２０１ ７ Ｖｏ１．３６ Ｎ０．７ ・７６・ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．３０５ Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ 浓香型白酒窖泥中芽孢杆菌的分离鉴定及代谢产物分析 刘燕梅 ，王艳丽 ，一，汪文鹏 ，李永博 ，吴树坤 ，刘 梅 ，黄治国 （１．宜宾市产品质量监督检验所，四川宜宾６４４０００；２．四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川Ｉ自贡６４３０００； ３．安徽古井集团有限责任公司技术质量中心，安徽亳州２３６８００） 摘要：从浓香型白酒窖泥中筛选出３细菌，经磷脂脂肪酸（ＰＬＦＡ）鉴定，分别为球形赖氨酸芽孢杆菌（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｅｕｓ）、 短芽孢杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、尘埃类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｕｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）。采用固相微萃取结合气相色谱．质谱 联用（ＳＰＭＥ—ＧＣ—ＭＳ）技术分析３株菌发酵产物，结果表明，ａｍ菌产风味物质能力较强且种类丰富，主要为高级醇、高级酮等芳香类化 合物，它们作为白酒中的微量成分，对浓香型白酒风味的形成起着放香、助香及调香的作用。因此，这３株菌的代谢产物对浓香型白酒 风味物质的形成有一定影响。 关键词：浓香型白酒；窖泥；芽孢杆菌；分离；磷脂脂肪酸鉴定；代谢产物分析 中图分类号：ＴＳ２６１．１ 文章编号：０２５４—５０７１（２０１７）０７—００７６—０４ ｄｏｉ：１Ｏ．１１８８２／Ｉ．ｉｓｓｎ．０２５４—５０７１．２０１７．０７．０１７ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｎ ｉｐｉｔ ｍｕｄ ｏｆ Ｌｕｚｈｏｕ－ｌｆａｖｏｒ Ｂａｉｊｉｕ Ｌ１Ｕ Ｙａｎｍｅｉ ，ＷＡＮＧ Ｙａｎｌｉ ，ＷＡＮＧ Ｗｅｎｐｅｎｇ２，ＬＩ Ｙｏｎｇｂｏ ，ＷＵ Ｓｈｕｋｕｎ ，ＬＩＵ Ｍｅｉ ，ＨＵＡＮＧ Ｚｈｉｇｕｏ ｆ１．ＹｉｂｉｎＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｉｆｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｙｉｂｉｎ ６４４００￣Ｃｈｉｎａ；２．ＬｉｑｕｏｒＭａｋｉｎｇＢｉｏ－Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆ ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ Ｓｉｃｈｕａｎ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｉｇｏｎｇ６４３００￣Ｃｈｉｎａ； ３．Ｔｈｅ ＴｅｃｈｎｉｃａｌＱｕａｆｉｙＣｅｔｎｔｅｒｏｆＡｎｈｕｉ ＧｕｊｉｎｇＤｉｓｔｉｌｌｅｒｙＣｏｍｐａｎｙＬｉｍｉｔｅｄ，Ｂｏｚｈｏｕ２３６８２０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｒｅｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆｂａｃｔｅｒｉａ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｐｉｔ ｍｕｄ ｏｆＬｕｚｈｏｕ—ｌｆａｖｏｒ Ｂａｉｊｉｕ．Ｔｈｒｏｕ曲ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ（ＰＬＦＡ）ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｉｅｄ ａｓｆ Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｅｕｓ，Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ ａｎｄ Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｓｕｂｓｕｐ．ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｓｌｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｍｉｃｒｏｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｈｔ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＳＰＭＥ—ＧＣ—ＭＳ）．Ｔｈｅ ｍｓｕｌ￣ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｒｅｅ ｈｓｔｒａｉｎｓ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｌａｖｏｒｆ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ｖａｆｉｏｕｓ ｋｉｎｄｓ，ｍａｉｎｌｙ ｆｏｒ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｌｃｏｈｏｌｓ ａｎｄ ｋｅｔｏｎｅｓ）．Ａｓ ｔｈｅ ｔｒａｃｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｉｎ Ｂａｉｊｉｔ￣ｔｈｅ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｐｌａｙｅｄ ａｎ ｐｕｔｔｉｎｇ ｉｎｃｅｎｓｅ，ｈｅｌｐｉｎｇ ｉｎｃｅｎｓｅ ａｎｄ ｂｌｅｎｄｉｎｇ ｉｎｃｅｎｓｅ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｏｒｆｍａ— ｔｉｏｎ ｏｆＢａｉｊｉｕ ｌｆａｖｏｒ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆｔｒｅｅｈ ｓｒｔａｉｎｓ ｈａｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｆｅｃｔ ｏｎ ｈｅｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆｆｌａｖｏｒ ｓｕｂｓａｔｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｕｚｈｏｕ—ｌｆａｖｏｒ Ｂａｉｊｉｕ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｕｚｈｏｕ—ｌｆａｖｏｒ Ｂａｉｊｉｕ；ｐｉｔ ｍｕｄ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ；ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＰＬＦＡ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ；ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ 白酒是世界五大蒸馏酒之一，具有多种不同的香型， 其中浓香型白酒在中国白酒行业有着重要的地位。窖池微 生物在白酒酿造过程中对白酒产量、质量有着重要的影响， 其代谢产物是白酒呈香呈味物质的基础。赵爽 －］研究发 现，在白酒的酿造过程中，微生物与白酒的风味之间有着 一味物质的产生有着重要的意义。 目前，针对微生物的鉴定方法有基于聚合酶链反 （ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）技术的脱氧核糖核酸 （ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＤＮＡ）测序、Ｂｉｏｌｏｇ微生物鉴定、磷 脂脂肪酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒ ｌｉｐｉｄ ｆａｔｒｙ ａｃｉｄ，ＰＬＦＡ）分析技术等。 定的联系。张霞等［２１研究发现，浓香型白酒窖泥中可培养 ＰＬＦＡ分析技术是一种基于生物化学手段的一种微生物牛 细菌主要是芽孢杆菌（ＢａｃⅢｕｓ），以地衣芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）为主，也存在少量球形芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ），及极少量的短芽孢杆菌属（Ｂａｃ棚ＵＳ ｂｒｅｖｉｓ）。叶 光斌等嘲利用基因文库法研究发现窖泥中含有大量的芽孢 态学研究技术，是一种快速且可靠的分析检测方法［４１，它 是活体微生物细胞膜的成分且含量相对稳定，具有多样性 和生物学特异性，易于提取进行定性、定量的研究［５］。脂类 物质是构成生物细胞膜的成分，在细胞中含量稳定，约 细胞干质量的５％同。在细胞中含有脂肪酸的脂类物质只有 杆菌属，经克隆文库测序发现，有ｌ６个克隆子与可培养的同 源性较高，如芽孢杆菌属、枝芽芽孢杆菌属（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）以 及Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ。芽孢杆菌属是白酒酿造中的主要原核微 碳水化合物、脂性醇、磷脂和糖脂等，通常这种脂类物质的 组成和含量在同一种微生物中是稳定和可遗传的川。ＰＬＦＡ 谱图分析方法的原理是基于脂类几乎是所有生物细胞膜 生物，因此探究其种属及发酵特性对浓香型白酒生产及风 收稿日期：２０１７－０３—１４ 基金项目：固态发酵资源利用四川省重点实验室开放基金项目（２０１５ＧＴＹ００４）；地方高校国家级大学生创新创业训练计划项目（２Ｏｌ２１Ｏ６２２Ｏｌ４） 泸州老窖科研奖学金项目（１３１ｊｚｋ０３） 作者简介：刘燕梅（１９８８一），女，助理工程师，硕士，研究方向为酿酒生物技术。 通讯作者：黄治国（１９７８一），男，教授，博士，研究方向为发酵工程。 研究报告 中 国 酿造 ２０１７年第３６卷第７期 的重要组成成分，不同微生物体内磷脂脂肪酸组成和含量 水平不同，其含量与结构有着种属特异性，能够标记某一 类或某一种特定微生物的存在，是一类最常见的生物标记 物［８】。Ｓｈｅｒｌｏｃｋ ＭＩＳ微生物自动鉴定系统是美国Ｍ１ＤＩ公司 ２０世纪９０年代研发出来的，该系统拥有一套完整的标准化 程序，备有图谱识别软件以及迄今为止微生物鉴定系统中 最大的数据库资源，而且操作简单、分析周期短，因而该方 法在微生物领域得到了广泛的应用［９－埘。因此，本研究采用 ＰＬＦＡ￣析技术对浓香型白酒窖泥中分离筛选出的芽孢杆菌 进行鉴定，并运用气相色谱．质谱联用（ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈｙ，ＧＣ－ＭＳ）技术分析分离菌株发酵产物， 以期获得该微生物对白酒风味物质所起的作用。 １材料与方法 １．１材料与试剂 １．１．１材料 窖泥样品采自泸州老窖股份有限公司白酒生产窖 池，１００年窖龄窖池。于窖壁上层（距窖口５０ ｃｍ）、下层（距 窖底５０ ｃｍ）和窖底（窖池底部）分别取样，迅速置于冰盒运 回，４℃保藏。 １．１．２培养基与试剂 牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏５ ｇ、蛋白胨ｌ０ ｇ、氯 化钠５ ｇ、琼脂２０ ｇ、蒸馏水１ Ｌ，１２１℃灭菌１５ ｍｉｎ。 液体培养基：牛肉膏５ ｇ、蛋白胨１０ ｇ、氯化钠５ ｇ、蒸馏 水１ Ｌ，１２１ ｏＣ灭菌１５ｍｉｎ。 固体培养基：本地产优质高粱。高粱按６０目粉碎后加 水调配，以１２１ ｏｃ、８０ｍｉｎ蒸粮灭菌，冷却至３０℃。 ＮａＣ１、氢氧化钠、浓盐酸（均为分析纯）：成都科龙化 工试剂厂；甲醇（色谱纯）：德国Ｄａｒｍｓｔａｄｔ公司；正己烷（色 谱纯）：美国Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｉｆｃ公司；甲基叔丁基醚（色谱纯）： 瑞典Ｔｅｌｉａ公司。 皂化试剂：４５ ｇ氢氧化钠溶于１５０ ｍＬ甲醇及１５０ ｍＬ蒸 馏水； ’ 甲基化试剂：３２５ ｍＬ ６ ｍｏｌ／Ｌ的盐酸加入２７５ ｍＬ甲醇 中，混合均匀； 萃取试剂：￣Ｈ２００ ｍＬ甲基叔丁基醚￣Ｕ２００ ｍＬ正己烷 中，混合均匀； 碱洗涤试剂：ｌ０．８ ｇ氢氧化钠溶于９００ ｍＬ蒸馏水。 １．２仪器与设备 ＳＷ．ＣＪ．２Ｄ超净工作台：江苏苏净集团有限公司。 ＺＨＷＹ．１０３Ｄ恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有 限公司；ＬＲＨ．２５０生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司； Ｅ２００正置生物显微镜：尼康正置显微镜公司：ＭＬＳ．３０２０全 自动高压蒸汽灭菌锅：北京艾飞博科技有限公司：ＸＭＴＤ水 浴锅：余姚长丰仪器厂；Ｓｕｐｅｌｃｏ ５７２５０．Ｕ固相萃取仪：美国 ＴＡＬＢＯＹＳ公司；Ｓｈｅｒｌｏｃｋ ＭＩＳ微生物鉴定系统：美国ＭＩＤＩ 总第３０５期 ・７７・ 公司；ＧＣ６８９０气相色谱仪、ＧＣ７８９０—５９７５ＭＳＤ气相色谱．质 谱联用仪：美捷伦科技有限公司。 １．３方法 ｌ＿３．１微生物的分离与纯化 将窖池上、下、底不同位置的窖泥混合后，从中称取１０ｇ 窖泥样品进行１０倍梯度稀释，取稀释液１ ｍＬ涂布于牛肉膏 蛋白胨固体培养基，置于３７℃培养箱。待菌落长出后对不 同菌落进行分离纯化，同时将筛出的不同菌株用斜面保存， 并对其进行生化鉴定。 １－３．２分离菌株ＰＬＦＡ的提取［１３］ 将已分离纯化待鉴定菌种按照四区划线法分别接种 在牛肉膏蛋白胨培养基上，于３７℃恒温培养细菌２４ ｈ。挑 取培养基上已培养好的第三区菌落（约４０ ａｒｇ）于１０ ｍＬ有 聚四氟乙烯塞的玻璃瓶中，再通过皂化、甲基化、萃取、碱 洗涤对菌的磷脂脂肪酸进行提取。具体步骤如下： （１）皂化：称取４０ ｍｇ单菌培养物，置于８ ｍＬ螺口玻璃 管中，加入１ ｍＬ皂化试剂，拧紧螺盖，沸水浴５ ｍｉｎ，取出振 荡５～１０ Ｓ，拧紧螺盖，继续沸水浴２５ ｍｉｎ； （２）甲基化：待样品管冷却后，加入２ ｍＬ甲基化试剂， 盖严振荡，随后精确控制（８０±１）℃水浴１０ ｍｉｎ，冷水浴冷 却至室温； （３）萃取：在冷却的样品管中加入１．２５ ｍＬ萃取试剂， 快速振荡１０ ｍｉｎ左右，弃去下层水相； （４）碱洗涤：在剩余有机相中加入３ ｍＬ碱洗涤试剂， 快速振荡５ ｍｉｎ左右，振荡完若静置后不分层可向其中加几 滴饱和氯化钠溶液，取２／３上层有机相置于气相色谱样品瓶 中，保存于冰箱中待检。 ｌ＿３－３ ＰＬＦＡ鉴定 将待检样品置于气相色谱上进行测定，采用氢火焰离 子检测器，气相色谱的各参数由ＭＩＤＩ．Ｓｈｅｒｌｏｃｋ微生物鉴定 系统调用。 色谱条件：ＨＰ－ＵＬＴＲＡｚ色谱柱（３０．０ ｍｘＯ．２５ ｍｍｘ ０．２５ ｍ）；进样量：１ Ｌ，进样口温度２５０℃；不分流进样；程 序升温：初始温度１９０℃，以１０％／ｍｉｎ的速率升温至２８５ ｏＣ， 再以６０ ｍｉｎ的速率升温至３ １ ０℃。火焰离子化检测器（ｆｌａｍｅ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ，ＦＩＤ）温度２６０ ｏＣ，氢气３０ ｍＬ／ｍｉｎ，空气 ４００ ｍＬ／ｍｉｎ，尾吹气：氮气３０ ｍＬ／ｍｉｎ。 １．３．４发酵产物成分分析 先用牛肉膏液态培养基，于３７℃培养箱中富集培养， 当菌体长到对数期时再接入发酵醅中。液体培养温度条件 与固态一致，液态为２００ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡２ ｄ，固态发酵１０ ｄ （置于３７℃恒温培养箱中发酵）。发酵结束后，取适量固态 发酵醅样品进行顶空固相微萃取，ＧＣ—ＭＳ对发酵产物进 行分析，工作站平台标准库进行成分检索。 顶空固微相萃取操作过程：精确量取３ ｇＮ态发酵样品 ７８・ ２０１ ７ Ｖｏ１．３６ ＮＯ．７ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．３０５ Ｃｈｉｎａ Ｂ ｒｅｗｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏ￣ 顶空瓶中，将项空瓶放入全自动固相微萃取仪中，５５℃ 衡ｌ０ ｍｉｎ后，萃取３０ ｍｉｎ。 差＞０．１００的结果为最终结果。ＭＩＤＩ．Ｓｈｅｒｌｏｃｋ微生物鉴定 系统内有大量菌株的磷脂脂肪酸数据库，且每次用气相进 行检测时会用磷脂脂肪酸的标准物质进行比较分析， 此其结果是可信的。 表１ ＭＩＤＩ微生物鉴定系统鉴定结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＭＩＤＩ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ＧＣ．ＭＳ的风味分析条件：ＤＢ—ＷＡＸ毛细管色谱柱 ５０．０ ｍｘ０．２５ ｍｉｎｘ０．２５ ｍ）；进样口温度２５０℃；分流比 ）：１：程序升温：初始温度４０ ｃｃ，保持１ｍｉｎ，以５￣Ｃ／ｍｉｎ的速 ｉ升温至１３０ ｏＣ，保持１ ｍｉｎ，再以８￣Ｃ／ｍｉｎ的速率升温至 ；０℃，保持４ ｍｉｎ：质谱接口温度：２４０ ｏＣ；离子源温度： ）０ ｑＣ；四极杆温度为ｌ５０℃；溶剂延迟３ ｍｉｎ；离子化方式： 菌株相似性指数 名称 于电离（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｅ１）源；电子能量：７０ ｅＶ：扫描 式：全扫描。 结果与分析 １菌株的分离 本试验从浓香型白酒窖泥中成功分离得到３株细菌， ｒ别编号为Ａ１、Ａ２、Ａ３。对分离纯化后的３株菌进行革兰氏 色和镜检试验，结果见图ｌ。由图ｌ可知，株菌Ａ１、Ａ２呈白 ，Ａ３呈乳白色，且都具有细菌菌落的形态特征：湿润、较 由表ｌ可知，３株菌的相似性指数均＞０．５００，所以其 结果是可取的。菌株Ａ１被鉴定为球形赖氨酸芽孢杆菌 （Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｅｕｓ），菌株Ａ２被鉴定为短短芽孢杆菌 滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均匀。经革兰氏染色及 ｌ检可知，３株菌均为革兰氏阳性菌。 （Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ），菌株Ａ３被鉴定为尘埃类芽孢杆菌 （Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）。这３株菌虽然在相关文 献中有介绍，但在发酵方面研究较少，因此探究其代谢产 物对酿酒微生物的研究有着重要意义。 ２＿３代谢产物分析 表２分离菌株代谢产物分析结果 Ｔａｂｌｅ ２ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ●ｌ 图１ 分离菌株的菌落形态（Ａ）及菌体特征（Ｂ） Ｆｉｇ．１ Ｃｏｌｏｎｙ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ（Ａ）ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ（Ｂ）ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ２ ＰＬＦＡ测定结果 通过皂化、甲綦化、孳取、碱洗涤之后，提取３株细菌的 ｝脂脂肪酸，运用ＭＩＤＩ．Ｓｈｅｒｌｏｃｋ微生物鉴定系统进行了菌 鉴定，结果如表ｌ所示。根据ＭＩＤＩ微生物鉴定系统的标 ，第 选择相似性指数＞０．５００，且第…选择相似性指数 ｉ第二选择相似性指数相筹＞０．１００，则认为鉴定成功，其 确性更高，其结果为第一选择；若第一选择相似性指数 ０．３００４０．５００，且第一选择与第二选择之间的相似性指数 值＞Ｏ．１００，则认为第一选择与第二选择分开，鉴定可能 功，其准确性较低，该菌株为典型菌株；当相似性值＜ ３００时，则龄定不成功ｆ１］】。凶此，在对结果进行分析时，一 都选用第一相似性指数＞０．５００，且与第＿二相似性指数之 注：“ＮＤ”表示未检出。 浓香型白酒酿造是典型的固态发酵，为了探究分离菌 研究报告 中 国 酿造 ２０１７年第３６卷第７期 总第３０５期 ・７９・ 株在白酒酿造过程中的呈味作用，本研究对菌株Ａ１、Ａ２＊Ｄ Ａ３进行固态纯高粱发酵，并采用气相色谱．质谱联用法分 析其代谢产物，采用色谱工作站对这３株菌的ＧＣ—ＭＳ图谱 进行自动积分，采用归一化法定性分析代谢产物，其成分 分析结果见表２。 白酒中乙醇和水是其主干成分，比例达到９８％～９９％， 其他成分由种类多样的物质组成［１４］。中国白酒的微量成分 尘埃类芽孢杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｒｖａｅ ｐｕｌｖｉｆａｃｉｅｎｓ）、短短 芽孢杆菌（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）。分析其代谢产物，主要为 醇类、酮类等物质，它们作为白酒中的微量成分，对浓香型 白酒风味的形成起着放香、助香及调香的作用。因此，这 ３株菌对浓香型白酒风味物质的形成有一定影响。 参考文献： 【１］赵爽，杨春霞，窦灿，等．白酒生产中酿酒微生物研究进展［Ｊ］．中 国酿造，２０１２，３１（４）：５－１０． 主要为醇类、酯类、酸类、羟基化合物、缩醛、含氮化合物、 含硫化合物、呋喃类化合物、酯类化合物、醚类等，酒中的 微量成分是决定白酒香气、口感和风格的关键。按照微量 成分在白酒中所起作用又分为主体香成分、助香成分、定 香成分、矫香成分、放香成分、前香和后香成分、特征成分、 骨架成分等。按照微量成分在白酒中的绝对含量可以分为 骨架成分和复杂成分［１６Ｊ。 由表２可知，这３株菌的代谢产物中总共有ｌ５种白酒风 味成分，其中醇类７种，酮类物质５种，其余的为吡嗪类、酸 类、酚类物质。这３株菌的优势产物都为３．羟基．２．丁酮（乙 ［２］张霞，武志芳，张胜潮，等．贵州浓香型白酒窖池可培养细菌系统发 育分析［Ｊ］．酿酒科技，２０１０（１２）：２３．２７． ［３】叶光斌，罗惠波，杨晓东，等．基于免培养法研究泸州地区浓香型白酒 窖泥原核微生物群落［Ｊ］．食品科学，２０１３，３４（１７）：１７６—１８１． ［４］陈振祥，于鑫，夏明芳，等．磷脂脂肪酸分析方法在微生物生态学中 的应用【Ｊ１．生态学杂志，２００５，２４（７）：８２８—８３２． 【５】吴愉萍．基于磷脂脂肪酸分析技术的土壤微生物群落结构研究［Ｄ］．杭 州：浙江大学，２００９． ［６］ＬＥＣＨＥＶＡＬＩＥＲ Ｍ Ｐ．Ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｔａｘｏｎｏｍｙ－ａ ｔａｘｏｎｏｍｉｓｔ’ｓ ｖｉｅｗ 偶姻），其最高含量达６４．２６１％，另外还产少量高级醇、高级 酮等风味物质。其中球形赖氨酸芽孢杆菌还优势产２．３．丁 二醇，其含量为１７．０８０％，以及微量的乙醇；尘埃类芽孢杆 菌产物还有微量２一戊酸，含量为０．１６４％；类短短芽孢杆菌的 产物中还有微量的４．甲基吡嗪，含量为０．０５１％。在他们的代 谢产物中包含有白酒中的主要醇类物质异戊醇、异丁醇， ［Ｊ］．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９７，５（２）：１０９—２１０． ［７］ＨＡＡＣＫ Ｓ ＧＡＲＣＨＯＷ Ｈ，ＯＤＥＬＳＯＮ Ｄ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａｃｃｕｒａｃｙ，ｒｅｐｒｏ— ｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｒ－ｐｒｅｔｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｍｏｄｅｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ，１９９４，６０（７）：２４８３— ２４９３． ［８］杜宗敏，杨瑞馥．生物标记物在微生物鉴定和检测中的应用［Ｊ］．微生 物学免疫学进展，２００３，３１（３）：６７—７３． ［９］ＺＨＥＮＧ Ｊ，ＬＩＡＮＧ ＺＨＡＮＧ Ｌ Ｑ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｓｔｒｏｎｇ ａｒｏｍａｔｉｃ ｌｉｑｕｏｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｉｔ ｍｕｄｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ 他们是白酒醇甜和助香剂的主要物质来源，对白酒风味的 形成及促使酒体丰满、浓厚有重要作用。３ 羟基．２．丁酮（乙 偶姻）、２－３．丁二醇是４一甲基吡嗪的重要前体物质［１５】；而吡 ａｇｅｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ＤＧＧＥ ａｎｄ ＰＬＦＡ ｎａｌａｙｓｅｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ， ２０１３，５４（１）：６６０－６６６． ［１０】ＢＵＹＥＲ Ｊ Ｓ，ＳＡＳＳＥＲ Ｍ．Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ａｎａｌ— 嗪类化合物具有青椒的香气和焙烤香；３一羟基一２．丁酮、２—３． 丁二醇等羰基化合物对白酒的香气起着助香的作用【 。在 这３株菌的代谢产物中含有大量的３一羟基．２一丁酮、２．３．丁 ｙｓｉｓ ｏｆｓｏｉｌｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌ Ｓｏｉｌ Ｅｅｏｌ，２０１２，６１：１２７・１３０． ［１１】ＭＲＯＺＩＫＡ，ＮＯＷＡＫ ＰＩＯＴＲＯＷＳＫＡ—ＳＥＧＥＴＺ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎ ｗａｔｅｒｓ，ｓｅｄｉｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｍａｔｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ—ｂａｓｅｄ 二醇，因此可以看出这３株菌的代谢产物对白酒的香气起 着助香的作用。在白酒的微量成分中，酸类物质赋予白酒 ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．１ｎｔ Ｊ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｉ，２０１４，１ １（５）：１４８７—１４９６． ［１２］ＡＲＩＡ Ｓ，ＳＹＬＶＩＥ Ｈ，ＱＵＩＤＥＡＵ Ａ．Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａ＿ ｍｅｎｄｍｅｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｐｌｎｔ ａｎｄ ｓｏｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｉｔｅｓ 的丰满和酸刺激感，是影响后味的主要因素；酯类物质使 白酒具有水果香气；愈创木酚等酚类物质在白酒中含量不 多，但在白酒中起着助香的作用，使酒味绵长【 。在这三株 菌的代谢产物中，含有微量的２一戊酸、愈创木酚，故可以得 出这些菌株对白酒风味物质的形成有一定的影响。 ３结论 ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ ｉｎ ｈｅ Ｃａｔｎａｄｉｎ ａｂｏｒｅａｌ ｆｏｒｅｓｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｓｏｉｌ，２０１３， ３６３（１）：３３１－３４４． ［１３］吴愉萍，徐建明，汪海珍，等．Ｓｈｅｒｌｏｃｋ ＭＩＳ系统应用于土壤细菌鉴定 的研究［Ｊ］．土壤学报，２００６，４３（４）：６４２．６４７． ［１４］海超．清香型白酒酒龄鉴别的方法研究【Ｊ］．食品科学，２０１２，３３（１０）： 岩．中国白酒风味物质研究的现状与展望【Ｊ】．酿酒，２００７， １８４—１８９． 本研究通过传统的分离方法，从浓香型白酒窖泥中分 【１５］范文来，徐离得Ｎ３株菌，经磷脂脂肪酸鉴定后，菌株Ａ１、Ａ２和Ａ３分别 被鉴定为球形赖氨酸芽孢杆菌（Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｅｕｓ）、 ３４（４）：３ｌ一３７． ［１６】李维青．雏议白酒中微量成分的分类［Ｊ】＿酿酒，２００６，３３（５）：２９－３０．
