海藻糖复配保护剂对三种益生菌稳定性影响效果的试验研究

作者：王 岩 刘 宇 侯美如 等

来源：《农业开发与装备》 2015年第12期

王 岩，刘 宇，侯美如，尹珺伊，秦平伟

（黑龙江省兽医科学研究所，黑龙江齐齐哈尔 161006）

摘要：为检测优化后的海藻糖复配保护剂在4℃及25℃条件下对三种益生菌存放过程中活菌数变化规律并评价贮藏效果，在存放的300天中，选取平板计数法对存放不同时间的活菌总数进行统计。结果表明：三种益生菌活菌数均经历了相对稳定、迅速下降、相对稳定而又逐渐下降、又趋于稳定的过程。整个实验期内，海藻糖复配保护剂对三种益生菌保护效果为：枯草芽孢杆菌>嗜酸乳酸杆菌>粪肠球菌，4℃及25℃均可使三种益生菌活性维持300天以上，但以4℃情况下效果更为理想。

关键词：海藻糖复配保护剂；益生菌；稳定性

0 引言

微生态制剂是近几十年乃至今后一段时间内有望取代或减少抗生素应用的主要研究热点之一，益生菌是组成微生态制剂的关键因素，在应用有效期限内活菌数无疑是影响其功效的主要原因，除筛选适宜微生态菌种外，益生菌保护剂是最复杂、最难确定和选择的关键因素。适宜的保护剂不但可减少外界环境对细菌细胞的破坏、避免维持细菌蛋白质的稳定性，保持其功能与结构的完整性并可以减轻微生态制剂在干燥和保存期间过氧化物自由基对细菌细胞的伤害。

本试验采用平板计数法对海藻糖复配保护剂对三种微生态菌在不同温度存放期间的活菌数进行检测，为确定三种微生态菌应用的有效期限及海藻糖复配保护剂在其他微生态菌中的应用提供技术参考。

1 材料和方法

1.1 菌种试剂及培养基

嗜酸乳酸杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌均由黑龙江省兽医科学研究所提供。

复配保护剂主要成分为：海藻糖，PVP，L-盐酸半胱氨酸，焦亚硫酸钠，硫乙醇酸钠及EDTA-2Na等，以上成分按比例配置成三种益生菌保护剂

培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g、柠檬酸钠2g、乙酸钠5g，葡萄糖20g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、吐温-80 1ml，蒸馏水1L溶解各组分，pH值调节至6.2～6.4，115℃灭菌30min。

1.2 仪器及设备

恒温培养箱，超净工作台，微量振荡器，超速离心机，pH计，20ml试管若干。

1.3 方法

1.3.1 细菌活化及扩增。取-80℃保存的嗜酸乳酸杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌冻存管各1支，在MRS平板上划线，37℃培养36～48h，挑取单个菌落接种于1OOml液体MRS培养基，37℃静置培养24h后，按5%的接种量转接至1 000ml液体MRS培养基培养20h后，测定活菌数备用。

1.3.2 细菌悬液配制。将复配保护剂按拟定比例置20ml试管中，用振荡器充分混匀，121℃灭菌20min，加入10ml离心收集的菌体，取0.9%无菌生理盐水将菌液补充至20ml，将三种益生菌活菌含量调整至2.9×1010cfu/ml，再将其置25℃与4℃条件下保藏300天，采用平板计数法计算存活率。

1.3.3 活菌计数。采用平板计数法对三种经复配保护剂处理的活菌数进行检测：将样品摇匀后，用生理盐水依10倍梯度稀释至10-11，取10-8、10-9、10-10和10-11稀释液100μl

涂布于MRS固体培养基上，37℃厌氧培养24h后计数，以每个平板上生长30～300个菌落为宜，3次重复，求平均值。

2 结果及分析

2.1 检验结果

嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌及粪肠球菌三种益生菌检验结果。经检验，嗜酸乳酸杆菌、蜡样芽胞杆菌和粪肠球菌，均符合各自细菌形态特征，复配保护剂中各益生菌活菌数均在3×109cfu/ml以上。

2.2 活菌数变化规律

300天保藏期内嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌及粪肠球菌三种益生菌的活菌数变化规律。由表1、表2和表3可以看出：4℃保存300d的三种益生菌数量经历了0～50天相对稳定、

50～150天的迅速下降、150～250天的相对稳定而又逐渐下降而至250～300天趋于稳定的过程，活菌数由0d的2.90×1010cfu/ml减少至300天时的5.70×109cfu/ml、9.70×10cfu/ml和

4.90×109cfu/ml；25℃保存300d的三种益生菌数变化规律与4℃相近，经历的也是相对稳定、迅速下降、相对稳定而又逐渐下降、又趋于稳定的过程，只是时间有所提前。整个实验期内，海藻糖复配保护剂对三种益生菌保护效果为：枯草芽孢杆菌>嗜酸乳酸杆菌>粪肠球菌。而从整个试验周期来看，同试验最初相比，4℃保存益生菌下降数量始终低于25℃保存益生菌下降数量，表明适度低温是有三种益生菌保存。

300天保藏期内嗜酸乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌及粪肠球菌三种益生菌的活菌数变化规律。由表1、表2和表3可以看出：4℃保存300d的三种益生菌数量经历了0～50天相对稳定、

50～150天的迅速下降、150～250天的相对稳定而又逐渐下降而至250～300天趋于稳定的过程，活菌数由0d的2.90×1010cfu/ml减少至300天时的5.70×109cfu/ml、9.70×10cfu/ml和

4.90×109cfu/ml；25℃保存300d的三种益生菌数变化规律与4℃相近，经历的也是相对稳定、迅速下降、相对稳定而又逐渐下降、又趋于稳定的过程，只是时间有所提前。整个实验期内，海藻糖复配保护剂对三种益生菌保护效果为：枯草芽孢杆菌>嗜酸乳酸杆菌>粪肠球菌。而从整个试验周期来看，同试验最初相比，4℃保存益生菌下降数量始终低于25℃保存益生菌下降数量，表明适度低温是有三种益生菌保存。

3 讨论

益生菌活菌数对于应用功效有极大影响，其数量的大小对于在动物体内建立正常微生态环境、维持体内正常菌群、抑制有害微生物生长和形成优势菌群，改善动物体内的微生态环境均有显著的影响。这对于确保动物正常生长、防治疾病、改善生产性能和提高饲料报酬也具有重要的作用。

在益生菌保存中，随营养成分的利用，活菌数开始下降，必然影响实际应用效果，使其使用效果出现一定的不可靠性。因此，我们对三种益生菌进行了不同条件下的活菌数的检测。检测结果表明，虽然三种益生菌在活菌数下降存在彼此的一些差异，但是活菌数量变化经历的基本相对稳定、迅速下降、相对稳定而又逐渐下降、又趋于稳定的过程。可能是因为刚开始时保护剂各成分为最初细菌存活提供了营养（0～50天），随后后营养成分被迅速消耗，菌体加快死亡（50～125天），死亡菌体为剩余活菌提供营养，使其处于相对稳定（125～250天），当死亡菌体不足以维持其他菌体生长时，细菌数量逐渐下降至到新的平衡（250～300天）。在室温下保存10个月，活菌数仍可以维持在5.70×108cfu/ml以上。

益生菌数量是影响其使用效果的主要因素，其活菌数一般要求在3×108cfu/ml可维持其效果，试验表明室温保存300d其数量远大于3×108cfu/ml，不影响其使用效果。本试验进行的是海藻糖复配保护剂对三种益生菌单一细菌的保存效果评价，保护剂成分尽管相同，但其比例也有一定的差异，优化各成分比例，研制海藻糖复配保护剂对三种益生菌两两混合或是三者混合作用效果应该是下一步需要解决的问题。

参考文献

[1] 王婧宜.益生菌保护剂的研制[D].天津科技大学，2011.

[2] 陆英.益生菌发酵剂的研究[D].江南大学，2006.