直接降解稻草秸秆的菌株筛选及其发酵过程研究

安徽农业科学．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｎｆ１【Ｊｉ＾　ｉ　ｉ．２００６，３４（２０）：５１４４—５１４５　责任编辑姜丽责任校对胡剑胜　直接降解稻草秸秆的菌株筛选及其发酵过程研究　金显春，郭文杰，杨勇，陶文沂　（汀南大学】　业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡２１４０３６）　摘要研究了降解稻草秸秆的菌株的分离筛选方法，提出了一种全新的筛选方案，即筛选能直接降解稻草秸秆的菌株。以稻草粉琼　脂平板进行初筛，以ＮａＯＨ处理过的稻草粉为发酵培养基进行复筛，得到对稻草降解较为完全的一株茵株。研究表明，该茵株对纤维　素、半纤维素及稻草的降解率分别达７２％，９３％及８４％　关键词稻草；纤维素；半纤维素；木质素　中图分类号Ｑ８１５　文献标识码Ａ　文章编号０５１７－６６１】（２００６）２０—５１４４—０２　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒａｉｎ　Ｄｉｒｅｃｔｌｙ　Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ　Ｒｉｃｅ　Ｓｔｒａｗ　ａｎｄ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓ　ＪＩＮ　Ｘｉａｎ－ｃｈｕｎ　ｅｔ　ａｌ（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｉｎｉｓｈ￣ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｙａｎｇｔｚｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｗｕｘｉ．Ｊｉａｎｇｓｕ　２１４０３６）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｈｅ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏ（１　ｏｆ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｒｉｃｅ￣ｔｒａｗ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｓｔｒａｗ　ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｉｎｄｅｘ　ａｎｄ　ｎｅｗ　ｃｏｎｃｅｐｔ　ｏｆ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏ　ｒ’ｄｅｏ’ａｄｉｎｇ　ｒｉ＜・ｅ￣ｔｒａｗ　ｗａｓ　ｐｒｏｐｏｓｅｄ．Ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ　ｐｏｗｄｅｒ　ａｇａｒ　ｐｌａｔｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｐｒｅｌｉｍｉｎａＤ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ　ｐｏｗｄｅｒ　ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌ％ＮａＯＨ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｎｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｍ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｅｄ　ｓｃｒｅｅｎ．Ｏｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｔｈａｔ　ｅｏｕｌ（１　ｄｅｇｒａｄｅ　ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ａｎｄ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｉｃｅ　ｓｔｒａｗ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｗａｓ　ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｔｕｒｅ　ｓｔｒａｗ　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　Ｗａｓ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｓｔｒａｉｎ　０ｆ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．ｈｅｍｉ（！ｅｌｌｕｌｏｓｅ　ａｎｄ　ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ　ｒｅａｃｈｅｄ　７２％．９３％ａｎｄ　８４％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｒｉｃｅ　ｓｔｒａｗ；Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；Ｌｉｇｎｉｎ　我国的农作物秸秆每年超过８亿ｔ，秸秆组织中纤维　１．３测定内容与方法　素、半纤维索与木质素高度缠绕，致使具有降解纤维素能力　的瘤胃微生物也很难对其中的纤维素降解完毕，因此这些　秸秆难于被禽畜利用，营养价值低　而秸秆中的这３种组分　的降解是相互影响的，且降解难度几乎不相ｊ二下：虽然也有　学者考虑首先用适当的方法把３种成分分离开来，再对每　一１．３．１酶活力的测定。将稻草发酵液每天取出３瓶，３０００ｘｇ　离心２０　ｒａｉｎ，取上清液作为粗酶液。羟甲基纤维素酶　（ＣＭＣ）、滤纸纤维素酶（ＦＰ）的活力测定参照文献ｆ５，６１；木聚　糖酶活力ｆｌ３Ｎ定参照文献ｆ，７１。　１．３．２纤维素、半纤维素与木质素含量的测定。参照王玉万　的方法　，并略加改变。即用浓度为Ｊ８％的Ｈ　Ｓ０　代替浓度　为３７％的浓盐酸配制地衣酚试剂；用３％ＳＤＳ代替ｖａ　Ｓｏｅｓｔ方法配制的中性洗涤剂。　１．３．３还原糖和总糖含量的测定。还原糖采用ＤＮＳ法测　定；总糖含量采用蒽酮～硫酸法测定。　种成分加以利用ｉｉ－￣Ｉ，但仅分离的过程就使成本过高　笔　者报道了直接降解农作物秸杆菌株的筛选方法，研究了最　优菌株对纤维素、半纤维素及稻草的降解情况，为今后深入　研究该菌株降解农作物秸杆奠定了基础。　１材料与方法　１．１材料　１．４数据处理试验数据采用ＳＰＳＳ１０．０软件进行处理。　筛选到的各菌株对纤维素、半　１．１．１菌株分离来源。在无锡胡棣农家取的上１年的稻草、　麦秆；在锡“Ｊ上取的枯枝烂叶，烂玉米芯；常州农田的烂稻茬，　麦茬。　２结果与分析　２．１降解稻草菌种的筛选纤维素与稻草的总降解率见表１。从表１可以看出，各菌株　对稻草均有一定的降解能力，且菌株６的降解效果最好。　表ｌ　菌株对纤维素、半纤维素及稻草的降解率　％　１．１．２主要仪器。７５２分光光度计，由上海精密科学仪器有　限公司生产；回转式恒温凋速摇瓶柜，由上海医药工业研究　设计院生产；数显控温水浴锅，上海电理仪器厂生产　１．１．３培养基。斜面培养基：细菌为肉汤培养基；真菌为查　氏培养基；酵母为ＹＰＤ培养基。种子培养基：除不加琼脂　外，组成与斜面培养基相同。分离筛选培养基：为稻草粉琼　脂培养基，含Ｉ％稻草，１．５％琼脂（预处理过）。液体摇瓶培　养基与复筛培养基：用浓度为１％的ＮａＯＨ预处理稻草粉　液，用灭过菌的０．５　ｍｏ｜／Ｌ　Ｈ　ＳＯ４调ｐＨ值。　１．２菌株筛选方法将采集的样品用无菌水振荡，取适量　２．２稻草降解过程中生理生化指标的变化　２．２．１还原糖含量的变化。发酵过程中还原糖含量的变化　涂布稻草琼脂平板，待长出菌落后取单菌落转接到相应斜　面，培养好后，转接人相应液体种子培养基上，种子培养好　之后，接入液体摇瓶培养基，定时测定稻草中纤维素、半纤　维素与稻草的降解率。对发酵结束时总降解率高的菌株进　行多步富集与分离，直至得到降解效果良好的菌株。试验设　３个重复　作者简介全显春（１９７２一），女，湖南郴州人，博士研究生，研究方向　从事废弃物的降解研究：＊通讯作者　收稿日期２００６—０６－２８　见图１。从图１可以看出，还原糖的含量在第６天之前处于　缓慢上升阶段；在第６　７天还原糖含量骤降；在第８　１１天，　还原糖含量几乎保持不变。　２．２．２总糖含量的变化。发酵过程中总糖含量的变化见图　２　从图２可以看出，前３天总糖含量下降较快，并于第３天　到达最低值；之后总糖浓度又略有回升；第６天后，总糖含　维普资讯 http://www.cqvip.com

３４卷２０期　０．３　金显春等　直接降解稻草秸秆的菌株筛选及其发酵过程研究　３．５　５１４５　Ｉ　３．０　ｒ　ｌ　Ｏ．２５　量　｛　兰　＼＼　如　Ｏ－２　２．５　Ｌ　烛　如　攀　避　肇　２．Ｏ　ｒ　蝌　１．５　１　２　３　４　５　６　７　８　９　１Ｏ　ｌ１　发酵时间／／ｄ　图２发酵过程中总糖含量变化　看出，在前５天３者降解率都处于　升阶段；第５天后，降　解率儿乎不再变化。其中半纤维素的降解率最高，这与酶活　变化是一致的：　３讨论与结论　我闻是农业大围，农作物秸秆资源十分丰富，如能合理　利用，则可变废为宝。生物法利用农作物秸秆是一种很有前　途的处理厅法：但目前尚缺乏对农作物秸秆完全降解的高　表２　降解过程酶活变化　Ｕ／Ｌ　活性菌株。以前利用农作物秸秆的菌株筛选，大多以纤维素　的降解率为指标，虽然筛选到了高效降解纤维素的菌株，但　对秸秆总体的降解不甚满意。陔试验采用一种新的筛选方　案，即筛选能直接降解稻草秸秆的菌株，并证明该筛选方案　是可行的：得到的最优菌株ＣＭＣ活力达２２３．６２　Ｕ／Ｌ，木聚糖　酶活力达ｌ　６ｌ５．７５　Ｕ／Ｌ，ＦＰ活力达５．９　Ｕ／Ｌ；对纤维素、半纤　维素及稻草的降解率分别达７２％，９３％及８４％　该研究为　今后深入研究该菌株降解农作物秸杆奠定了基础：　参考文献　［１ｊ陈洪章，乍佐虎．木质纤维原料组分分离的研究『Ｊｌｌ纤维素科学与　２．２．４纤维素、半纤维素与稻草降解率的变化。发酵过程中　纤维素、半纤维素与稻草降解率的变化见图３　从图３可以　技术，２００３，１１（４）：３１—４０．　［２１　ＢＡＤＡ１　Ｃ．Ｈｅｍｉｅｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ［Ｊ］Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｉａｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３（３０）：２７９—２９　１．　［３１　ＣＡＮＩＬＨＡ　Ｌ，ＣＡＲＶＡＬＨＯ　Ｗ，ＡＬＭＥＤＡ　Ｊ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．１ｎｆｌｕｅｎ（・Ｃ　ｏｆ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｎ　ｘｙｌｉｔｏｌ　ｂｉｏｐｒｏｄｕｅｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｗｈｅａｔ　ｓｔｒａｗ　ｈｅｍｉｃｅｌｈｆｌｏｓｉｃ　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ　ｌＪ］．Ｗｏｒｈｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｅｒｏ１）ｉｏｌｏｇｙ＆　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５（２１）：１　０８７—１　０９３．　零　［４１　ＨＯＦＲＩＣＨＴＥＲ　Ｍ．Ｒｅｖｉｅｗ：ｌｉｇｎｉｎ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｂｙ　ｎｌａｎｇａｎｅｓｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＭｎＰ）［Ｊ　Ｊｌ　Ｅｎｚｙｍｅ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ），２００２（３０）：　４５４—４６６．　讳　莲　世　【５ｌ中国科学院　海植物生理研究所．二株高活力纤维素分锯菌Ｎ２—　７８和ＥＡ３—８６７的获得及其特性的比较ｌＪ１、微生物学报，１９７８，１８　（１）：２７—３８．　［６］王淑军，畅从发，陈静、纤维素酶酶解稻壳条件试验［ＪＩ．微乍物学通　报，１９９５（６）：３５４—３５７．　【７】赘笛　皮，冯观泉，袁超．饲用木聚糖酶活删定方法的￣ｆ％ＩＪ］．浙江农　业学报，２００４，１６（２）：５３—５８．　枝酶Ｎ－Ｎ　ｆ　图３发酵过程中纤维素、半纤维素与稻草降解率　［８ｊ王玉万，徐文玉．小喷纤维素固体基质发酵物中半纤维素、纤维素和　木　素的定量分析程序ｌＪ１．微生物学通报，１９８７（１４）：８１－８６　（上接第５１４３页）　ｆ２］鲁植雄．分形理论及其在农业土壤中的应用［ＪＩ＿土壤学进展，　１９９４．２２（５）：４０—４５，３５．　［６１　ＲＩＥＵ　Ｍ，ＳＰＯＳＩＴＯ　Ｇ．Ｆｒａｅｔａｌ　ｆｌａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ、ｓｏｌ　ｌ　ｐｒｏｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｗａｔｅｒ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：Ｉ．Ｔｈｅｏｕ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｓｏｃ　Ａｍ　Ｊ，１９９１（５５）：　１　２３１—１　２３８．　【３　ＳＥＲＲＡ　Ｊ．３】Ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　ｍａｔｈｅｍａｔｉａｌ　ｍ（）ｒｐｈｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ａｃａｄｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ．１９８２。　【７】ＲＩＥＵ　Ｍ、ＳＰＯＳＩＴＯ　Ｇ．Ｆｒａｃｔａｌ　ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ、ｓｏｉｌ　ｐｒｏｓｉｔｙ　ａｎｄ　ｓｏｉｌ　ｗａｔｅｒ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：ｌＩ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｓｏｃ　Ａｍ　Ｊ，１　９９　１（５５）：　１　２３９一ｌ　２４４　【４］ＡＲＹＡ　Ｌ　Ｍ，ＰＡＲＩＳ　Ｊ　Ｆ．Ａ　ｐｈｙｓｉｃ０ｅ　ｐｉｒｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌ　ｔｏ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ｓｏｉｌ　ｍｏｉｓｔｕｒｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｆｒｏｍ　ｐａｒｔｉｃｌｅ－ｓｉｚｗ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｂｕｌｋ　［８】ｍ和　．岩土介喷的分形扎隙和分彤柠子ＩＪＪ．力学进展，１９９３，２３　（２）：１４５—１６４．　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｄａｔａ［Ｊ］．Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｓｏｃ　Ａｍ　Ｊ，１９８１（４５）：１　０２３—１　０３０．　ｆ５］ＴＹＬＥＲ　Ｓ　Ｗ，ＷＨＥＡＴＣＲＡ丌Ｓ　Ｗ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｒａｃｔａｌ　ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ　【９】牟保国．分形理论在土壤科学中的应用及其展望『Ｊ１．｝　壤学进展，　ｌ９９４，２２（１）：ｌ—ｌ０．　ｔｏ　ｓｏｉｌ　ｗａｔｅｒ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ『Ｊ１．Ｓｏｉｌ　Ｓｃｉ　Ｓｏｃ　Ａｍ　Ｊ，１９８９（５３）：　９８７—９９６．