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食用微生物色素的研究进展

来源:抵帆知识网
食用微生物色素的研究进展 徐春明,王晓丹,焦志亮 (北京工商大学食品学院食品添加剂与配料北京高校工程研究中心,北京市食品风味化学重点实验室, 北京摘100048) 要:随着人们对食品添加剂的广泛热议,食用色素也备受关注。由于现代生活水平的提高,人们开始 追求更加健康的生活方式,故合成食用色素已经不能满足人们的要求。因此,天然来源的食用色素已经成为当 今食用色素发展的主流。食用天然色素是指由天然资源中获得的食用色素,主要是指从动物和植物组织及微生 物发酵液中提取的色素。但是植物来源的色素会存在来源不易保证 经济花费高和技术方面的问题,而微生物 产食用色素则刚好可以解决这些问题。微生物产色素具有生产周期短、产量高的特点,利用微生物产色素则成 为当今天然色素的发展趋势。本文将综述微生物色素的分类研究、有食用价值的聚酮类色素及其生产菌株的研 究进展,并对其可能产生的毒素进行探讨。 关键字:微生物;食用色素;毒素;生产研究 中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:1006—2513(2015)02—0162—07 Research progress of edible pigments by microorganisms XU Chun—ming,WANG Xiao-dan,JIAO Zhi—liang (Beijing Technology and Business University School of Food and Chemical Engineering Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and IngredientsBeijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing 100048) Abstract:As food additives are attracting people’S attentionmore,the edible pigments are becoming a hot topic.Due to the improvement of modem living standards,people begin to pursue more healthy living style. Synthetic edible pigments cannot meet people’S demands.Therefore,natural edible pigment has become the mainstream of pigment development.Natural edible pigment is mainly extracted from animals and plants’tissues and microbial fermentation.Plant pigments product quality is greatly influence by the source and is high cost and has technical diiculfties.Edible pigments from microorganism can overcome these problems. Because of short growth cycle and high yields,using microorganism is a trend to produce edible pigments. This article reviewed the classiicatifon of microorganism pigments,focused on edible polyketide pigments and its strain.The research of the potential toxin of the strain was also discussed. Key words:microorganism;edible pigments;toxin;production research 近年来,人们生活水平的提高增加了市场对 天然色素的需求。食用天然色素是指由天然资源 获得的食用色素,主要是指从动物和植物组织及 微生物发酵液中提取的色素。但是植物色素的来 收稿日期:2014—10—28 基金项目:学科与研究生教育一食品学科特色教学科研创新平台建设(PXM2012—014213—000063)。 作者简介:徐春明,男,副教授,研究方向:食品与生物化工。E—mail:xucm78@163.com。 童鲨鎏 源大都是来自热带植物,原料来源不易保证。植 物组织培养技术产色素的研究,从根本上解决了 原料的供给,生产出质量稳定的产品[1-3]。但是 链。色素的颜色随着共轭双键的数目而变动。共 轭双键的数目越多,颜色移向红色越远【6】。目 前,生产类胡萝卜素的主要有丝状真菌、酵母、 细菌和藻类,如冠霉素链霉菌、三孢布拉霉、布 目前此种方法经济花费较高,仍然不利于商业生 产。另一方面利用植物细胞培养生产色素还有一 些技术问题尚待解决。 利用微生物发酵生产色素可能会克服以上 困难。微生物色素有很多种类和颜色。这些色素 有的是在胞内的,有的是在胞外的;有自身合成 的,有转化培养基中的某些成分而形成的。微生 物色素是一种次生代谢产物,一般是在菌体生长 后期合成的。由微生物发酵产生的色素在自然中 非常常见。在众多的物质中,常见的有:类胡萝 卜素、黑色素、黄素类、醌类和一些更加特别的 色素,红曲色素、紫色杆菌素、藻青蛋白或靛蓝 等14]。用于产食用色素的微生物色素需具有以下 几方面特征:(1)产色素菌对人体是非致病菌; (2)生产条件安全且菌株不产毒素;(3)菌体可 以用于液体发酵。然而在发酵过程中许多微生物 产色素往往伴有毒素的产生,而且许多有食用价 值的微生物色素至今开发研究的甚少。因此本文 综述了食用微生物色素的生产菌株的培育、色素 的提取分离和毒素的研究,以期为推动天然食用 色素的发展做出贡献。 1几种常见微生物色素研究进展 1.1类胡萝卜索的生产研究 自从l9世纪初分离出胡萝卜素,至今已经 发现近450种天然的类胡萝卜素。常见的有:6c一 胡萝卜素、 一胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、番 茄红素和虾青素。类胡萝1-素均来源于类异戊二 烯和萜类化合物途径。细菌、酵母、霉菌等微生 物均可产生大量的类胡萝卜素,因而利用微生物 产天然色素是一项非常有前景和商业价值的研 究,对此类天然色素的研究也层出不穷。例如, 早在1996年,Wissgott等I5]利用三孢布拉霉生 产 胡萝卜素和番茄红素现在已经作为食品级 色素在使用。 类胡萝卜素是高度不饱和化合物,不溶于水 而溶于有机溶剂,含有一系列共轭双键和甲基支 拉克须霉、黄杆菌属、法夫酵母属、红酵母属。 Ayerim等l7 对固体培养黏红酵母YB一252生产 类胡萝卜素进行了研究,采用Plackett—Burman试 验设计方法,结果表明,调节剂浓度、发酵时间 和系统中发酵湿度是影响黏红酵母YB一252生产 类胡萝I、素产量的主要因素。Sun等[81对红发 夫酵母进行了低剂量射线辐照实验。研究表明红 发夫酵母是唯一能够产生虾青素的酵母,具有较 强的发酵糖的能力。经过重复的射线辐照和目视 法筛选获得一株菌株3A4—8。经过辐照后的每克 酵母可产生3.3mg类胡萝卜素,比未经辐照菌株 的产量增加了50%。经过辐照后只有此菌株能够 生存,因此射线辐照方法可用于产类胡萝卜素菌 株的筛选。在类胡萝b素的提取、浓缩、结晶和 微胶囊化工艺的建立中,有人对法夫酵母JMU— MVP14进行了研究。发现用乳酸或二甲基亚砜 破壁后再用溶剂提取的总类胡萝b素的提取率可 以达到78.53%。选择水、乙醚和乙醇复合体系更 加利于类胡萝b素浓缩物的结晶。微胶囊化时则 使用了明胶和淀粉作为壁材使得微胶囊效率达到 61.76%,为法夫酵母类胡萝卜素的开发利用奠定 了基础[91。 1.2黑色素的生产研究 黑色素是一种高分子量的生物色素,颜色 由深棕色到黑色,由酪胺酸经过一系列化学反应 形成,广泛存在于动物、植物和微生物中。它通 常是由酚类化合物的氧化聚合形成。微生物产生 的黑色素主要分为壁(膜)结合黑色素和胞外色 素,不溶于酸性溶液、不溶于常见的有机溶剂, 可溶于碱性溶液、微溶于水口。1。常被用于农业、 化妆品和药品中。 产黑色素的微生物也有很多,常见的有:细 菌(链球菌、蜡状芽孢杆菌、嗜麦芽假单胞菌)、 固氮菌、霉菌(黑曲霉、链格孢菌、构巢曲霉、 米曲霉等)、放线菌(链霉菌)以及真菌(出芽短 梗霉)[1l】。Sivaperuma等 对链霉球属MVCS 13产黑色素进行了研究。在优化实验中得出,产 黑色素最佳条件为温度50℃、pH7.4,培养基 为:甘油10g、L一酪氨酸O.75 L、L一天门冬酰 胺1.5g/L、磷酸氢二钾0.5 L、硫酸镁0.25g/L、 氯化钠0.75g/L、硫酸亚铁0.015g/L。Dong等 ] 首次报道从冬虫夏草中分离得到黑色素。其抗氧 化性质也非常强,主要表现为对自由基l,1一二 苯基一2一三硝基苯肼(DPPH)的清除和对亚铁 离子的螯合能力。这对于此类稀少真菌生产黑色 素具有很大的指导意义。魏力等【1 ]从近海沼泽 地大米草根际中分离了一株海洋细菌MWYL1。 进行初步鉴定后,通过基因组fosmid文库的构 建,直接分离到一个产黑色素的克隆,进一步亚 克隆和测序后获得与黑色素产生相关的功能新基 因。这对深入研究黑色素的生物合成途径具有一 定的理论意义,将有利于人们从基因角度了解黑 色素的合成过程,从而为黑色素的大规模安全生 产奠定基础。 1.3醌类色素的生产研究 蒽醌类色素是醌类色素中最大的群体,大约 有700种化合物,一直以来被广泛应用于食品和 药品当中。在药品方面可作抗癌、抗菌、利尿药 物使用。因此,蒽醌类色素在食品色素方面的应 用前景广阔。蒽醌类化合物广泛存在于微生物界 中,尤其是丝状真菌中,例如,曲霉属真菌、散 囊菌属、镰刀菌属、青霉属、裸胞壳属、弯孢叶 斑病菌、球腔菌属、小孢霉属等¨ 。已经作为食 品级色素使用的蒽醌类色素是由草酸青霉产生的 Arpink Red一由捷克的一家公司最早发现并命名, 该菌在最适发酵条件下可以获得1.5~2.0g/L的 红色色素[16 1 8]。 在羟基萘醌色素的研究中发现曲霉属真菌n (灰绿曲霉、冠突曲霉、匍匐曲霉)和散囊类菌 属 (阿姆斯特丹散囊菌、谢瓦散囊菌、蜡叶散 囊菌)均可发酵产生黄色素大黄素和红色素毛罂 红。然而,在这些色素中也都检测到不同的毒素 存在,甚至有些毒素也已经被着色,如黄天精、 红天精和金色灰绿曲霉素等。而之前的研究中也 发现有微生物不产毒素,如红丝膜菌能够产生红 色羟基葸醌类色素,与大黄素、大黄素甲醚共同 使果实和孢子呈现红色[21 1。在色素生产方面,有 人从竹黄真菌中分离得到了葸醌类色素。发酵液 通过有机溶剂萃取、乙酸镁沉淀、硅胶和反相 C18柱色谱层析等方法分离纯化,经HPLC检测 分析,此体系分离到的色素纯度高达97%。稳定 性实验显示,该类蒽醌色素对光、温度、一定浓 度蔗糖和柠檬酸具有良好的稳定性,而且具有清 除自由基的作用,对霉菌有明显的抑菌效果【22】。 1.4聚酮类色素的生产研究 聚酮类色素作为一种具有潜力的食用色素还 未得到充分的开发研究,因此,加大对聚酮类色 素的开发具有很好的未来前景。丝状真菌是食用 聚酮类色素的一个良好来源。真菌菌株的发酵产 物中产生较多的次级代谢产物,其中有多变的化 学结构和不同的生物活性。这些发酵产物中含有 丰富的天然色素,其中聚酮类色素是数量最多、 结构最多样的色素之一。 红曲霉色素作为食用天然色素被使用已经 有悠久的历史,尤其是在中国和日本。红曲霉 色素是一系列结构和化学性质相似的嗜氮酮混 合物,主要成分包括红曲黄素、红曲素、红斑 素、红曲红素、红斑胺和红曲红胺,分子结构见 图1。颜色包括黄色、橘黄色和红色。其发酵产 生许多代谢产物,功效成分也具有悠久的研究历 史。红曲霉色素具有抗诱变和抗癌、抗菌、抗炎 症、潜在的抗肥胖、抗糖尿病等功能[231。首次 从红曲霉中分离出降低胆固醇的活性成分是1979 年的日本Endo_24】教授,并将其命名为莫那可林 K(MonacolinK)。随后又有众多学者做了大量 动物实验,结果显示,此活性物质对人体安全无 副作用,并具有良好的降胆固醇、降血脂的双重 作用。 Feng【23 等人对红曲霉色素的生物合成途径 做了综述,认为红曲霉色素的合成途径仍然存在 争议。其次还对红曲霉色素的提取、分离、纯化 和鉴定做了详细研究。由于该色素是水溶性色 素,故可用乙醇等有机溶剂萃取。分离纯化可以 用柱层析、薄层色谱、高效液相层析、毛细管电 泳和高速逆流色谱。鉴定方法有核磁共振或核磁 共振联用UV—vis、IR、MS、GC—MS、LC—MS、 HRMS等。Mukherjee等人t251用己烷提取紫红 曲霉中的红曲色素,采用薄层色谱法、柱层析和 半制备高效液相色谱提纯,得到的纯化色素使 童 堡 中国食品添加剂 士 八 . 用uV—vis、IR、GC—MS、NMR方法分析。结果 显示纯化后的色素与传统的色素红斑胺和红曲红 胺很相似,但是纯化后的色素对革兰氏阳性菌有 毒性,因此红曲色素在西方一些国家仍未得到允 许。为了控制红曲产品中桔霉素的产生,国内外 学者已经从诱变、筛选、改造菌株,改良生产工 较强的抑菌性。这表明纯化后的色素在食品工业 艺、优化发酵条件及物理、化学法去除桔霉素方 中有更大的应用前景。但是红曲霉发酵能够产生 面进行了大量工作_26】。 的真菌毒素一桔霉素。桔霉素具有肝脏毒性和肾 O O 红曲红索 红斑素 O O 红曲红胺 红斑胺 0 0 红曲素 红曲黄素 0 0 图1微生物色素结构 Kang等 通过对氮源的提供了一种不 产桔霉素的红曲霉培养生产红曲红方法。通过研 究表明红曲霉发酵液中的次级代谢物受到环境的 定红曲霉色素的成分和发酵液最终pH发现,氮 源可以直接影响发酵液最终的pH,而最终的pH 可以决定红曲霉色素的成分和桔霉素的合成途 影响极大。实验中分别使用谷氨酸钠、玉米粉、 径。结果表明,在硫酸铵或谷氨酸钠作为氮源时 发酵液的最终pH最低,此pH下产生不含有桔霉 硫酸铵和钠作为培养红曲霉的氮源。通过测 ChinQ Fo0d Add“ es .:童 堡鉴,=:=::::=  素的橘黄色色素。 2生产食用色素真菌高通量筛选研究 使用化学分类原理可鉴别产生天然食用色 素的真菌,初步了解真菌细胞的前景和潜在安 全性。Mapari等人I28 在研究中对大量真菌可 能产生的天然食用色素的安全性做了鉴定。根 据生化分类学发现青霉属(Penicillium)和球菌 属(Epicoccum)可作为潜在生产食用色素的丝 状真菌菌株使用,但是并非所有的青霉属都适合 生产天然食用色素。实验对青霉属的亚属做了研 究,其中发现岛青霉(P.&landicum)、皱褶青霉 菌(Prugulosum)、变换青霉(P.variabile)、马尔 尼菲青霉(P.marneffei)不适合生产天然食用色 素,因为它们会产生毒素代谢物或对人类有致病 性的物质。而对郝克青霉菌(Pherquei)、产紫青 霉(Ppurpurogenum)、棘孢青霉(Paculeatum)、 绳状青霉菌(P..funiculosum)、嗜松青霉 (P.pinophilum)进行液体培养时,在其次级代谢 产物中均未检测到已知毒素,而且这些菌株还可 以分泌胞外色素,如红曲黄素、红曲色素、梦那 玉红、红曲红胺、PP—R、N一戊二酰一红曲红胺、 N一戊二酰一红斑胺。因此,这些菌株细胞具有可 以大批量生产天然食用色素的潜能。同时还可以 利用固液联合培养技术,研究类红曲霉嗜氮酮色 素及其氨基酸衍生物的生产[29]。在微生物色素研 究中,菌体的分离和鉴定研究也是必不可缺的一 部分。例如Qiu等人_30 对产紫青霉的分离和鉴 定进行了详细的研究。产紫青霉1AM 15392在 培养基(铵、可溶性淀粉、酵母膏和pH为 5的柠檬酸盐缓冲液)中可以生产红曲霉色素同 系物(10Z)一12一羧基一红曲红胺(简称PP—V) 和(10Z)一7一(2一羟乙基)一红曲红胺(简称 PP—R)[31]。Arai等人[321也对产紫青霉IAM 15392的色素产量做了研究。紫色色素PP—V的 典型特征是氮取代了分子中的吡喃氧,分子结构 见图1。在有利于PP—V产量的培养条件下,控 制合成谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶的基因也 得以表达,谷氨酰胺和谷氨酸都利于PP—V的合 成,而谷氨酰胺的有利程度更大。所以,谷氨 酰胺合成酶将培养基中的铵合成为谷氨酰胺对 PP—V的生产非常重要。另有报道[331显示,产紫 青霉的某些相关菌种,也能产生类红曲霉聚酮类 嗜氮酮色素,而其单个菌株是否含有对人体不利 的毒素和其产色素的能力还需要进一步的研究。 在生产色素的真菌安全性研究中,为了证明 可能的色素的生产者存在多样性和潜在性,增加 了对枝孢属、虫草属、弯孢属、内脐蠕孢属和拟 青霉属的研究。除了红曲霉之外,镰刀菌属、链 格孢属和附球菌属也都可以作为产色素的真菌使 用。研究发现,镰刀菌属不推荐为生产安全色素 的菌株使用;其次,还需要大量的毒理实验来研 究链格孢属、枝孢属、虫草属、弯孢属、内脐蠕 孢属和拟青霉属发酵物质中是否含有对人体不 利的毒素物质,以此来确定是否可以作为潜在 安全的生产色素的菌株使用;研究中发现黑附球 菌可以推荐为生产安全色素的潜在菌株使用 引。 Stricker等口 研究表明黑附球菌产生的水溶性黄 色素类似于姜黄色素具有抗氧化的活性。在黑附 球菌的耐光性实验中发现其发酵产生的黄色素耐 光性均强于姜黄色素和红曲霉色素的耐光性[351。 Mapari等【36】对黑附球菌的生长、形态学和色素 生产方面做了实验研究。因此,黑附球菌可作为 食用色素的大规模生产菌株[361,产生的色素在食 品工业生产中有更广阔的应用前景。 海洋生态真菌近年来被广泛的报道,是一 类新型的具有很大研究价值的微生物。海洋生 物生活在高盐、高压、低温、无光照的环境中, 这赋予了海洋生物独一无二的特性。在孢子和 菌丝体中细胞壁被着色的细胞比没有被着色的 细胞更能忍受脱水一水合循环和强辐射l3引。因 此,开发海洋真菌色素也具有非常重要的意 义。海洋真菌同样可以产生黄色至红色不等的 颜色,这些色素大部分属于聚酮类色素。有研 究表明,聚酮类化合物可能占据了海洋生态中 绝大部分的天然产品l38]。已经发现一株海洋青 霉属真菌~Penicilliumbilaii产生的黄色油类柠檬 菌素和2,3-dihydrocitro—mycetin属于聚酮类色 素_39]。韩国学者[401发现来自海洋的小孢子属 真菌可以产生黄色聚酮类灰绿曲霉色素,但也同 时含有真菌毒素桔霉素。在中国福建,发现了桐 花树内树皮中有青霉属JP一1,并产生一种红色 素--penicillenone[41】。由于海洋真菌的特殊性使 得海洋真菌色素很难得到大规模生产,但是海洋 真菌色素的巨大商业潜力仍吸引着人们去开发和 研究。 3微生物色素存在的问题和展望 天然食用色素的生产途径较少且大部分的原 材料来源依赖季节和气候,这了色素的多样 性。因此,在天然色素的商业化进程中主要考虑 三个方面:如何确保色素来源的稳定性、如何确 保色素的质和量、如何提高已知色素的功能。在 学术研究和工业生产中,人们开始将目光转移到 真菌来源的色素上。丝状真菌来源的类胡萝卜素 已经被批准应用到食品工业中,这更增加了真菌 来源的色素可以广泛应用的可能性。但是关于微 生物来源的色素研究大部分还停留在实验室阶 段,还是一个相对未被开发的领域。若可以使用 化学分类原理选出具有色素生产潜能的菌株,并 确保色素的生产效率和产量,就可以避免使用基 因操纵的手段来生产色素,使色素的生产过程更 加安全。 作为一种新开发的微生物色素,不仅纯度 要求较高,其毒理实验要求也较高,产品不易得 到认可。因此,在目前的研究中需要更好的理解 微生物如何、为什么以及在何种情况下会产生色 素,同时还需要做大量的毒理实验来证明色素的 安全性。 4结论 研究发现,大自然中存在大量能够生产天 然色素的菌株,但已经得到开发的菌株数量相对 较少。因此,构建真菌细胞工厂以实现微生物色 素的工业化大规模生产是今后研究食用色素的重 点。就现在食品工业的发展方向而言,微生物色 素虽然存在一定的问题,如某些真菌毒素难以分 离、微生物发酵液物质种类复杂难以提纯及不易 选择合适的生产菌株等,但是随着现代生物技术 的发展,微生物色素仍然可能成为今后天然食用 色素的发展重点。 童 终 士 八 . 中国食品添加剂 参考文献: [1】钟青萍,杨宁生,陈米慧.栀子愈伤组织生长和黄色素合 成影响因素的研究[J].南昌大学学报:理科版,1994,3 (18):256—262. 【2]潘清平,王清波,李琳,等.栀子愈伤组织诱导的初步研究 [J].中国中药杂志,2009,34(11):145卜1453. 【3】Yoshihiko Nawa,Toshio Ohtani.Induction of Callus from flesh of Gardeniajasminoides ELLIS fruit and formation of yellow pigment in the callus[J].Biosci.Biotech.Biochem., 1992,56(11):1732 1736. 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