动物医学进展。２０１５，３６（４）：２４—２７ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 内蒙古地区乳样中牛支原体的分离及ＰＣＲ鉴定 许金朋，黄海碧，王晓晖，郝永清 （内蒙古农业大学兽医学院微生物学与免疫学实验室，内蒙古呼和浩特０１００１８） 摘 要：为检测内蒙古地区某牛场患乳房炎的奶牛乳样中是否存在牛支原体，同时建立直接提取乳样中 牛支原体ＤＮＡ进行ＰＣＲ检测的方法，本研究无菌采集乳房炎乳样，通过支原体的分离培养、形态学观察和 生化试验，初步鉴定分离株为牛支原体，然后提取液体培养基菌体ＤＮＡ进行牛支原体特异性ＰＣＲ鉴定，同 时，采用Ｃｈｅｌｅｘ一１Ｏ０法直接提取原乳样中菌体ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴定，并测序分析扩增片段序列。液体培养 物提取ＤＮＡ与Ｃｈｌｅｘ－１００法直接提取原乳样菌体ＤＮＡ进行特异性ＰＣＲ均扩增出目的条带，该片段序列 与ＧｅｎＢａｎｋ中牛支原体ｏｐｐＤ／ｏｐｐＦ基因的同源性达到９９．８ ，证实分离株为牛支原体。说明Ｃｈｌｅｘ一１００ 法可直接提取乳样中牛支原体ＤＮＡ进行快速ＰＣＲ鉴定。 关键词：牛支原体；乳房炎；牛乳；Ｃｈｅｌｅｘ—ｉ００法；ＰＣＲ鉴定 中图分类号：￥８５２．６２；￥８５８．２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１５）０４—００２４—０４ 在牛的病原性支原体中，牛支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓ— ｍａ ｂｏｖｉｓ，Ｍｂ）的致病力仅次于丝状支原体丝状亚 种，具有很高的传染性，可迅速在牛群中传播。牛支 原体可导致犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎，此外， 还可引发中耳炎和生殖系统疾病，给世界养牛业及 特异性ＰＣＲ鉴定，建立了乳样中牛支原体快速检测 的新方法。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 样品和试剂 内蒙古某地区无菌采集的乳 房炎乳样４份，编号Ｍ１～Ｍ４；支原体基因组提取试 剂盒、Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，宝生物工程（大连）有 乳业造成了严重的损失ｌ１ ］。其中，牛支原体引起的 乳房炎病程长，可造成奶牛经久不愈而最终淘汰。 牛支原体不产生细胞壁，对影响细胞壁合成的抗菌 药物如青霉素等不敏感，此外，牛支原体对某些常用 抗菌药物，如四环素、替米考星等也逐渐产生抗 性 ］。牛支原体可通过改变膜蛋白而逃避免疫系 统，给疫苗的研发带来困难。 限公司产品；Ｃｈｅｌｅｘ一１００，Ｓｉｇｍａ公司产品；０．４５ ｍ 滤器，Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司产品；支原体生化鉴定管，青岛 Ｈｏｐｅ Ｂｉｏ公司产品。支原体液体培养基、支原体固 体培养基均按照张玲等＿５ 介绍的方法配制。 １．１．２ 引物 牛支原体特异性引物＿６。 见表１，由上 牛支原体性乳房炎的早期检测是防控该病的重 要一环。通过检测及时对病牛进行隔离和淘汰，对 海生工生物工程技术服务有限公司合成。 表１引物信息 Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ 于控制牛支原体在牛群间的传播起到了至关重要的 作用 ］。牛支原体的传统分离鉴定，包括分离培养、 形态学观察、生化试验、生长抑制试验（ｇｒｏｗｔｈ ｉｎｈｉ— ｂｉｔｉｏｎ ｔｅｓｔ，ＧＩＴ）等，常需要１周左右的时间ｌ４］。该 ｒｉｇ ｎ 引 Ｏ 扩 因 ！黪 ｉ ｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ 目；￣的ｅｂ片／ｂ段ｐｔｅｍｐｅｒａｔ ｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ 方法对于菌种的分离、纯化和保存是必须的，但作为 检测牛支原体病的方法，则太过费时、费力，且难以 适应临床需要。本研究从内蒙古地区某牛场采集乳 房炎乳样，通过病原分离、菌落观察、生化试验，初步 鉴定为牛支原体，然后通过牛支原体特异性ＰＣＲ鉴 定及序列分析，证实分离株为牛支原体。同时，采用 Ｃｈｅｌｅｘ—１００法直接提取原乳样中支原体ＤＮＡ进行 １．２方法 １．２．１ 病原分离培养 用０．４５ ｍ滤器过滤乳样， 取０．５ ｍＬ滤液接种于５ ｍＬ支原体液体培养基，于 ３７。Ｃ、体积分数为５ 的ＣＯ。培养箱中培养２ ｄ～ ３ ｄ后待液体至橙黄色时，划线接种于支原体固体培 收稿日期：２０１４—０８—３０ 基金项目：国家科技支撑计划项目（２０１２ＢＡＤ１２Ｂ０９—０２，２Ｏ１２ＧＢ２Ａ４Ｏ０Ｏ５８） 作者简介：许金朋（１９９０一），男，河北沧县人，硕士，主要从事兽医微生物学与免疫学研究。＊通讯作者 ２６ 动物医学进展２０１５年第３６卷第４期（总第２６２期） 等ｌｇ 的研究结果，即牛支原体具有群特异性的结论 相一致。 牛支原体ＤＮＡ，从而用于ＰＣＲ检测。 参考文献： ［１１ Ｐｆｕｔｚｎｅｒ Ｈ，Ｓａｃｈｓｅ Ｋ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ａｓ ａｎ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｍａｓｔｉ ｔｉｓ，ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｉｔａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ｒｅ— ｖｕｅ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，１９９６，１５（４）：１４７７—１４９４． 目前，国内外牛支原体的检测方法主要集中在 传统培养法、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ检测等方面。支原体传 统培养法，从分离到鉴定，一般需要１周左右时间。 ［２］Ｆｏｓｔｅｒ Ａ Ｐ，Ｎａｙｔｏｒ Ｒ Ｄ，Ｈｏｗｉｅ Ｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ａｎｄ ｏｔｉｔｉｓ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃａｌｖｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｊ， ２００９，１７９（３）：４５５－４５７． 使用牛支原体全菌蛋白作为包被抗原的间接 ＥＬＩＳＡ，由于牛群的高血清阳性率以及抗体滴度的 高低与牛支原体患病率并无直接关系了其作为 常规诊断方法的应用＿１ 。ＰＣＲ程序只要引物及体 ［３］Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｒ Ａ，Ａｙｌｉｎｇ Ｒ Ｄ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ：ｄｉｓｅａｓｅ，ｄｉａｇｎｏ— ｓｉｓ，ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｒｅｓ Ｖｅｔ Ｓｃｉ，２００３，７４（２）：１０５—１１２． 系参数设计得当，则影响ＰＣＲ检测牛支原体性乳房 炎的时间和灵敏度的因素在于模板ＤＮＡ的提取方 式。研究人员尝试直接提取乳样中支原体进行 ＰＣＲ检测，其中，Ｈｏｔｚｅｌ Ｈ等＿１ 和Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ等口 ］ 建立的从乳样中直接提取支原体ＤＮＡ进行ＰＣＲ， 均可用于支原体性乳房炎的诊断。然而，二者提取 ＤＮＡ的步骤繁杂，且需要胰酶或蛋白酶Ｋ的孵育 等。Ｒｏｓｓｅｔｔｉ Ｂ Ｃ等口副报道的实时ＰＣＲ及Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｈ等ｆ１ ４］报道的快速ＰＣＲ，则需要昂贵的商业化仪器 及耗材或商品化试剂盒，使其推广应用受到。 Ｃｈｅｌｅｘ一１００是一种阳离子螯合树脂，由苯乙烯一 二乙烯基苯共聚物组成，该共聚物内含配对的亚氨 基二乙酸离子作为螯合基团，对多价金属离子具有 高度的亲和力。Ｃｈｅｌｅｘ－１００法可用于血痕、毛发、精 斑等微量检材的ＤＮＡ提取，故常应用于法医学ｌ】引。 本试验尝试了以Ｃｈｅｌｅｘ一１００法直接提取乳样中支 原体ＤＮＡ。首先，利用ＥＤＴＡ处理奶样，通过离 心，去除乳样中乳脂和金属离子等物质。然后，煮沸 步骤中加入Ｃｈｅｌｅｘ－１００螯合树脂，在裂解菌体时可 保护支原体ＤＮＡ不被催化降解［１ 。最后，离心后 的ＤＮＡ溶于上清，可用于ＰＣＲ扩增。 １６ Ｓ ｒＲＮＡ基因在细菌分类学上具有重要意 义，但由于牛支原体与无乳支原体的１６ Ｓ ｒＲＮＡ基 因的同源性很高，仅有１０ ｂｐ左右的差异，故针对该 基因设计的引物难以区分牛支原体与无乳支原体。 序列比对显示，牛支原体和无乳支原体的寡肽通透 酶（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ ｐｅｒｍｅａｓｅ，０ＰＰ）基因差异较大，本 试验使用了牛支原体ｏｐｐＤ／Ｆ基因特异性引物，可 以用于鉴别牛支原体和无乳支原体 ］。本试验建立 的乳样中直接快速提取牛支原体ＤＮＡ进行ＰＣＲ鉴 定的方法，无需对原乳样中牛支原体进行分离和增 菌培养，步骤简单，所需试剂经济、安全，从提取乳样 ＤＮＡ到最后ＰＣＲ鉴定，全程仅需５ ｈ。乳样中支原 体的含量低微，常小于１００ ＣＦＵ／ｍ ”］，故由本试 验结果可证明，Ｃｈｅｌｅｘ一１ Ｏ（）法可有效地提取乳样中 ［４］ Ｆｏｘ Ｌ Ｋ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍａｓｔｉｆｓ：ｃａｕｓｅｓ，ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎ— ｔｒｏｌ［Ｊ１．Ｖｅｔ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ Ｆｏｏｄ Ａｎｉｍａｌ Ｐｒａｅｔ，２０１２，２８（２）： ２２５－２３７． ’ ［５］张玲，郝永清，黄海碧，等．内蒙古地区绵羊肺炎支原体的分 离鉴定及序列分析［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１３（７）：１５８—１６１． ［６］Ｈｏｔｚｅｌ Ｈ，Ｄｅｍｕｔｈ Ｂ，Ｓａｃｈｓｅ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｕｓｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｅｏｘｙ ｒｉｂ０ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｅ— ｖｕｅ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈ，１９９３，１２（２）：５８ｌ一５９１． ［７］Ｒｉｆａｔｂｅｇｏｖｉｅ Ｍ，Ａｓｓｕｎｃａｏ Ｐ，Ｐｏｖｅｄａ Ｊ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙ— ｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｏｆ ｃａｔｔｌｅ ｉｎ Ｂｏｓｎｉａ ａｎｄ ＨｅｒｚｅｇｏｖｉｎａＬＪ］．Ｖｅｔ Ｒｅｃ，２００７，１６０（１４）：４８４—４８５． ［８］吴移谋，叶元康．支原体学［Ｍ］．２版．北京：人民卫生出版社， ２００８：１６－２３． ［９３ Ａｅｂｉ Ｍ，Ｂｏｄｍｅｒ Ｍ，Ｆｒｅｙ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｈｅｒｄ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｍｙ— ｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｌ ｍａｓｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｐｎｅｕ— ｍｏｎｉａ［Ｊ］．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｈｉｏｌ，２０１２，１５７（３－４）：３６３—３６８． ［１０］Ｃａｓｗｅｌｌ Ｊ Ｌ，Ａｒｃｈａｍｂａｕｌｔ Ｍ．Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｉｎ ｃａｔｔｌｅ［Ｊ］．Ａｎｉａｔ Ｈｅａｌｔｈ Ｒｅｓｈ Ｒｅｖ／Ｃｏｎｆｅｒ Ｒｅｓ Ｗｏｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｎｉｍ Ｄｉｓ．２００７，８（２）：１６１—１８６． ［１１］Ｈｏｔｚｅｌ Ｈ，Ｓａｃｈｓｅ Ｋ，Ｐｆｕｔｚｎｅｒ Ｈ．Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏ— ｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ ｎａｓａｌ ｓｗａｂｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙ— ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ［Ｊ１．Ｊ Ａｐｐｌ Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ，１９９６，８０（５）：５０５— ５１０． ［１ ２］Ｈｉｒｏｓｅ Ｋ，Ｋａｗａｓａｋｉ Ｙ，Ｋｏｔａｎｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓ— ｍａ ｉｎ ｍａｓｔｉｔｉｃ ｍｉｌｋ ｂｙ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄｉ Ｓｃｉ／Ｊａｐ Ｓｏｃ Ｖｅｔ Ｓｃｉ，２００１，６３（６）：６９１—６９３． ［１ ３］Ｒｏｓｓｅｔｔｉ Ｂ Ｃ，Ｆｒｅｙ Ｊ，Ｐｉｌｏ Ｐ．Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅ，２０１０，２４（５）：３２１－３２３． ［１４１ Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｈ，１ｗａｎｏ Ｈ，Ｋａｗａｉ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅａｓｙ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｍａｓｔｉｔｉｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ ｄａｉｒｙ ｃａｔｔｌｅ ［Ｊ］．Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ，２０１１，１２（２）：１９１－１９３． ［１５３ Ｗａｌｓｈ Ｐ Ｓ，Ｍｅｔｚｇｅｒ Ｄ Ａ，Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ．Ｃｈｅｌｅｘ １００ ａｓ ａ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ—－ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｆｏ—－ ｒｅｎｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ［Ｊ］．Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ，１９９１，１０（４）：５０６—５１３． 口６］ｄｅ Ｌａｍｂａｌｌｅｒｉｅ Ｘ，Ｚａｎｄｏｔｔｉ Ｃ，Ｖｉｇｎｏｌｉ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａ ｏｎｅ ｓｔｅｐ ｍｉ ｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ”Ｃｈｅｌｅｘ １ Ｏ０”ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｒｅｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２，１４３（８）：７８５— ７９Ｏ． ［－１７］Ｂｉｄｄｌｅ Ｍ Ｋ，Ｆｏｘ Ｌ Ｋ，Ｈａｎｃｏｃｋ Ｄ Ｄ．Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｈｅｄｄｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ｏｆ ｄａｉｒｙ ＣＯＷＳ ｗｉｔｈ ｉｎｔｒａｍａｍｍａｒｙ Ｍｙｃｏ— ｐｌａｓｍａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊ Ａｍ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃ，２００３，２２３（８）： 】】６３—１１６６． 动物医学进展。２０１５，３６（４）：２７—３１ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ 鸭瘟病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用 马丽丽 ，吴 双 ，胡 成。，左伟勇。，洪伟鸣 ，王永娟 ，贾 宁 ，朱善元 （１．甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州７３００７０；２．江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，江苏泰州２２５３００；３．扬州大学兽医学院，江苏扬州２２５００９） 摘要：为建立一种简便、快速、灵敏度高、特异性好的鸭瘟病毒（ＤＰＶ）检测方法，根据ＧｅｎＢａｎｋ中公布 的ＤＰＶ ＵＬ６基因组序列，设计了３对特异性引物，建立了ＬＡＭＰ快速检测方法。该方法的灵敏度可达 ０．１ ｆｇ，对其他鸭常见病原体检测结果均为阴性，扩增反应只需在水浴锅中６０ ｍｉｎ内即可完成，可通过肉眼 观察颜色变化直接判定结果。结果表明，所建立的ＬＡＭＰ方法简便快捷，省时省力，是适用于现场和基层实 验室快速、准确检测ＤＰＶ的分子生物学方法。 关键词：鸭瘟病毒；环介导等温扩增技术；检测 中图分类号：￥８５２．６５；￥８５８．３２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—５０３８（２０１５）０４—００２７—０５ 鸭瘟（Ｄｕｃｋ ｐｌａｇｕｅ，ＤＰ），又名鸭病毒性肠炎 中和试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验 （Ｄｕｃｋ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，ＤＶＥ），是由鸭瘟病毒（Ｄｕｃｋ （ＥＬＩｓＡ）等口 ］，但这些方法存在操作较为复杂，耗 ｐｌａｇｕｅ ｖｉｒｕｓ，ＤＰＶ）引起的鸭、鹅及其他雁形目禽类 时长，敏感性较低等缺点。目前已建立的ＤＰＶ 的急性、败血性、高度致死性传染病，其特征是流行 ＰＣＲ［６ 和荧光定量ＰＣＲ¨７ 检测方法，虽然快速、特异 广泛，传播迅速，发病率和病死率高，是目前对世界 性好、敏感性高，但需要特殊的仪器设备，不适合现 范围内水禽养殖业危害较为严重的疫病之一Ｌ１Ｊ。 场和基层的应用。 ＤＰＶ的传统的检测方法包括病毒分离鉴定［２］、 环介导等温扩增（１ｏｏｐ—ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ 收稿日期：２０１４—０７—１７ 基金项目：江苏省科技支撑计划项目（ＢＥ２０１２３６６）；江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室开放课题 （ＪＳＫＬＫＦ１４０３） 作者简介：马丽丽（１９８７一），女，河北沧州人，硕士，主要从事畜禽传染病和兽医微生物学研究。＊通讯作者 Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＰＣＲ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ｆｒｏｍ Ｍｉｌｋ ｉｎ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ＸＵ Ｊｉｎ—ｐｅｎｇ，ＨＵＡＮＧ Ｈａｉ—ｂｉ，ＷＡＮＧ Ｘｉａｏ—ｈｕｉ，ＨＡＯ Ｙｏｎｇ—ｑｉｎｇ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａ，０１００１８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｉｎ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｒｏｍ ＣＯＷＳ ｉｎ ａ ｄａｉｒｙ ｆａｒｍ ｉｎ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ ｆｒｏｍ ｍａｓｔｉｔｉｓ，ｗｈｉｌｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｒｉｓ ｆｒｏｍ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ｍａｓ～ ｔｉｔｉｓ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｂｙ ｃｕｌｔｕｒｅ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ．Ｔｈｅｎ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｒｏｔｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ Ｃｈｅｌｅｘ １００ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ ｔｅｓｔｓ．Ｆｉｎａｌｌｙ， ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ｅｘｐｅｃｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｒｏｔｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｈａｄ ９９．８ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｐｐＤ／ｏｐｐＦ ｇｅｎｅ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｒｎａ ｂｏｖｉｓ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｍａｓｔｉｔｉｓ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ，ａｎｄ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ ｃｈｅｌｅｘ １００ ｆｒｏｍ ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅｓ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ；ｍａｓｔｉｆｆｓ；ｍｉｌｋ ｓａｍｐｌｅ；Ｃｈｅｌｅｘ １０ｏ ｍｅｔｈｏｄ；ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
