药敏实验流程

（一）普通肉汤培养基的制作：

1. NaCL5g, 牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，PH7.2~7.6, 2%琼脂粉20 g。

2. 先称取NaCL,牛肉膏，蛋白胨易于潮解最后称取，放于烧杯中溶解，玻璃棒搅拌。

3. 用PH试纸或PH校正仪调PH值，偏酸加1mol/L的NaOH,偏碱加1mol/L的HCL。

4. 用量筒再量一次加入2%的琼脂粉玻璃棒搅拌溶解。

5. 盖上硅胶塞，用8层纱布橡皮筋扎好，再用4层报纸包好，令用两层报纸包扎相应数量的平板，121°灭菌20分钟。

6. 把已灭菌了的平板放于烘箱内使其干燥或拆开报纸倒放于无菌工作台内使上面的水珠蒸发。

7. 做好无菌室的准备工作，待培养基的温度合适时开始倒平板，每个倒25~30ml，一般下午用时上午倒平板，第二天上午用时前一天下午倒平板，若用不完的培养基倒置于4°冰箱保存一周内用完。 （二）接种培养：

1. .用酒精棉球檫试要解剖的鱼的体表部位，解剖后用酒精棉球檫试要取的发病组织（肝脾肠）。

2. 点燃酒精灯，用灭菌了的镊子取发病组织剖面涂抹于培养基一角，用着烧过的接种环在培养基内做三四划线或“之”子划线，做上标记，倒置于37°恒温培养箱内培养18~24h。

（三）贴药敏纸片：

在无菌工作台内用接种环挑取优势菌落在培养基内做“米”字划线，用已灭菌了的有齿镊子贴药敏纸片于已经做“米”字划线的培养基，做上标记，10min后放于37°培养箱内培养18~24h. （四）观察结果：

记录抑菌圈的大小并排序，填实验结果报告单。

药敏纸片制备流程

一、实验所需仪器及试剂

打孔器、小瓶、容量瓶、培养皿、10ml移液管、眼科镊、小烧

杯等。

0.1M NaOH、0.85%生理盐水、200ml无菌水、恩诺沙星、盐酸

土霉素、氟苯尼考。

二、制备流程

1、 取新华1号定性滤纸，用普通的打孔器打成直径为6mm的

圆形小纸片，取出8只小瓶装入50片圆纸片（小瓶干燥洁 净）用单层牛皮纸包扎好。

2、 包扎好之后，121℃高压灭菌20min，同时把本次试验所需

的0.1M NaOH、0.85%生理盐水、容量瓶、培养皿、10ml移液管、小烧杯等把它们分别包好放在高压灭菌锅中一起灭菌。

3、 取出灭菌好的圆形纸片在无菌工作台上把纸片用眼科镊放

入已灭菌了的平皿内摊开至于烘箱，使之完全干燥。

4、 根据实验所需分别称取恩诺沙星取0.2g、盐酸土霉素0.3g、

氟苯尼考0.1g，精确到0.0002g。放入烧杯中用溶剂溶解，无菌水稀释，用玻璃棒引流到容量瓶中，定容成容积为100ml的容量瓶中。

5、 由配制的原始药水恩诺沙星取7.5ml、5ml，土霉素6.67ml，

氟苯尼考7.5ml、5ml，分别稀释为10ml的溶液即得到相应的（E 15μg/片、10μg/片 T 20μg/片 F 7.5μg/片、5μg/片）所需的浓度。

6 在无菌工作台中把已溶解的药物用已灭菌的移液管分别移

取0.5 ml加入相应含50片纸片的小瓶内，不时翻动使滤纸片将药液均匀吸净（一般浸泡30min即可）同时记录药物名称。

7、 再把浸泡过的纸片移到已灭菌的平皿内使其分散开置于

37°培养箱内18~24h。

8、 在无菌工作台内取出一定数量的药敏纸片放入4°冰箱内

保存一周内用完，剩下的装入小瓶内放入-20°的冰箱内保存4~5个月。