・１３２・ 中华临床医师杂志ｆ电子版）２０１３年９月第７卷第ｌ８期Ｃｈｉｎ ＪＣｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌ￣ｃｔｒｏｍｃＥｄｉｔｉｏｎ） Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ１５，２０１３，Ｖｏ１．７，Ｎｏ．１８ 基础论著 ● ＥＲＫ１／２信号通路在高糖诱导的ＨＫ一２ 上皮间质转分化中的作用 赵建荣许珊珊 【摘要】 目的观察高糖诱导的细胞外信号调节激酶（ＥＲＫ１／２）信号通路活化在上皮间质转分化中的 作用，从而探讨延缓糖尿病肾病肾间质纤维化的发生机制。方法体外培养ＨＫ．２细胞，随机分为正常对照 组、高糖组、ＥＲＫ１／２通路抑制剂ＰＤ９８０５９＋高糖组和高渗组，处理７２ ｈ后收集细胞，应用免疫细胞化学 方法检测ａ．ＳＭＡ、ＣＫ１８的表达；应用Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔ法检测磷酸化ＥＲＫ１／２、总ＥＲＫ１／２表达水平的变化。 结果 （１）正常对照组胞质有大量ＣＫ１８蛋白阳性表达，而ｃ【．ＳＭＡ蛋白表达呈阴性；高糖组胞质中可见 大量ａ－ＳＭＡ蛋白强阳性染色，而ＣＫ１８蛋白呈阴性表达；经ＰＤ９８０５９处理后，ＣＫ１８表达较高糖组染色深， 而ａ－ＳＭＡ表达较高糖组染色浅；高渗组胞质中ＣＫ１８呈阳性表达，ｃ【．ＳＭＡ表达呈阴性。 （２）正常对照组 可见少量总ＥＲＫ１／２表达，Ｐ．ＥＲＫ１／２蛋白仅有微量表达；经高糖刺激４８ ｈ后，总ＥＲＫ１／２表达较正常对照 组无明显差异，ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白表达明显增加（户＜０．０５）；而使用ＰＤ９８０５９处理后，总ＥＲＫ１／２的变化不大， 但ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白的表达却显著降低（尸＜Ｏ．０５）；高渗组与正常对照组无显著差异。结论ＥＲＫ１／２信号通 路可能参与了高糖诱导的人近端肾小管上皮细胞（｝玎ｌ（－２）转分化过程，阻断ＥＲＫ１／２可部分抑制人近端。肾 小管上皮细胞的转分化，进而延缓肾小管间质纤维化的发生和发展。 【关键词】 肾小管； 上皮细胞； 上皮间质转分化； ＥＲＫ１／２； 磷酸化ＥＲＫ１／２ Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ＥＲＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｉｔｏｎ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｒｅｎａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ＺＨＡＯ Ｊｉａｎ－ｒｏｎｇ，ＸＵ Ｓｈａｎ－ｓｈａｎ．Ｒｅｎａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ，ＡｆｉｆｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆｌｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｈｏｈｈｏｔ ０１００５０，Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＺＨＡ０Ｊｉａｎ—ｒｏｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｊｒｚｈａｏ３３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｏｂｉｅｅｔｉｖｅ Ｔｏ ｏｂｓｅｒｖｅ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆＥＲＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｎｉ ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｉｔｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ａｎｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｕｂｕｌｏｉｍｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｘｉｍａｌ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（ＨＫ－２）ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｍ ｎ∞１ｌａ１ｇｌｕｃｏｓｅ，ｈｉ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｃｏ－ｎｉｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆｈｉｇｈｇｌｕｃｏｓｅ、 ｍ ｓｐｅｃｉｉｆｃＥＲＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＰＤ９８０５９ｏｆＤ－ｍａｎｎｉｔｏｌｆｏｒ７２ ｈ．ｈＴｅｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａ－ＳＭＡａｎｄＣＫ１８ｉｎ ａｌ１ｔｈｅ ｃｅｌｌｓｗａｓａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＥＲＫ ａｎｄ Ｐ—ＥＲＫ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ｗｅｓｔｅｍ ｂｌｏｔｔｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ（１）ｎｉ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ＣＫ１ ８ ｗａｓ ｈｉｇｈｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｈｔｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ａ－ＳＭＡ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ｅｎｈａｎｃｅｄａ－ＳＭＡｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｏｆｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｔｈｅＣＫ１８ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｆｓｃａｒｃｅｌｙ． Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｔｌｌ ＰＤ９８０５９ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ，ｔｈｅ ＣＫ１８ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｈｉ ｅｒ，ｂｕｔ ｃ【－ＳＭＡ ｓｔａｉｉｎｎｇ ｓｈａｌｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｒｅａｔｉｎｇ、】ｌｒｉｔｈ ｈｉ ｇｌｕｃｏｓｅ．Ｉｎ Ｄ－ｍａｎｎｉｔｏｌ ｇｒｏｕｐ，ＣＫ１ ８ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ｏｆ ｔｕｂｕｌａｒ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ， ｂｕｔ ｎｏ ０【－ＳＭＡ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅ＆（２）ｎｉ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｏｎｌｙ ｓｍａｌｌ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＥＲＫ１／２ ｗｅｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｍｉｎｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏ—ＥＲＫ１／２ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｉｎ ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ—ｔｒｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＥＲＫ１／２ ｈａｄ ｎｏ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｃｏ－ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｏｆｈｉｇｈ ｌｇｕｃｏｓｅ ｗｉｔｈ ＰＤ９８０５９ ｅｒｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ１／２ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉ曲ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｇｏｕｐ（Ｐ＜０．０５），ｗｈｉｌｅ ｔｏｔａｌ ＥＲＫ１／２ ｈａｄ ｎｏ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ．Ｎｏ ｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔ ｉｄｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ Ｄ－ｍａｎｎｉｔｏｌ ｇｒｏｕｐ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ＥＲＫ ｍａｙ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔｎａｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｉｇｌ１ ｇｌｕｃｏｓｅ—ｉｎｄｕｃｅｄ ＥＭＴ ｉｎ ｕｔｂｕｌａｒ ｅｐｉｈｔｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｉｎｔｅｒｆｅｒｒｉｎｇ ＥＲＫ ｍａｙ ｐａｒｔｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔ ＥＭＴ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｌａｙ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆｔｕｂｕｌｏｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｆｉｂｒｏｓｉｓ． ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ Ｋｉｄｎｅｙｔｕｂｕｌｅｓ；Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ；Ｅｐｉｔｈｅｌｉｌａ－ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｉｔｎｏ；ＥＲＫ１／２；ｐ－ＥＲＫ１／２ ＤＯＩ：１０．３８７７／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｍ．１６７４—０７８５．２０１３．１８．０４７ 基金项目：内蒙古自治区自然科学基金项目：肾小管间质纤维化分子学机制研究（２０１０ＭＳｌ１４３） 作者单位：０１００５０呼和浩特，内蒙古医科大学附属医院肾内科 通讯作者：赵建荣，Ｅｍａｉｌ：ｊｒｚｈａｏ３３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 生垡监 匡娅 壶（生王 ）２ １ 生 月箍！鲞箍 ８期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｄｉｔｉｏｎ）．ＳｅＤｔｅｍｂｅｒ １５．２０１３．Ｖｏ１．７．Ｎ０．１８ 肾小球系膜细胞扩增及足细胞的损伤是糖尿病肾 ４．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ＥＲＫ１／２和Ｐ．ＥＲＫ１／２：于７２ ｈ 病（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ，ＤＮ）早期的主要病理特征， 肾小管间质的损伤及纤维化则在ＤＮ发展为肾衰竭过 程中起到重要作用。长期以来，关于ＤＮ发病机制的 研究主要集中于肾小球，近年研究表明［１】，肾小管间质 纤维化比肾小球损伤能够更好的反映肾功能衰竭的严 弃掉培养液，用冰预冷的ＰＢＳ洗３次，加入１．０ ｍｌ冰 预冷的细胞裂解液，冰浴裂解３０ ｍｉｎ，离心取上清应 用ＢＡＣ法测定蛋白质的浓度。细胞总蛋白经ＳＤＳ． ＰＡＧＥ电泳后，电转移至ＰＶＤＦ膜，５％脱脂奶粉室温 封闭２ ｈ，ＴＢＳＴ洗膜后分别加入兔抗人ＥＲＫ１／２和 重程度。上皮间质转分化（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ—ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｉｔｏｎ，ＥＭＴ）在肾问质细胞外基质积聚、肾间质 纤维化过程中起到关键作用。业已证实 】，高糖可刺 激肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞内ＥＲＫ通路的激 活。对于ＥＲＫ通路对ＤＮ肾脏ＥＭＴ的调控效应报道 甚少。本研究采用免疫组织化学及蛋白印迹方法检测 ＥＲＫ信号通路对ＥＭＴ的影响，探讨ＥＲＫ信号通路 对ＤＮ肾间质纤维化进展机制。 材料和方法 １．主要试剂：低糖ＤＭＥＭ培养基、高糖ＤＭＥＭ 培养基、胎牛血清（美国Ｈｙｃｌｏｎｅ公司），胰酶、Ｄ． 甘露醇、ＥＲＫ１／２通路抑制剂ＰＤ９８０５９（美国Ｓｉｇｍａ公 司），鼠抗人ＣＫ１８单克隆抗体、羊抗鼠ＨＲＰ（武汉 博士德公司）、兔抗人０【．ＳＭＡ多克隆抗体、羊抗兔 ＨＲＰ（北京博奥森公司）、兔抗人总ＥＲＫ１／２和磷酸化 ＥＲＫ１／２多克隆抗体（美国ＣＳＴ公司）。 ， ２．细胞培养与实验分组：正常人近端肾小管上皮 细胞系。２（ＨＫ－２）购自中国典型培养物保藏中心 （ＣＣ１℃Ｃ），使用低糖ＤＭＥＭ＋１０％胎牛血清的培养 基，３７℃，５％ＣＯ２条件下生长。细胞长至约８０％融 合时进行消化，调节细胞浓度至２×１０ ／ｍｌ接种到６ 孔培养板。次日更换无血清培养基培养２４ ｈ，使细胞 同步生长。将细胞随机分为： （１）正常对照组（ＮＧ 组），用含５．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ低糖ＤＭＥＭ培养； （２）高糖组（ＨＧ组），用含２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ高 糖ＤＭＥＭ培养； （３）ＰＤ９８０５９组，用ＥＲＫ１／２通 路抑制剂ＰＤ９８０５９预处理细胞４０ ｍｉｎ，然后加入 ２５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ高糖ＤＭＥＭ培养； （４）高渗组 （ＭＧ组），用含５．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｄ—ｇｌｕｃｏｓｅ低糖ＤＭＥＭ＋ １９．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍａｎｎｉｔｏｌ培养，４８ ｈ后收集细胞。 ３．免疫细胞化学检测仅一ＳＭＡ、ＣＫ１８的表达：于 ６孔板培养各组细胞７２ ｈ后，爬片经ＰＢＳ洗涤３次后 用４％多聚甲醛固定，采用ＳＡＢＣ法，分别加入抗 ０【．ＳＭＡ、ＣＫ１８（工作浓度均为１：５Ｏ０），４℃孵育过 夜。第２天二抗孵育，ＤＡＢ显色，ＰＢＳ液代替一抗作 阴性对照，以细胞胞质出现棕黄色颗粒为阳性信号。 应用Ｉｍａｇｅ—Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ ６．０图像分析系统进行图像分析， 测定积分光密度值。 Ｐ。ＥＲＫ１／２多克隆抗体４℃孵育过夜，加ＩＩ抗ＦＩＲＰ标 记的羊抗兔ＩｇＧ孵育２ ｈ，ＥＣＬ显色，ｘ线片放射自显 影，扫描，照片。应用凝胶图像扫描系统对显影胶片 进行吸光度（Ａ）扫描，以１３－ａｃｔｉｎ蛋白条带作内参， 结果用靶蛋白／Ｄ—ａｃｔｉｎ比值表示，实验重复３次。 ５．统计学处理：计量资料数据均以均数±标准差 （ ±Ｓ）表示，采用ＳＰＳＳ １３．０统计软件处理，符合 正态分布，且方差齐者行单因素方差分析，两两间比 较采用ＬＳＤ法，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。 结 果 一、免疫细胞化学显示ＣＫ１８和ａ－ＳＭＡ蛋白的表达 １．免疫细胞化学显示ＣＫ１８蛋白的表达：细胞培 养４８ ｈ，正常对照组胞质有大量棕黄色颗粒，ＣＫ１ ８蛋 白呈阳性表达；高糖组ＣＫ１８蛋白表达呈阴性，与正 常对照组相比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）；ＰＤ９８０５９ 处理组ＣＫ１８蛋白表达较高糖组高（尸＜０．０５）；高渗 组胞质中ＣＫ１８呈阳性表达，与高糖组相比较有显著 差异（Ｐ＜０．０５）（图Ｉ，表Ｉ）。 表１各组ＨＫ－２细胞ＣＫ１８蛋白的表达（ ±ｓ） 组别 积分光密度值 正常对照组 ６０．９８±３．５６ 高糖组 ８＿３５±６．８３。 ＰＤ９８０５９组 ｌ５．８５±４．９０ｂ 高渗组 ５５．４５±６－３１ 注：与正常对照组比较， ＜０．０５；与高糖组比较， ＜０．０５ ２．免疫细胞化学显示０【一ＳＭＡ蛋白的表达：培养 细胞４８ ｈ后，正常对照组０【．ＳＭＡ蛋白表达呈阴性；高 糖组胞质中可见大量棕黄色颗粒， ．ＳＭＡ蛋白阳性染 色，与正常对照组相比差异有统计学意义（Ｐ＜０．０５）； ＰＤ９８０５９处理组０【一ＳＭＡ蛋白表达较高糖组低（Ｐ＜ ０．０５）；高渗组胞质中ａ－ＳＭＡ表达呈阴性，与高糖组 相比较有显著差异（Ｐ＜０．０５）（图２，表２）。 二、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示ＥＲＫ１／２和ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白相 对表达水平 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果显示，ＨＫ－２细胞培养４８ ｈ，正 常糖对照组可见少量ＥＲＫ１／２表达，ｐ－ＥＲＫ１／２仅有微量表 达；高糖刺激４８ ｈ后，总ＥＲＫ１／２表达较正常糖对照组 无明显差异，ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白表达明显上调（Ｐ＜０．０５）； ＰＤ９８０５９处理组总ＥＲＫ１／２的变化不大，但Ｐ．ＥＲＫ１／２ 的表达却显著降低（Ｐ＜０．０５），提示ＰＤ９８０５９能够抑 制ＥＲＫ１／２发生磷酸化；高渗组与对照组无明显差异 （图３，表３）。 表２各组ＨＫ－２细胞ｔｔ－ＳＭＡ蛋白的表达（ ± ） 组别 积分光密度值 ８．７６±４．９７ 炎机制减慢ＤＮ的发展。有学者［７１在链脲霉素诱导的糖 尿病大鼠肾小管中研究发现：Ｐ３８、Ｐ．Ｐ３８和ｐＥＲＫ增 加，高糖在ＬＬＣ．ＰＫ１细胞（近端肾小管细胞）中可刺 激ＥＲＫ和Ｐ３８活化，进一步诱导ＴＧＦ—ｐ，诱发细胞 肥大。王保兴等【８Ｊ研究发现高糖环境中ｍｅｇｓｉｎ基因转 染使小鼠肾小球系膜细胞血小板源性生长因子ＢＢ （ＰＤＧＦ．ＢＢ）表达增高，可能部分通过ＥＲＫ通路使 ＴＧＦ．１３１表达下调及Ⅳ型胶原合成与分泌增加，从而参 与肾小球硬化的过程。 我们的免疫细胞化学结果显示，正常对照组胞质 正常对照组 高糖组 ＰＤ９８０５９组 ４０．５２±９．３９ ２２．４３±３．０５ ７．Ｏ２±４．２８ 高渗组 注：与正常对照组比较，ａｐ＜０．０５；与高糖组比较，ｂｐ＜０．０５ 有大量ＣＫ１８强阳性染色，（ｔ－ＳＭＡ呈阴性表达。高糖 组ＣＫ１８蛋白阴性表达，胞质中可见大量ｃｔ－ＳＭＡ强阳 表３ ４８ｈ各组ＨＫ－２细胞ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白及总ＥＲＫ１／２ 蛋白相对表达水平（ ± ） 性染色，即高糖刺激４８ ｈ后，上皮性标志物ＣＫ１８表 达减弱，成纤维细胞的标志物ａ－ＳＭＡ表达增强，发生 了ＥＭＴ。经ＰＤ９８０５９处理后，ＣＫ１８蛋白染色较高糖 组深，而 ．ＳＭＡ表达较高糖组染色浅，说明ＰＤ９８０５９ 能够抑制ＨＫ－２细胞发生ＥＭＴ。高渗组胞质中ＣＫｌ８ 阳性染色，ａ－ＳＭＡ表达呈阴性 即相同渗透压的甘露 注：与正常对照组比较， ＜０．０５；与高糖组比较，ｂｐ＜０．０５ 醇与高糖组比较，对ＨＫ－２细胞无明显影响，没有诱导 ＨＫ－２细胞发生ＥＭＴ，提示高糖可以直接参与而不通 讨 论 过高渗透压诱导肾小管上皮细胞转分化，可能是ＤＮ ＥＭＴ在胚胎的发育、伤口的愈合、组织的重建、 肾间质纤维化的重要机制之一。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ法检测结 器官的纤维化及肿瘤的进展中起到关键作用。ＤＮ的主 果进一步发现，正常对照组可见少量总ＥＲＫ１／２表达， 要病理改变为正常及异常的细胞外基质（胶原、ＬＮ、 Ｐ．ＥＲＫ１／２蛋白基本仅有微量表达；经高糖刺激４８ ｈ后， ＦＮ）的积聚，包括肾小球系膜（肾小球硬化）及。肾间 总ＥＲＫ１／２表达较正常糖对照组无明显差异，ｐ－ＥＲＫ１／２ 质间隙（肾小管间质纤维化），最终导致ＤＮ患者肾 蛋白表达明显增加（Ｐ＜０．０５），与免疫组化检测结果 功能进行性下降、肾脏瘢痕形成及肾脏的纤维化。研 中０【一ＳＭＡ表达变化趋势一致，可见ＥＲＫ１／２信号通路 究证实 ，小鼠肾脏纤维化过程中，１２％的成纤维细胞 参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞的转分化过程。而 来自骨髓，３０％通过肾小管上皮细胞的ＥＭＴ而来，而 使用了ＥＲＫ信号通路特异性抑制剂ＰＤ９８０５９处理 有３５％的成纤维细胞通过与微脉管系统相关的内皮细 后，总ＥＲＫ１／２的变化不大，但ｐ－ＥＲＫ１／２蛋白的表达却 胞的内皮间质转分化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａ１ ＭＴ，ＥｎｄＭＴ）。 显著降低（Ｐ＜０．０５），提示ＰＤ９８０５９能够抑制高糖诱 高血糖作为糖尿病的最基本生化特性，可直接损 导的ＥＲＫ１／２发生磷酸化，进一步表明ＥＲＫ１／２信号通 伤肾脏，也可通过晚期氨基糖苷类代谢产物的堆积、 路在高糖诱导肾小管上皮细胞的转分化过程中起到关 多元醇通路的激活、二酯酰甘油蛋白激酶Ｃ的活化及 键作用，阻断ＥＲＫ１／２信号通路将有可能成为抑制ＥＭＴ 氧化应激等环节导致和加速ＤＮ的发生及发展。有研 的新靶点。综上可见，阻断ＥＲＫ通路的活化可能通过 究表明 ，ＥＲＫ可能参与了糖尿病肾小球内皮细胞 抑制ＥＭＴ的过程来减缓ＤＮ发生和发展的过程。 ＩＣＡＭ—ｌ激活，从而参与巨噬细胞的浸润，促进细胞基 （本文图片及参考文献见光盘） （收稿日期：２０１３．０７－２６） 质的积聚和肾间质的纤维化，而ＥＲＫ抑制剂可通过抗 （本文编辑：戚红丹） 赵建荣，许珊珊．ＥＲＫ１／２信号通路在高糖诱导的ＨＫ－２上皮间质转分化中的作用【Ｊ／ＣＤ】．中华临床医师杂志：电子版，２０１３，７（１８）：８２９４．８２９８．