一. 实验目的
1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二. 实验原理
高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：
R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(Y1/2＋Y1/2)
式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； Y1/2 与Y1/为此相邻两峰的半峰宽。 除另外有规定外，分离度应大于1.5。本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。 但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件
出峰次序 1 2 3 样品组成 邻苯二甲酸二甲酯（DMP） 邻苯二甲酸二乙酯(DEP) 邻苯二甲酸二丁酯(DBP)
如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂 1、仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂
甲醇（色谱专用），高纯水 四. 实验步骤 1、色谱条件
色谱柱：苯基柱，柱温：室温
流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器(二极管阵列检测器)； 检测波长：220nm；
进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。 2、待测溶液的配制
首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定
(1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。
(2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。
(3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。
(4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。
五.实验结果
（1）流动相的比例为：高纯水：20%甲醇：80%，流速为1ml/min，记录色谱图，并计算分离度；
peak number 1 2 3
retention time(min) peak width at half height 3.154 0.1045 3.723 0.1039 6.477 0.1716
峰1与峰2之间的分离度：R1(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(3.723-3.154)/{1.7*(0.1039+0.1045)}=3.21
峰2 与峰3之间的分离度：R2(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(6.477-3.723)/{1.7*(0.1039+0.1716)}=11.76
从峰与峰之间的分离度：3.21与11.76可以看出，三种物质分离的已相当的好，分离度很高。
虽然等度洗脱分离度已经很高，但是出峰时间却较长，所以为了缩短时间，我们必须调节洗脱液按梯度浓度来进行洗脱。 （2）梯度洗脱程序为： time
0 1.5 3 5
methanol% 80 90 100 80
其色谱图如下：
peak number 1 2 3
retention time 2.931 3.334 4.360
peak width at half height 0.0895 0.0837 0.0949
峰1与峰2之间的分离度：R1(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(3.334-2.931)/{1.7*(0.0837+0.0895)}=2.74
峰2 与峰3之间的分离度：R2(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(4.360-3.334)/{1.7*(0.0949+0.0837)}=6.76 （3）梯度洗脱程序为： time 0 1.5 3 5
methanol% 90 90 100 90
下面是我们所得到的色谱图：
peak number 1 2 3
retention time 2.503 2.657 3.224
peak width at half height 0.0829 0.0753 0.0915
峰1与峰2之间的分离度：R1(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(2.657-2.503)/{1.7*(0.0753+0.0829)}=1.02
峰2 与峰3之间的分离度：R2(resolution)= 2[t(R2)-t(R1)] /{1.7*(Y1/2＋Y1/2)} =2*(3.224-2.657)/{1.7*(0.0753+0.0915)}=4.0
按此洗脱程序，我们可以看见，出峰时间由上程序的4.4min降到了本次的3.2min，可以说又缩短了不少时间，然而我们却可以看到峰2与峰1重叠了，没有分开，他们之间的分离度只有1.02.可见时间固然宝贵，然而分离效果才是根本。
（4）定性过程DMP,采用第二个样品的梯度洗脱程序：
实验得到如下的色谱图下：
从色谱图我们可以知道，在实验二的梯度洗脱程序中，DMP的出峰时间为2.950min。对比实验二的色谱图，我们可以看见在2.931也有一个峰，可以判定，在三种物质的混合液中，DMP最先出峰。这是由于DMP的极性在三者中最大的原因。
六. 思考题
（1） 比较图2和图3可知，在缓冲液作流动相的情况下，实验得出的峰形较好。但为什么实验室尽量不用缓冲溶液作流动相？
图2 缓冲液作流动相得出的色谱图
图3 乙腈-水（5：95）作流动相得出的色谱图
——————1）缓冲溶液会缩短色谱柱的使用寿命；
2）缓冲溶液还要现配现配现用，否则时间久了，缓冲溶液容易滋生微生物，堵塞色谱柱；
3）在梯度洗脱中使用缓冲溶液，如果洗脱液的有机物比例比较高，缓冲溶液容易析出，导致色谱柱的堵塞。
4）由于本次实验要分离的体系很简单，且不做定量。所以虽然出的峰比较差，但不影响教学效果，所以没必要。而且使用缓冲溶液后，洗柱更麻烦，必须先用低有机物浓度溶液进行洗柱，然后才可以用纯甲醇洗柱。
（2）流动相在使用前为什么要用砂芯漏斗过滤？
————这是由于色谱柱的内径小，填充物的粒径只有0.5um，色谱柱内填充物堆积很密集，导致空隙小，要是进入了固体小颗粒，很有可能会堵塞色谱柱，对色谱柱造成损害，所以流动相在使用之前必须用砂芯漏斗过滤。
（3）请分析实验结束后，怎样清洗柱子。分为两种情况，第一种情况为流动相用到缓冲溶液，第二种情况为流动相不用缓冲溶液？
————如果流动相用到缓冲溶液如磷酸盐缓冲溶液，在实验完成之后，要先用低有机物浓度的溶液清洗管路，然后再用纯有机物清洗管路，直到柱压降到60左右Barr为止；如果实验中没有用到缓冲溶液，则可以直接有纯有机物清洗管
路，直到柱压降到60Barr左右。
（4）根据实验结果分析，流动相中水的比例多少对分离度、出峰时间的影响。
———————根据实验结果分析，当洗脱程序如下是分离效果最好。 time methanol% 0 80 1.5 90 3 100 5 80
又通过和等梯度洗脱与另一个梯度洗脱程序效果对比，我们可以得出： 流动相中水的比例越高，分离度越好，出峰时间越长； 流动相中的水的比例越低，分离度越低，出峰时间越短； 可见在分离度与出峰时间两方面。我们必须做一个折中，在保证完全分离的前提下，尽可能的缩短出峰时间。
七，实验小结
（1）本次实验主要是探究梯度洗脱对分离效果的影响，梯度洗脱对于液相色谱的重要性，和程序升温对于色相色谱的重要性一样，是影响分离效果的主要影响因素，因此在进行探究实验时，必须不断地优化梯度洗脱，找出最适宜的梯度洗脱程序，这样才能使实验在最短时间内做出最理想的结果。
（2）高效液相色谱特别适合分离分析大分子、高沸点、强极性、热不稳定性化合物，以及具有生物活性和多种天然产物，弥补了气相色谱的不足。近年来，由于生命科学的兴起与备受关注，高效液相色谱的作用也就更加明显。
（3）液相色谱与气相色谱的分离原理是一样的，然而其仪器设备却又有比较大的区别：
1，气相色谱柱的毛细管柱细而长，可达几十米；液相色谱的色谱柱主要是填充柱，它们的长度多为：10—20cm，虽然短，但是其柱效却不低，可以说是短小精悍。
2，液相色谱要用到高压泵，其柱头压可以达到80左右个大气压，而气相色谱中的载气压力只有半个大气压左右。这主要和液相色谱柱的填充物质的粒径和密集程度有关，色谱柱的流通体积很小，不得不用高压泵，这也是它做的比较短的原因，要是他也弄个几十米，恐怕一两天物质也未必出峰。
3，在检测器方面，气相色谱主要使用：FID,ECD,MSD,FPD等，而液相色谱却使用：UV-VIS,PDAD,DRD等，本次实验所用的时UV-VIS，其内部的检测器是DAD（二极管阵列检测器）。
八，参考资料
1，现代仪器分析技术及应用 魏福祥等著 中国石化出版社 2，
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