一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103698457 A(43)申请公布日 2014.04.02

(21)申请号 201310726084.2(22)申请日 2013.12.25

(71)申请人重庆出入境检验检疫局检验检疫技

术中心

地址400020 重庆市江北区红黄路8号申请人中国检验检疫科学研究院(72)发明人王俊苏 彭涛 周启明 唐伯彬

王国民 王雅 郗存显 向露李贤良(74)专利代理机构重庆市恒信知识产权代理有

限公司 50102

代理人刘小红(51)Int.Cl.

G01N 30/88(2006.01)

权利要求书1页 说明书5页 附图1页权利要求书1页 说明书5页 附图1页

()发明名称

一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法(57)摘要

本发明公开了一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，本方法采用液相色谱-串联质谱进行测定。该方法包括面粉中偶氮甲酰胺的提取、衍生化的样品前处理步骤，基质匹配校正溶液的制备步骤和液相色谱-串联质谱的检测及确证步骤。本发明提供的面粉中偶氮甲酰胺的测定方法具有步骤简便、快速、准确度和精密高等优点。

CN 103698457 ACN 103698457 A

权 利 要 求 书

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1.一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，主要包括如下步骤：（1）样品前处理

称取2.0g面粉于50mL离心管中，加入136mg/L对甲苯亚磺酸钠的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL进行提取和衍生化，涡旋混匀，振荡10min，于8000r/min离心5min，移取上清液于另一离心管中，再用10mL对甲苯亚磺酸钠溶液提取和衍生化一次，合并上清液，涡旋混匀，于8000r/min离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，获得待测样液，供液相色谱-串联质谱测定和确证；

（2）基质匹配校正溶液的制备准确称取100g空白面粉，添加9.00mg偶氮甲酰胺标准物质，搅拌至少2h直至混匀，得到90mg/kg偶氮甲酰胺的添加样品，对所述90mg/kg偶氮甲酰胺的添加样品添加空白面粉进行逐级稀释，然后分别称取2.0g所述添加偶氮甲酰胺的添加样品，按照步骤（1）的处理方法进行处理，得到若干不同浓度的基质匹配校正溶液；（3）液相色谱-串联质谱检测及确证根据待测样液中偶氮甲酰胺含量情况，选定浓度相近的基质匹配校正溶液进行液相色谱-串联质谱定量；基质匹配校正溶液和待测样液中偶氮甲酰胺衍生产物的响应值均在液相色谱-串联质谱仪检测的线性范围内，基质匹配校正溶液和样液等体积参插进样测定；如果待测样液中与基质匹配校正溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证分析，判定待测样液中含有偶氮甲酰胺，采用基质匹配校正溶液外标法定量。

2.根据权利要求1所述一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，其特征在于：所述确证分析为：偶氮甲酰胺衍生产物质量色谱峰保留时间与偶氮甲酰胺标准物质衍生产物相一致，并且在除去背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现；同时所选择离子的丰度比与偶氮甲酰胺标准物质衍生产物的相关离子的丰度比在允许偏差之内；则判定待测样液中存在偶氮甲酰胺。

3.根据权利要求2所述一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，其特征在于：所述偶氮甲酰胺标准物质衍生产物由偶氮甲酰胺用对甲苯亚磺酸钠按照步骤（1）中的提取和衍生化得到的。

4.根据权利要求1或2所述一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，其特征在于：在所述液相色谱-串联质谱检测中采用色谱柱：C18色谱柱，100mm×2.1mm（内径），1.7μm；流动相：A相：乙腈，B相：0.2%甲酸/5mmol/L乙酸铵溶液，采用梯度梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：40℃，进样量：10μL。

5.根据权利要求4所述一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，其特征在于：梯度洗脱程序为：A相/B相，初始为95:5，持续至2.0分，经线性梯度3.0分至10:90，持续至4.5分，再经线性梯度5.0分至95:5。

6.根据权利要求1或2所述一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，其特征在于：所述液相色谱-串联质谱检测中的串联质谱条件：电离方式：电喷雾电离（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：2.0kV；离子源温度：110℃；定性离子对m/z230.0/187.0、m/z230.0/90.9;定量离子对m/z230.0/156.9;锥孔电压15V;碰撞能量10eV时为m/z230.0/187.0,12eV时为m/z230.0/156.9,30eV时为m/z230.0/90.9。

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说 明 书

一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法

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技术领域

[0001]

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法。

背景技术

面粉能够为人类提供丰富的蛋白质、碳水化合物、B族维他命、维他命E、铁元素、

微量矿物质和纤维素等，全球有35%-40%的人口以面粉为主食，其中中国13亿人口也是以面粉作为主食。为了改善面粉的加工性能，往往需要对其进行改性。偶氮甲酰胺就是常用的面粉改性剂之一。偶氮甲酰胺是一种黄至橘红色结晶性粉末，早期是一种用于生产聚乙烯材料的发泡剂。由于偶氮甲酰胺具有漂白和氧化双重作用，现如今，大部分偶氮甲酰胺用于面粉的改性。偶氮甲酰胺的改性机理是通过氧化面粉蛋白中的巯基使之变成二硫键,从而有效地改善面团的弹性、韧性及均匀性。然而，偶氮甲酰胺对人体健康具有一定的负作用。首先，偶氮甲酰胺在面包制作的高温高湿条件下会降解生成一种致癌物质-氨基脲；其次，该化合物本身会引起呼吸道症状、哮喘和皮肤过敏。中国、美国、加拿大等国家将面粉中偶氮甲酰胺的添加限量规定为45mg/kg，而欧盟、澳大利亚、新加坡等则禁止将偶氮甲酰胺用于面粉的改性。[0003] 目前，面粉中偶氮甲酰胺的测定方法主要有碘量法、分光光度法和高效液相色谱法。碘量法即美国谷物化学师协会（AACC）方法AACC Method48-71，该方法灵敏度和特异性较差，不适用于面粉中偶氮甲酰胺常规添加量（ppm级）的分析，只适用于含高浓度偶氮甲酰胺的预混改性料的分析。分光光度法是将偶氮甲酰胺还原为联二脲，然后将联二脲转变为肼，加入对二甲氨基苯甲醛显色，然后在460nm下采用分光光度计检测。分光光度法具有操作工序繁琐，耗时，特异性差等缺点。高效液相色谱法主要采用有机溶剂（如丙酮、乙腈等）提取面粉中的偶氮甲酰胺，然后采用反相C18柱进行色谱分离，紫外检测器检测，检测低限可达到1.0mg/kg。事实上，高效液相色谱法的特异性和灵敏度均劣于液相色谱-串联质谱法。目前，液相色谱-串联质谱已经成为食品安全检测中适用范围广、功能强大的检测工具。目前，还未见采用液相色谱-串联质谱测定面粉中偶氮甲酰胺的报道。[0004] 采用液相色谱-串联质谱测定面粉中偶氮甲酰胺是一个极大的挑战，主要是因为分析过程中偶氮甲酰胺会与面粉基质反应，同时偶氮甲酰胺在串联质谱系统中无响应。因此，克服和解决上述难题，建立简单、准确、灵敏的面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证的液相色谱-串联质谱方法，对于面粉中偶氮甲酰胺的有效监控，确保面粉类食品安全，促进我国面粉及烘焙行业的健康和稳定发展，促进国际贸易，都具有十分重要的意义。

[0002]

发明内容

[0005] 鉴于现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，使本方法操作简单，灵敏度、准确度和精密度高。本发明采用的技术方案是：一种面粉中偶氮甲酰胺的测定和确证方法，主要包括如下步骤：

[0006]

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[0007] （1）样品前处理

说 明 书

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称取2.0g面粉于50mL离心管中，加入136mg/L对甲苯亚磺酸钠的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL进行提取和衍生化，涡旋混匀，振荡10min，于8000r/min离心5min，移取上清液于另一离心管中，再用10mL对甲苯亚磺酸钠溶液提取和衍生化一次，合并上清液，涡旋混匀，于8000r/min离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，获得待测样液，供液相色谱-串联质谱测定和确证；[0009] （2）基质匹配校正溶液的制备[0010] 准确称取100g空白面粉（即不含偶氮甲酰胺的面粉），添加9.00mg偶氮甲酰胺标准物质，搅拌至少2h直至混匀，得到90mg/kg偶氮甲酰胺的添加样品，对90mg/kg偶氮甲酰胺的添加样品添加空白面粉进行逐级稀释，然后分别称取2.0g添加偶氮甲酰胺的添加样品，按照步骤（1）的处理方法进行处理，得到若干不同浓度的基质匹配校正溶液；[0011] （3）液相色谱-串联质谱检测及确证

[0012] 分别取10μL待测样液和任一浓度的基质匹配校正溶液，进行液相色谱-串联质谱检测，获得待测样液中偶氮甲酰胺的预测含量；根据待测样液中偶氮甲酰胺含量情况，选定与该浓度（即预测的待测样液中偶氮甲酰胺含量情况）相近的基质匹配校正溶液进行液相色谱-串联质谱定量；基质匹配校正溶液和待测样液中偶氮甲酰胺衍生产物的响应值均在液相色谱-串联质谱仪检测的线性范围内，基质匹配校正溶液和样液等体积参插进样测定；如果待测样液中与基质匹配校正溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证分析，判定待测样液中含有偶氮甲酰胺，采用基质匹配校正溶液外标法定量。[0013] 为优化上述技术方案，上述确证分析为：偶氮甲酰胺衍生产物质量色谱峰保留时间与偶氮甲酰胺标准物质衍生产物相一致，并且在除去背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现；同时所选择离子的丰度比与偶氮甲酰胺标准物质衍生产物的相关离子的丰度比在允许偏差之内；则判定待测样液中存在偶氮甲酰胺。偶氮甲酰胺标准物质衍生产物由偶

[0008]

氮甲酰胺用对甲苯亚磺酸钠按照步骤（1）中提取和衍生化得到的。[0014] 在上述液相色谱-串联质谱检测中采用色谱柱：C18色谱柱，100mm×2.1mm（内径），1.7μm；流动相：A相：乙腈，B相：0.2%甲酸/5mmol/L乙酸铵溶液，采用梯度梯度洗脱；流速：0.3mL/min；柱温：40℃，进样量：10μL。[0015] 上述梯度洗脱程序为：A相/B相，初始为95:5，持续至2.0分，经线性梯度3.0分至10:90，持续至4.5分，再经线性梯度5.0分至95:5。

[0016] 上述液相色谱-串联质谱检测中的串联质谱条件：电离方式：电喷雾电离（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：2.0kV；离子源温度：110℃；定性离子对m/z230.0/187.0、m/z230.0/90.9;定量离子对m/z230.0/156.9;锥孔电压15V;碰撞能量10eV时为m/z230.0/187.0,12eV时为m/z230.0/156.9,30eV时为m/z230.0/90.9。

[0017] 本发明与现有技术相比具有以下的优点：通过N,N-二甲基甲酰胺提取、对甲苯亚磺酸钠衍生化、液相色谱-串联质谱测定等对面粉中偶氮甲酰胺进行了测定和确证，方法具有简单，快速，灵敏度、准确度和精密度较高等优点。附图说明

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说 明 书

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图1为偶氮甲酰胺标准品衍生产物的多反应监测（MRM）色谱图；

[0019] 图中A为离子对m/z230/156.9的MRM图，B为离子对230/90.9的MRM图。具体实施方式

[0020] 下面结合实施例，对本发明的具体实施方式做进一步的描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来本发明的范围。

[0021] 本实施例采用的是重庆文琪食品有限公司生产的散装面粉。具体测定过程如下：[0022] （1）称取2.0g面粉于50mL离心管中，加入136mg/L对甲苯亚磺酸钠的N,N-二甲基甲酰胺溶液10mL进行提取和衍生化，涡旋混匀，振荡10min，于8000r/min离心5min，移取上清液于另一离心管中，再用10mL对甲苯亚磺酸钠溶液提取和衍生化一次，合并上清液，涡旋混匀，于8000r/min离心3min，取上清液过0.22μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定和确证。[0023] （2）液相色谱-串联质谱测定条件[0024] ①液相色谱条件[0025] 1)色谱柱：C18色谱柱，100mm×2.1mm（内径），1.7μm，或相当者；[0026] 2)流动相：乙腈（A），0.2%甲酸/5mmol/L乙酸铵溶液（B），梯度洗脱程序见表1；[0027] 3)流速：0.3mL/min；[0028] 4)柱温：40℃；[0029] 5)进样量：10μL。

[0030] 表1液相色谱梯度洗脱程序

[0031]

时间（min）0.02.03.04.55.0

[0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037]

A9595101095

B5590905

②串联质谱条件

1)电离方式：电喷雾电离（ESI）；2)扫描方式：正离子扫描；3)检测方式：多反应监测（MRM）；4)毛细管电压：2.0kV；

5)离子源温度：110℃；

[0038] 6)定性离子对、定量离子对、驻留时间等参数见表2。[0039] 表2定量离子对、定性离子对、驻留时间、锥孔电压、碰撞能量等参数

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CN 103698457 A[0040]

说 明 书

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[0041] “*”定量离子对

[0042] （3）基质匹配校正溶液的制备

准确称取100g空白面粉（不含偶氮甲酰胺的面粉，可市购或直接委托面粉加工厂加工），添加9.00mg偶氮甲酰胺标准物质，搅拌至少2h直至混匀，得到偶氮甲酰胺添加水平为90mg/kg的添加样品。对90mg/kg添加样品采用空白面粉进行逐级稀释，得到较低添加水平（0.1mg/kg-45.0mg/kg）的添加样品。准确称取2.0g添加样品，按照样品前处理方法进行处理，得到基质匹配校正溶液。[0044] （4）液相色谱-串联质谱检测及确证[0045] 根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的基质匹配校正溶液，基质匹配校正溶液和待测样液中偶氮甲酰胺衍生产物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。基质匹配校正溶液和样液等体积参插进样测定。偶氮甲酰胺标准品衍生产物的多反应监测（MRM）色谱图参见图1。基质匹配校正溶液和样液均按照液相色谱-串联质谱测定条件进行测定，如果样液中与基质匹配校正溶液相同的保留时间有峰出现，则对其进行确证。经确证分析被测物衍生产物质量色谱峰保留时间与标准物质衍生产物相一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，所选择的离子均出现；同时所选择离子的丰度比与标准物质衍生产物的相关离子的相对丰度比在允许偏差之内（见表3），则可判定样品中存在对应的被测物。采用基质匹配校正溶液外标法定量。

[0046] 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差

[0043] [0047] 相对离子丰度/%

>50

>20～50±25

>10～20±30

≤10±50

允许的相对偏差/%±20[0048]

面粉添加0.1，22.5，45.0，90.0mg/kg的浓度水平进行添加回收试验，每个浓度水

平平行测定6次，平均回收率和相对标准偏差见表4。由表4可知,偶氮甲酰胺的回收率在90.3%-96.8%之间,精密度(相对标准偏差)在3.5%-8.9%之间,这表明本方法具有较高的准确度和精密度。本方法的定量限为0.1mg/kg，而其他文献报道的分光光度法的定量限为2.5mg/kg，高效液相色谱法的定量限为1.0mg/kg，因此，本方法具有较高的灵敏度。[0049] 表4加标回收率和精密度

[0050]

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说 明 书

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由以上实施例可以看出，本发明实施例通过N,N-二甲基甲酰胺提取、对甲苯亚磺

酸钠衍生化、液相色谱-串联质谱测定等对面粉中偶氮甲酰胺进行了测定和确证，方法具有简单，快速，灵敏度、准确度和精密度较高等优点。[0052] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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说 明 书 附 图

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图1

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