cAMP对转化细胞中几种基因表达及CREBDNA结合活性的影响

中国生物化学与分子生物学报

ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology2001年2月17(1):91～97

cAMP对转化细胞中几种基因表达及CREB

DNA结合活性的影响

周　涛,　王端顺

*

(北京师范大学生命科学学院,北京　100875)

摘要　从癌基因、抑癌基因及转录因子CREB(cAMP反应序列结合蛋白)对CREDNA序列结合活性的相关性,对db-cAMP处理的小鼠C3H10T1/2转化细胞增殖抑制作用进行了研究.实验结果表明,转化细胞中PKA(蛋白激酶A)活性显著低于正常细胞,而PKC(蛋白激酶C)活性则显著高于正常细胞.斑点印迹和Northern印迹分析显示转化细胞中c-myc和CaM(钙调素)基因表达明显高于正常细胞,而p53基因和Rb基因表达则明显低于正常细胞,这些差别与C3H10T1/2转化细胞增殖失控有关.转化细胞经db-cAMP(1mmol/L)处理后,细胞增殖受到明显抑制,db-cAMP处理0.5h后,转化细胞中PKA活性便明显增强,PKC活性则被显著抑制,处理2h后,c-myc和CaM基因表达下降,而p53和Rb基因表达则增强,这些变化与cAMP抑制C3H10T1/2转化细胞增殖有密切联系.凝胶阻滞电泳分析显示db-cAMP(1mmol/L)处理短时间内,CREB对CREDNA序列无结合活性,12h后开始出现较弱的结合活性,24h后才明显加强,表明在db-cAMP处理的早期,区中含有CRE序列的基因不参与db-cAMP对细胞增殖抑制的调节,即与CREB磷酸化及其相应的DNA结合活性无相关性.

关键词　环核苷酸,细胞增殖,cAMP反应序列结合蛋白,活性中图分类号　Q786

TheEffectofcAMPonExpressionofSeveralGenesandCREBDNABindingActivityinTransformedC3H10T1/2Cells

ZHOUTao,WANGDuan-shun

*

(CollegeofLifeSciences,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China)

Abstract　InordentoinvestigatethemechanismofcAMPininhibitionoftransformedcellproliferation.TheactivitiesofPKC(proteinkinaseC)andPKA(proteinkinaseA)intransformedC3H10T1/2cellstreatedbydb-cAMP(1mmol/L)wereanalysed.Furthermore,thecorrelationbetweenthegeneexpressionofc-myc、CaM(calmodulin)、p53、RbandtheDNAbindingactivityofCREB(cAMP-responseelementbindingprotein)intransformedcellstreatedbydb-cAMPwasexamined.Theresultsdemonstratedthatthetransformedcellsdisplayedthemostrapidgrowthrate,whilethegrowthrateoftransformedcellstreatedbydb-cAMP(1mmol/L)significantlydecreased.TheactivityofPKCwasmarkedlyreducedandtheactivityofPKAwassignificantlyenhancedintransformedcellsaftertreatmentwithdb-cAMPfor30min.ThegelmobilityshiftassaywascarriedoutbyusingdoublestrandedoligonucleotidecontainingtheconsensussequencefortheCREDNAbindingsite.TheenhancementofDNAbindingactivityofCREBin

收稿日期:2000-03-09,接受日期:2000-05-15国家自然科学基金资助项目(No.39370355)

*

联系人　Tel:(010)62209699,Fax:(010)62200567

周涛:女,1971年9月生,硕士,助理研究员Received:March9,2000;Accepted:May15,2000

SupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina,No.39370355

*

Correspondingauthor　Tel:(010)62209699,Fax:(010)6220056792中国生物化学与分子生物学报17卷

transformedC3H10T1/2cellsaftertreatmentwithdb-cAMP(1mmol/L)for24hwasobserved.However,theexpressionofc-mycandCaMwasinhibitedandtheexpressionofp53andRbwasenhancedintransformedC3H10T1/2cellstreatedbydb-cAMP(1mmol/L)for2h.Theresults

suggesttheinhibitionofproliferationintransformedC3H10T1/2cellsaftertreatmentwithdb-cAMPisrelatedtotheinhibitionofgeneexpressionofCaMandc-mycandenhancementofexpressionoftumorsuppressorgenesp53andRb,butthishasnorelationtotheDNAbindingactivityofCREB.

Keywords　cyclicAMP,cellproliferation,cAMP-responseelementbindingprotein,activity　　外源性cAMP或可提高肿瘤(转化)细胞中cAMP水平的药物对肿瘤(转化)细胞的增殖抑制作用已被广泛报道,其机理可能与cAMP-PKA(proteinkinaseA,蛋白激酶A)信号通路的激活有关.但自Riabowol等报道有关PKA催化亚基促转录因子CREB(cAMP-responseelementbindingprotein,cAMP反应序列结合蛋白)磷酸化诱发与细胞增殖有关的早期应答基因c-fos的表达以来[1],有关cAMP对细胞增殖的作用及其机理更引起了学术界的关注.作者曾观察到在C3H10T1/2转化细胞中c-fos转录水平显著高于正常细胞,这与转化细胞的增殖失控有关,但在cAMP处理2h后,c-fos的表达即被明显抑制,相应其细胞增殖也受到明显抑制.此结果与Riabowol等的报道不相一致,表明cAMP对细胞增殖抑制作用的机理尚未搞清楚,特别是外源性cAMP处理转化(肿瘤)细胞,促使CREB磷酸化与cAMP抑制转化(肿瘤)细胞增殖的关系仍有待阐明.本文就db-cAMP处理C3H10T1/2转化细胞中CREB磷酸化进程及细胞增殖相关基因与抑癌基因表达变化对CREBDNA结合活性与细胞增殖抑制间的关系进行了初步研究.

[2]

3

C3H10T1/2转化细胞(由H-B射线诱发C3H10T1/2细胞建成的转化株)由卫生部工业卫生研究所馈赠.

1.2　方法

1.2.1　细胞培养　细胞用含10%小牛血清的DMEM培养液在37℃,5%CO2培养箱中培养.

1.2.2　细胞生长测定　取对数生长期细胞,按2×104细胞/ml培养液,每孔2.5ml细胞悬液,接种于6孔板中,分对照与试验组,接种24h后,试验组加药处理,每隔24h进行细胞计数.

1.2.3　细胞周期时相群体的测定　收集各组细胞,按文献[3]方法制备样本,用FACSⅢ型荧光激活细胞分类器进行流式细胞光度术(FCM)分析,激发波长为388nm,阻断波长530nm.1.2.4　PKA、PKC活性测定　按文献[4]方法,分别制备PKA和PKC(proteinkinaseC,蛋白激酶C)提取液进行酶活性测定.

1.2.5　细胞总RNA提取及分子杂交技术　采用酸性胍-苯酚-氯仿一步法[5]提取总RNA.按随机引物标记试剂盒说明对DNA探针进行标记.斑点印迹按Thomas方法进行,Northern印迹按文献[7]方法进行.

1.2.6　CREBDNA结合活性的检测　(a)细胞核提取物的制备:收集试验组与对照组细胞,PBS洗两次,细胞沉淀中加入2倍体积的缓冲液A(10mmol/LHepespH7.9,10mmol/LKCl,0.1mmol/LEDTA,0.1mmol/LEGTA,1.0mmol/LDTT,0.5mmol/LPMSF)冰浴15min,加NP40至终浓度为0.6%,涡旋10s.镜检,质膜破而核膜不破.22000g,4℃离心1min,去上清,沉淀中加入2倍体积的缓冲液C(20mmol/LHepespH7.9,25%(V/V)甘油,1mmol/LEDTA,1mmol/LEGTA,0.4mol/LNaCl,0.5mmol/LPMSF,1.0mmol/LDTT),置冰浴20min,加NP40至终浓度为0.6%,4℃振荡20min.镜检,保证核膜破碎,22000g,4℃离心2min,去上清,分装冻存于-70℃备用.蛋白浓度按Lowry法测定.(b)凝胶阻滞分析:本工作中[6]

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　主要试剂和药品　db-cAMP、cAMP、茶碱(theophyline)、DEPC、CaM(calmodulin,钙调素)均

购自Sigma公司,小牛血清购自中国医学科学院血液学研究所,随机引物标记试剂盒购自Promega公司,[A-P]dCTP、[C-P]ATP购自北京亚辉生物工程公司,琼脂糖购自BRL公司,CREB蛋白检测系统购自Gibco公司.其它常规试剂购自北京化学试剂公司,试剂均为分析纯以上纯度.

1.1.2　探针　c-myc(8.5kb)、CaM(0.8kb)由本室提供,B-肌动蛋白(2.0kb)、p53(1.8kb)、Rb(0.9kb)均购自北京市肿瘤防治研究所.

1.1.3　细胞　正常小鼠C3H10T1/2成纤维细胞及32

32

第1期周　涛等:cAMP对转化细胞中几种基因表达及CREBDNA结合活性的影响93　

使用的双链寡聚核苷酸所含首尾重复的CREDNA

结合位点的共有序列为5′-TGACGTCA-3′,实验中使用的寡聚核苷酸序列如下:

5′-GATCTGACGTCATGACTGACGTACTGACTGACGTCATCA-3′

3′-ACTGCAGTACTGACTGCATGACTGACTGCAGTAGTCTAG-5′用[A-32P]dCTP标记后相继过两个SephadexG-50柱,以纯化标记的寡聚核苷酸.

实验分3组进行,即试验组中加10Lg细胞核提取物和6Ll5×培育缓冲液(50mmol/LTris-HCl,pH7.5,500mmol/LNaCl,5mmol/LDTT,5mmol/LEDTA,20%(V/V)甘油和0.4mg/ml超声处理的鲑鱼精子DNA);阴性对照组中加5Ll水;阳性对照组中加入10LgHeLa细胞核提取物(Gibco)和5Ll5×培育缓冲液.4℃培育15min,各组加入cpm值为6×104的32P-寡聚核苷酸,加水至总体积为25Ll.室温培育20min,每组加入2Ll0.1%(W/V)溴酚蓝,然后加入6%非变性的聚丙烯酰胺凝胶,150V进行电脉,胶抽干后于-70℃曝光过夜,常规显影,定影.

　　FCM结果显示转化细胞G1期细胞群体百分比较正常细胞小,而S期则较正常细胞大得多,db-cAMP处理4d后,DNA合成受到抑制,G1期群体增大,S期细胞群体变小,各时相细胞百分比趋向于向正常细胞变化(Table1).

Table1　Effectofdb-cAMPoncellcycleprogression*

GroupABC

NormalcellTransformedcell

Treatment

Compart.ofcellcycle(%)

G17037

S1453

G2+M1610

Transformedcell+theophyline(1

592813

mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)*DMSO(0.1%)ortheophyline(1mmol/L)hasnoeffectoncellcycleprogression

2.2　db-cAMP对PKA和PKC活性的影响

C3H10T1/2转化细胞PKC活性显著高于正常细胞达7倍,这与文献报道的肿瘤细胞PKC活性高于正常细胞是一致的,经db-cAMP处理30min后,PKC活性受到强烈抑制,其活性比原水平降低了91.3%(Fig.2).

2　结果

2.1　db-cAMP对细胞生长的抑制

正常细胞倍增时间为23h,接种(5×10细胞/ml)一周后,细胞数增加6.2倍.转化细胞增殖旺盛,倍增时间仅为9.6h,接种一周后,细胞增加13.5倍.转化细胞经1mmol/Ldb-cAMP处理5d后,细胞数仅为未处理细胞的39.7%,抑制率达60%,倍增时间延至27.5h(Fig.1).

Fig.2　Theeffectofdb-cAMPonPKCactivityA:Normalcells;B:Transformedcells;

C:Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)0.5h

*DMSO(0.1%)ortheophyline(1mmol/L)hasnoeffectonPKCactivity

5

转化细胞PKA活性明显低于正常细胞,仅为正常细胞的28.3%,db-cAMP处理转化细胞30min后,PKA活性显著升高,上升至原水平的14.6倍(Fig.3).

2.3　db-cAMP对CaM和c-myc基因表达的影响

Fig.1　Effectofdb-cAMPoncellgrowth

—◆—SeriesA:normalcells;

—■—SeriesB:transfomedcells;

—▲—SeriesC:transfomedcells+DMSO(0.1%);

—×—SeriesD:transfomedcells+theophyline(1mmol/L);—*—seriesE:transfomedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)Northern印迹结果显示转化细胞中CaM基因转录水平高于正常细胞,这与作者前文报道的斑点印迹检测结果是一致的[2],经db-cAMP处理2h后,其转录活性即被明显抑制(Fig.4).c-myc的基因表达变化亦有类似结果,即转化细胞中c-myc基94中国生物化学与分子生物学报17卷

Fig.3　Theeffectofdb-cAMPonPKAactivity*A,B,CareasinFig.2

*DMSO(0.1%)ortheophyline(1mmol/L)hasnoeffectonPKAactivity

Fig.6　Theeffectofdb-cAMPonexpressionofp53gene(a)Dotblot;(b)AnalysisofdensityscanningA:Normalcells;B:Transformedcells;

C:Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for0.5hours;

D:Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for2hours

Fig.4　Theeffectofdb-cAMPontheexpressionofCaMgene

(a)Northernblot;(b)AnalysisofdensityscanningA:Normalcells;B:Transformedcells;

C:Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for2hours

因转录活性高于正常细胞,经db-cAMP处理2h后

即被明显抑制(Fig.5).作为内参对照的B-肌动蛋白表达无变化(Fig.8).

Fig.7　Theeffectofdb-cAMPonexpressionofRbgene(a)Northernblot;(b)AnalysisofdensityscanningA,B,C,DaresameasinFig.6;

E.Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP

Fig.5　Theeffectofdb-cAMPontheexpressionofc-mycgene

(a)Northernblot;(b)AnalysisofdensityscanningA,B,CaresameasinFig.4

(1mmol/L)for4days

2.5　db-cAMP对CREBDNA结合活性的影响

Fig.9所示A行为空白对照(无细胞核提取物),B行为阳性对照(加HeLa细胞核提取物),CREB对CREDNA序列结合后的迁移速率应与阳性对照一致,即处于同一水平位置上.如图所示db-cAMP对转化细胞处理2h后,CREB对CRE序列无结合活性,加药12h后,出现一较弱的结合带,24h后,对CRE的结合活性才明显上升.CREB对DNA的结合活性是随CREB磷酸化水平的上升而2.4　db-cAMP对p53和Rb基因表达的影响Fig.6及Fig.7表明细胞转化后抑癌基因p53及Rb的表达均减弱,经db-cAMP处理0.5h后,其表达开始增强,随处理时间的延长,p53及Rb基因表达进一步增强,B-肌动蛋白作为内参对照,其表达无变化(Fig.8).

第1期周　涛等:cAMP对转化细胞中几种基因表达及CREBDNA结合活性的影响95　

Fig.8　Theeffectofdb-cAMPonexpressionofB-actingene(a)Upperpanel,Dotblot;Lowerpanel,analysisofdensityscanning(b)Upperpanel,Northernblot;Lowerpanel,analysisofdensityscanningA,B,C,D,EaresameasinFig.7

Fig.9　Theeffectofdb-cAMPonCREDNAbindingactivityofCREB(Gelmobilityshiftassays)A:Negativecontrol;B:Postitivecontrol;C:Transformedcells;

D:Transformedcells+Theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for2hours;E:Transformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for12hours;F:Fransformedcells+theophyline(1mmol/L)+db-cAMP(1mmol/L)for24hours

加强的,虽然db-cAMP处理0.5h后,PKA活性即显著上升,但在加药后2h,CREB尚未被磷酸化,因此对DNA无结合活性,12h后,其磷酸化仍处于低

水平.

有关的早期应答基因c-fos的表达报道以来[1],对CREB磷酸化在cAMP调节细胞增殖中的作用引起了学术界的关注.我们曾观察到C3H10T1/2细胞转化后c-fos基因表达异常强烈,而在cAMP处理2h后,即被显著抑制[2].这种不相一致的结果,可能应归因于Riabowol等的实验所用的是正常细胞,而我们所观察的是转化细胞有关.自70年代以来,各实验室陆续报道了部分组织类型的正常细胞,cAMP3　讨论

自Riabowol等将PKA催化亚基注入大鼠成纤维细胞,引起CREB磷酸化,并刺激与细胞增殖96中国生物化学与分子生物学报17卷

非但不能抑制其细胞增殖,反而具有刺激作用,即属于Nishizuka所归纳的单向系统(cAMP-PKA和DG-PKC间的关系)的细胞类型,而不管哪种类型的细胞,一旦转化(癌变)后,一般cAMP只具有对细胞增殖的抑制作用[9].但为了进一步弄清CREB磷酸化的作用,我们观察了CREB磷酸化进程及其DNA结合活性与部分抑癌基因及增殖相关基因表达变化之间的相关性.

实验结果表明,尽管转化细胞经db-cAMP处理0.5h后,PKA活性即显著上升,但在db-cAMP处理12h后,CREB磷酸化及其DNA结合活性仍然比较微弱.而PKA一旦被cAMP激活后,其催化亚基便从高尔基体快速移位入核,以便磷酸化CREB.但在CREB上同时存在PKA和PKC不同位置的磷酸化位点,一般CREB接受PKA磷酸化前,先进行同源二聚化,而PKC对其磷酸化是形成二聚化的必备条件,因而,PKC对CREB的磷酸化及其DNA结合活性也具有重要的作用[11].本实验中可看到,细胞经db-cAMP处理0.5h后,PKC活性受到强烈抑制,从而可能抑制了PKC对CREB的磷酸化及CREB的二聚化,最终影响PKA对CREB的磷酸化和DNA结合活性,表明CREB磷酸化的延迟可能与PKC活性的抑制有关.

实验显示db-cAMP处理0.5h后,抑癌基因Rb表达即恢复上升.因此,Rb蛋白可结合更多E2F转录因子,使受E2F调节的c-myc及一些DNA合成酶基因表达受到抑制影响.另外,c-Myc蛋白与Max蛋白形成异二聚体,可与cdc25(一种磷酸酶)基因上游区结合,激活cdc25表达.由于c-myc在db-cAMP处理的早期(2h),其表达即受到抑制,从而影响cdc25表达,最终影响cdc25对CdK2(cyclin-dependentkinase,周期蛋白依赖激酶)及CdK4磷酸化的Tyr去磷酸化及其相应发生的构象改变,削弱与底物(如Rb蛋白)的接触,抑制Rb蛋白的磷酸化.其结果是由于c-myc表达下降,

通过cdc25表达抑制,影响细胞周期引擎分子cyclinD1/CdK4和cyclinE/CdK2活性,下降Rb蛋白磷酸化,抑制细胞向S期过渡

[15]

[14]

[12,13]

[10]

[8]

子),可与多种cyclin/CdK复合物结合,抑制其活性,对cyclinD1/CdK4及cyclinE/CdK2的结合,可抑制细胞进入S期,阻断于G1期[18],因此,本实验中所见db-cAMP诱导的p53高表达也可通过p21达到抑制细胞增殖的作用.

CaM是一种与细胞增殖密切相关的蛋白,我们曾证明CaM在G1/S、G2/M、M中期/M后期3个位点上对细胞周期进行,促进细胞增殖.细胞转化后其表达增强,但在db-cAMP处理的早期(0.5～2h),CaM的表达即被强烈抑制,直到处理的后期(第4d),其表达仍维持在低水平上[2],CaM表达的下降是db-cAMP抑制转化细胞增殖的一个重要方面.

在考虑与细胞增殖相关的c-fos、c-myc等早期应答基因表达的变化时,当然不能排除RKC→Raf1

→MEK→MAPK信号通路活性的改变对EIK-1转录因子的影响[20].由于db-cAMP处理使PKC活性受到强烈抑制,可能通过MAPK信号通路的抑制而抑制有关的转录因子(如EIK-1)的活性,使c-fos等早期应答基因的表达受到抑制.

总之,cAMP对转化细胞增殖的抑制作用与PKC信号通路相关的增殖相关基因和抑癌基因的变化及其相互影响有关,而与CREB的磷酸化及其DNA结合活性无相关性.

致谢　对北京市肿瘤防治研究所方家椿教授在部分实验工作中的协助,表示衷心感谢.

[19]

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.

另一种抑癌基因p53,差不多在同时,即db-cAMP处理0.5h后,其表达亦开始恢复上升,而在处理2h后,其表达强度显著增强.p53本身不仅能抑制细胞进入S期

[16]

,且由于在p21基因区有

[17]

p53的结合位点,故p53可诱导p21的表达,而p21是一种广谱CKI(CdKinhibitor,CdK抑制因第1期周　涛等:cAMP对转化细胞中几种基因表达及CREBDNA结合活性的影响

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大肠杆菌毒素的致死作用

通常大肠杆菌对人无害,但有一种大肠杆菌品系称为O157:H7却能使人生病致死.因为它产生2种细

胞毒素:即Vero细胞毒素Ⅰ与Vero细胞毒素Ⅱ,这两种毒素破坏小肠细胞与肾脏细胞.以前已有证据证明Vero细胞毒素Ⅰ的作用是抑制细胞合成蛋白质,而Vero细胞毒素Ⅱ的作用原理尚不清楚.现在,日本研究者在7月15日的Gene&Development上报道,细胞中有一种蛋白质称为Bcl-2,它阻止细胞自杀,而Vero细胞毒素Ⅱ可与其结合来关闭其活性,从而导致细胞的死亡.研究者起初注意到Vero细胞毒素Ⅱ含有一段由5个氨基酸组成的链,这条链与Bcl-2上的一个片段完全相同.后来他们发现Vero细胞毒素Ⅱ通过这段与Bcl-2共享的序列与Bcl-2直接结合,而别的毒素则不能与Bcl-2结合.研究者并发现在缺乏Bcl-2的细胞内,Vero细胞毒素Ⅱ并不引起细胞死亡,如果用含有这段共享序列的蛋白质片段来预处理细胞,则可能使制造Bcl-2的细胞减少受Vero细胞毒素Ⅱ杀伤而引起的死亡,推测这种预处理能阻止Vero细胞毒素Ⅱ与Bcl-2的结合.此外,还有人发现Vero细胞毒素能破坏癌细胞,故计划将其用于治疗人脑肿瘤.

(李　潇摘译自:J.Travis:ScienceNews,Vol.158,July22,2000,p.53)