测细胞系/株中有无这些因子。

（四）、致肿瘤性

原代细胞和二倍体细胞的残余DNA无致肿瘤性。理论上传代细胞具有无穷的寿命，低于必然传代水平时，可以表现出无致肿瘤性，但随着代次的增加，其出现致肿瘤性的可能性也会增加，因此肯定一个体外培育代次的界限超级重要，细胞超过该界限不能利用。该界限应模拟生产条件并超过实际生产代次。检测方式包括动物法和软琼脂法。

1. 动物法：

裸鼠，经抗胸腺血清处置的新生小鼠或大鼠都可用于实验。可选用其中一种动物。

方式和判定： 每只动物皮下注射107 细胞/，以Hela细胞（106 细胞/）作阳性对照，有结节的观察1～2周，解剖做病理检查。无结节的，一般观察21天，另一半观察12周，解剖做病理检查，阴性者为合

格，阳性对照顾为阳性。

2. 软琼脂法。

（五）、二倍体细胞染色体分析。

为了证明二倍体细胞系的一般特性，对于主细胞库的细胞，经持续传代至衰老，设立不同传代代次组，8-12代测定一次，至少进行4次染色体检测。一个良好的细胞系，应在细胞有限的生命期内，染色体分析符合国家的相关要求，而且不同代次的结果大体相近。目前我国规定检测1000个或500个割裂中期的细胞，计算染色体数量。染色单体和染色体断裂数量别离不得超过47/1000或26/500；结构异样者不得超过17/1000或10/500；超二倍体不得超过8/1000或5/500；亚二倍体不得超过180/1000或90/500；多倍体不得超过30/1000或17/500。

（六）、种子库的成立和检定

为了保证用于生产的细胞系及生产出的疫苗没有外源因子污染，避免因传代过量引发遗传变异，需成立细胞库。一般由发明者或权威机构保留必然代次细胞种子（原始细胞库），分发或出售给生产企业，生产企业利用细胞种子制备主细胞库和工作细胞库。分发或出售者应提供细胞的分离历史、传代、检定等背景资料，及分发或出售给企业的证明文件。

主细胞库是由原始细胞种子经传代、扩增后取得均一的细胞，分装于多个容器中并在深低温保留。主细胞库应具有必然的量并通过严格、全面的检定。主细胞库的一支或多支种子可用于制备工作细胞库。

工作细胞库是由主细胞库的种子经传代、扩增后取得均一的细

胞，分装于多个容器中并在深低温保留；工作细胞库只能为一个代次，应具有必然的量并通过严格的、全面检定。工作细胞库的一支或多支种子可用于同一批疫苗生产。

主细胞库代次、工作细胞库代次及主细胞库与工作细胞库之间相隔的代次应该有明确的限定，保证用于生产的细胞代次维持恒定或在相对初期。建议将主细胞库、工作细胞库各自别离保留在至少两个不同的远离的区域，以防意外丢失细胞系。

为了避免交叉污染，在进行一种细胞开放操作的同时，不要进行其他细胞系的开放操作。工作人员在进行细胞培育的当天，不得进行动物或感染性微生物的操作。有关人员应身体健康并按期进行健康检查。

（七）、传代稳定性

在疫苗的实际生产进程中，从工作细胞库掏出一支或多支种子，细胞种子经苏醒后扩增，经多次传代才可以扩增到生产所需要的细胞量，然后感染病毒，培育收获病毒。因此，需要控制从工作种子库毒种至生产收获之间细胞的质量。细胞扩增往往通过量次细胞倍增的传代而实现，所以细胞代次的研究显得极为重要，需要进行细胞传代稳定性研究。一般采用模拟疫苗生产中细胞传代、扩增的方式进行细胞持续传代。每隔必然代次测定细胞的生长特性、对病毒的敏感性、外源因子检测等，均应符合有关要求。最末代次的检测，还应增加致肿瘤实验。建议传代稳定性研究的最末代次应超过实际生产代次的10代以上。

五、新细胞系/株的技术要求

成立一个生产疫苗的新细胞系/株，属于创新性研究。研制者除依照细胞基质一般要求进行大体研究外，还要增加其他工作。

（一）、历史来源及大体资料

成立一个新的细胞系/株，必需详细记录历史。例如成立二倍体细胞株，所用的胎儿的胎龄和性别，终止妊辰的原因。胎儿父母的年龄、职业及健康情况，胎儿父母系三代应无明显遗传缺点疾病和恶性肿瘤历史。原始组织的类型、数量、生长情况，细胞的培育方式、传代历史、生长特征、寿命的代次等等。

（二）、细胞株的检定

1.辨别实验：新细胞系/株需要自己成立辨别实验方式，并进行方式学认证。对原始种子库、主种子库和工作种子库均进行辨别实验检测，在传代稳定性研究中，每8-12代进行一次辨别实验。

2.外源因子检查 ：一个新的细胞系/株，还应选择性进行病毒检测。例如，鼠细胞系可采用大鼠、小鼠、仓鼠的抗体产生实验，以检测特异性病毒。人类细胞系可采用适当的技术进行对人类致病病毒的检测，如EB病毒、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类逆转录病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、Ⅵ和Ⅶ型疱疹病毒等。

可以考虑采用基因探针、PCR方式检测特异性病毒序列及病毒标志物，以提供附加信息。

3.致肿瘤性实验： 依照常规的方式，每8-12代进行一次致肿瘤实验检测。

六、参考文献

/TRS8781998：Requirements for use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals

Q5d:Derivation and characterization of cell substrates used for production of biotechnological/ biological product

3.《中华人民共和国药典》/2005年版 三部：生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程

七、起草说明

1.关于起草背景（含技术背景）的介绍：

细胞基质是生产疫苗必不可少的原材料，WHO、ICH和《中华人民共和国药典》收载了有关生产用细胞基质的规程，论述了有关质量要求。但连年来国内始终没有相关指导原则，致使部份研制者对实验的目的、意义不清楚，在实验设计方面不清楚、不科学、不规范，以至于延误了新药开发的进度。希望通过本文论述的原则和依据，对注册申请人开发疫苗的工作有所提示，提高研发水平。

2.指导原则起草的指导思想和一般原则：

在遵循药品研发规律的基础上，讨论药品评价者的关注点，试图减少药品研究中研究者与评价者关注点的剪子差。论述国际上对细胞基质研究的熟悉和要求，并结合中国国情，力求具有可操作性。本指导原则仅为一般性技术要求和原则，非强制性。

3.与其他指导原则的关联性及适用范围：

本文主要针对各类细胞基质本身的安全性和有效性，和保证安全性和有效性所需要进行的研究和验证。没有涉及到培育细胞的要求，如GMP要求、牛血清的要求、胰酶的要求。另外，本文不包括对重组DNA的传代细胞、医治用单克隆抗体的技术要求，有关技术指导原则另行撰写。

4.内容设置的说明：

本原则主要论述细胞基质的分类、各类细胞基质的优缺点、力求从科学的角度分析和熟悉潜在的危险性，和科学客观评价细胞基质安全性和有效性常常利用的方式等等。可是，目前我国在细胞基质研究的方式学方面存在不足，尚未成立部份检测方式，例如逆转录病毒的联合培育法、致肿瘤实验的软琼脂法等。因此本指导原则只提出需要采用上述方式检测，没有对方式进行描述，待我国成立方式并成熟后再具体写入本指导原则。

5.有关数据和资料来源的说明：

主要技术数据和资料来源于《WHO /TRS8781998：Requirements for use of animal cells as in vitro substrates for the production of biologicals》和《中华人民共和国药典》2005版 三部。

6.有关重要问题的讨论进程及结果：

有关逆转录病毒的检测，我国目前积累的经验不多，疫苗生产企业尚未进行逆转录病毒的检测，中国药品生物制品检定所已成立逆转录酶的检定方式，疫苗生产企业掌握有关方式，是增强质量控制的重

要环节。

关于细胞系/株的辨别实验，WHO有相关要求，因我国疫苗生产企业均利用常规的细胞系，如2BS、Vero细胞等，企业未对细胞系进行辨别实验的检测。中国药品生物制品检定所已成立Vero细胞的辨别实验（同功酶实验），疫苗生产企业掌握有关方式（至少进行核型辨别），是增强质量控制的重要环节。

目前，采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，Vero细胞残余蛋白（包括促生长蛋白）可能对人体有潜在的危害，特异性检测Vero细胞蛋白的方式的研究，是此后制定相关质量控制标准的基础。另外，目前阶段应尽可能降低疫苗总蛋白含量，间接控制细胞残留蛋白。

WHO提出有的国家采用探针法或PCR法测定细胞基质中的特定潜在病毒，因我国尚未开展该方面的检测及方式学认证，所以本文仅对新细胞系/株提出相关要求。

有关Vero细胞的利用代次问题，WHO推荐134~150代，以为在该代次内未发现致肿瘤性。国外疫苗生产企业通常将Vero细胞的利用代次限定在150代之内，利用150代或更低代次的Vero细胞生产疫苗，相对降低了Vero细胞致肿瘤性的潜在风险。

关于Vero细胞残余DNA问题，目前以为Vero细胞残余DNA的潜在危害除与残余DNA含量的多少有关外，还与残余DNA片断的大小有关，残余DNA含量越高、片断越大，其潜在的致肿瘤性越大。因此，强化纯化工艺是尽可能降低残余DNA含量的有效办法；另外，研究并成立检测Vero细胞残余DNA片断大小的方式，可为

此后制定相关质量控制标准奠定基础。关于Vero细胞残余DNA含量的要求，不同国家和地域有所不同，美国FDA要求≤10pg/剂量，欧盟EMEA要求≤100pg/剂量，我国要求≤100pg/剂量，WHO要求≤10ng/剂量。另外，我国已开始研制采用Vero细胞生产的脊髓灰质炎灭活（纯化）疫苗和乙型脑炎纯化疫苗，这些疫苗是实施计划免疫的产品，用于婴幼儿的免疫接种，因此对其质量要求应相对严格，需考虑Vero细胞DNA残余量≤10pg/剂量的标准。

八、著者

《疫苗生产用细胞基质的技术审评一般原则》课题研究组

关于《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》的补充说明――传代细胞残留物质的考虑

审评五部 生物制品室 高恩明

摘要：本文对《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》中细胞传代及其残留物要求的有关问题进行了重点阐述

目前，我国疫苗生产使用的传代细胞主要有两种，一种是非洲绿猴肾细胞的传代细胞系（Vero细胞）。另一种是中华仓鼠卵巢细胞的传代细胞系（CHO细胞），虽然《疫苗生产用细胞基质研究审评一般原则》不涉及CHO细胞的有关问题，但鉴于CHO细胞本身存在的问题及残留物质的重要性，本文对有关问题进行讨论。

CHO细胞主要作为表达载体，目前国内用于重组疫苗的表达，二十世纪九十年代上市的产品有重组乙型肝炎疫苗，现在仍有一些科研单位或企业正在研发某些重组疫苗，试图采用CHO细胞表达。

理论上，传代细胞的DNA和蛋白存在致肿瘤的可能性。目前国内的研究资料显示，

CHO细胞致肿瘤试验阳性，逆转录酶试验阳性。为此，《中国药典》三部（2005版）对CHO细胞表达的重组乙型肝炎疫苗提出新的要求，要求CHO细胞残余DNA含量≤10pg/剂量，CHO细胞残余蛋白占总蛋白含量的％以下，并要求在生产工艺中增加病毒灭活工艺。在药品审评中，对于未上市的新疫苗的评价，除进行技术审评之外，还需要进行效益/风险比的分析与评价。虽然CHO细胞只作为表达载体，表达的目的蛋白尚需纯化，CHO细胞的残留物质很少，但是，仍存在潜在的风险，因此不推荐新的预防用疫苗采用CHO细胞表达，更不能推荐用于婴幼儿。

近几年，我国采用Vero细胞生产灭活疫苗逐渐增多，疫苗的种类包括人用狂犬病纯化疫苗、出血热纯化疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、乙型脑炎纯化疫苗。Vero细胞是传代细胞系，理论上具有致肿瘤的可能性，已有资料报导，Vero细胞在170代以上致肿瘤试验阳性；WHO推荐134～150代，认为在该代次内未发现致肿瘤性。因此，建议我国疫苗生产些企业尽可能采用150代作为使用限定代次。

Vero细胞残余DNA、残余蛋白（包括促生长蛋白）可能对人体有潜在的致肿瘤性及其他危害，建议疫苗生产研究单位研究特异性检测Vero细胞蛋白的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。此外，目前阶段应尽量降低疫苗总蛋白含量，间接控制细胞残留蛋白。关于Vero细胞残余DNA危害，除了与残余DNA含量的多少有关外，还与残余DNA片断的大小有关，残余DNA含量越高、片断越大，其潜在的致肿瘤性越大。因此，建议疫苗生产研究单位强化纯化工艺，尽量降低残余DNA含量；此外，研究并建立检测Vero细胞残余DNA片断大小的方法，为今后制定相关质量控制标准奠定基础。 在上述采用Vero细胞生产的纯化疫苗中，乙型脑炎纯化疫苗比较特殊，因为它是国家一类疫苗，即实施计划免疫的疫苗，用于婴幼儿的免疫接种。因此，对乙型脑炎纯化疫苗的质量要求应相对严格，用于计划免疫婴幼儿使用的疫苗，采用Vero细胞生产是否合适，对于Vero细胞DNA残余量、残余蛋白含量如何要求有待讨论。目前可初步要求DNA残余量≤10pg//剂量（参照CHO细胞产品的要求），要求生产企业建立Vero细胞残余蛋白含量的检测方法并拟定质量标准。