植物组织培养 第八章 单倍体的产生

第八章 单倍体的产生

教学目标与要求：1.了解：通过花药培养产生单倍体的潜在可能性2.掌握：花药培养的一般程序和离体花粉培养3.理解：影响雄核发育的因子；雄核发育单倍体的个体发生过程；通过远缘杂交产生单倍体在高等植物中单倍体的意义.

单倍体概念及意义

 所谓单倍体，指的是具有配子体染色体组成的孢子体。

 单倍体在遗传研究和植物育种中的意义在于：

 1.在单倍体细胞中只有1个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。

 2.在品种间杂交育种程序中，通过F1代花药培养得到单倍体植株后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代，和常规育种方法相比，显著缩短了育种年限。

一、花药培养的一般程序

1.取材 花药在接种之前，应预先用醋酸洋红压片法进行镜检，以确定花粉的发

育时期，并找出花粉发育时期与花蕾或幼穗的大小、颜色等外部特征之间的对应关系。一般而言，单核后期花药对培养反应较好，在烟草中，此时花蕾大约与萼片等长，水稻颖片通常达到最后大小，颜色淡绿，颖内的花药色亦淡绿。

2 .预处理 适当的预处理可以显著提高花药的愈伤组织诱导率。常用的预处理方法是低温冷藏，具体的处理温度和时间长度因物种而异：烟草 7～9℃，7～14 d；水稻7～10℃，10～15 d；黑麦l～ 3℃，7～ 14d；大麦 3～ 7℃，7～ 14 d

3.消毒 花药适宜培养时，花蕾尚未开放，花药在花被或颖片的严密包被之中，本身处于无菌状态，因此，通常只要以70％酒精喷洒或擦拭花器或包被着麦穗的叶鞘表面，即可达到灭菌要求

4.接种 在无菌条件下把雄蕊上的花药轻轻地从花丝上摘下，水平地放在培养基上进行培养，在整个操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花药壁形成二倍体愈伤组织。

如果所碰到的是花器很小的植物，如天门冬属、芸苔属和三叶草属植物等，可能需要借助解剖镜夹取花药，或是只把花被去掉，把花蕾的其余部分连同其中原封未动的雄蕊一起接种在培养基上。

在有些情况下，甚至是接种整个花序以得到花粉单倍体。然而这种简单化的方法只适用于这样一些基因型，即其中雄核发育在只含无机盐、维生素和糖的简单培养基上即可进行，而在这种培养基上孢子体组织增殖的机会很少。

不过，当必须使用生长素才能诱导花粉粒雄核发育的时候，应当尽可能把孢子体组织去掉。

由于花药对离体培养的反应存在“密度效应”，因此每个容器中接种的花药数量不宜太少，以形成一个合理的群体密度。

5 .培养方式和培养条件

 花药的培养方式主要有3种：一是在琼脂固化培养基表面培养;二是在加入3 0％Ficoll的液体培养基表面飘浮培养;三是利用固体一液体双层培养基培养，以便既能保持较高的接种密度，培养基又不易失水干涸。

 培养温度

 花药对培养温度的要求因物种而不同，对于大多数小麦品种来说，在培养的最初6d给以30～32℃的较高温度，然后再转入28～30℃下培养，花药出愈率会有明显提高。水稻花药培养的适宜温度从一开始就是27℃。愈伤组织分化阶段对温度的要求不像诱导阶段那样严格，例如小麦在 17℃和30℃下花粉愈伤组织分化频率没有显著差异，水稻花粉植株的分化也多在和诱导期间相同的温度下进行。

6 花粉植株的诱导

烟草花药接种在无激素培养基上1周以后，即有部分花粉粒开始膨大，2周以后细胞开始不断，相继形成球形胚—心形胚和鱼雷形胚等，3周后在花药开裂处即可见到许多淡

黄色的胚状体，见光后变绿，并逐渐长成小苗。每个花药中长出的小苗数可从1株到几十株不等，最多者可达180株以上.

禾本科植物的花药培养

通常不能形成胚状体，在这类植物中，花粉植株的诱导往往要分两步进行。首先，第一步，将花药接种在含有 2，4－D（1～2 mg／L）的诱导培养基上，诱导花粉粒形成单倍体愈伤组织。

第二步，当花粉愈伤组织形成10～15 d，其直径已长到 1．5～2．0mm时，及时把它们转到分化培养基上诱导植株分化。

分化培养基中不含 2，4－D，含有 NAA和 KT各0.5mg／L。在分化培养基上，愈伤组织表面陆续分化出芽和根

在烟草中，花粉植株是经由胚状体产生的，因此几乎都是单倍体。在稻麦等植物中，由于花粉植株是经由愈伤组织产生的，染色体数常有变化，其中既有单倍体，也有二倍体、三倍体以及各种非整倍体等。

7. 壮苗和移栽

以小麦为例，王培等采用的方法是：将已长出2～3片叶的花粉植株转人含有多效唑 3 mg／L，NAA和 KT各 0．5 mg／L的LH50mg/L和蔗糖 8％的 MS培养基上，于22～25℃下进行壮苗培养，然后在3～8℃低温弱光条件下越夏，深秋时炼苗移栽。

8.单倍体植株的二倍化

单倍体植株能正常地生长到开花期，但由于缺少同源染色体，减数不能正常进行，因而不能形成有活力的配子。为了得到可育的纯合二倍体，必须把单倍体植株的染色体组加倍。虽然在花粉植株中染色体可自发加倍，但其频率太低。

人工措施则可显著提高加倍频率

诱导染色体加倍的传统方法是用秋水仙素处理。在烟草中一般使用0.4％的秋水仙素溶液。具体方法是：把幼小的花粉植株浸于过滤灭菌的秋水仙素溶液中 96 h，然后转移到培养基上使其进一步生长。秋水仙素处理也可通过羊毛脂进行，即把含有秋水仙素的羊毛脂涂于上部叶片的腋芽上，然后把茎的顶芽去掉，以刺激侧芽长成二倍体的可育枝条。

加倍颠茄的单倍体细胞

Rashid和Street （ 19 7 4）在悬浮培养基中加入1g ／L秋水仙素，处理2 4h之后，再把细胞转移到不含这种药物的培养基中，结果可使70％的细胞二倍化。

禾本科植物的染色体加倍

禾本科植物的染色体加倍，一般都是采用在分蘖盛期用秋水仙素溶液浸泡分蘖节的办法，例如小麦用 0．04％秋水仙素处理 8 h，水稻，用 0．2％的秋水仙素处理 24 h。为了增强处理效果，溶液内皆须加入l％～2％的助渗剂二甲基（DMSO） 。

除了在分蘖盛期加倍之外，也可采用愈伤组织和试管苗染色体加倍方法，效果很好

9.离体花粉培养

花药培养——器官培养，遗传上的异质性，药壁细胞有可能脱分化并增殖，所以不是纯粹的单倍体植株。

花粉培养——可以进行单细胞培养，得到纯粹的克隆。最早的成功花粉培养是1970年的甘蓝的花粉悬滴培养法。

10.在高等植物中单倍体的意义

由于多数突变是隐性，当同源染色体上有显性等位基因存在时，它们不能表现，因此在高等植物中突变常常不易发现。为了使隐性性状表现出来，需要对携有突变的植株反复自交。然而，某些物种，如茶和黑麦等，是自交不亲合的，不可能自交。此外，即使在有可能自交的情况下，4个个体中也只能有1个表现这个隐性性状。如果发生不止一个隐性突变，要想得到一个能表现所有突变性状的个体，机会还要少得多。

与此相反，在单倍体中诱发突变很容易表现出来，这是因为单倍体只有一套基因，隐性突变的作用不会受到显性等位基因的干扰。携有有利突变的单倍体一经发现，就可以在一个世代之内，通过染色体加倍，而成为表现所有有利突变的可育二倍体。在具有高度杂合性的异花授粉作物中，用传统的方法固定特定性状需要7－8年的时间，若采用F1代植株花药（粉）培养，只要一个世代就可以达到这个目的。