井冈霉素发酵生产方法[发明专利]

*CN101851653A*

(10)申请公布号 CN 101851653 A(43)申请公布日 2010.10.06

(12)发明专利申请

(21)申请号 201010173832.5(22)申请日 2010.05.17

(71)申请人上海交通大学

地址200240 上海市闵行区东川路800号(72)发明人周文文 钟建江

(74)专利代理机构上海交达专利事务所 31201

代理人王锡麟 王桂忠(51)Int.Cl.

C12P 19/46(2006.01)C12R 1/55(2006.01)

权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 1 页

()发明名称

井冈霉素发酵生产方法(57)摘要

一种生物工程技术领域的井冈霉素发酵生产方法，通过将孢子悬浮液进行菌种活化与平板培养制成孢子活化液；再将孢子活化液接种于种子培养基中进行初步培养，得到种子培养液；最后将种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养，实现井冈霉素的发酵生产。本发明使井冈霉素的产量进一步提高。本发明的方法在不加大能耗的前提下，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本，在工业化生产中具有应用价值。

CN 101851653 ACN 101851653 ACN 1018516 A

权 利 要 求 书

1/1页

1.一种井冈霉素发酵生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、将孢子悬浮液进行菌种活化与平板培养制成孢子活化液；第二步、将孢子活化液接种于种子培养基中进行初步培养，得到种子培养液；第三步、将种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养，实现井冈霉素的发酵生产。2.根据权利要求1所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的第一步具体为：将-70℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，并于37℃培养5-8天后取平板表面覆盖的孢子，制成孢子活化液。

3.根据权利要求2所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)属于放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、链霉菌科、链霉菌属。

4.根据权利要求1或2所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的孢子悬浮液为平板培养5-8天的孢子，加入5-10mL体积比浓度为20％甘油混匀得到的悬浮液。

5.根据权利要求2所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为蒸馏水。

6.根据权利要求1所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的第二步具体为：将种子培养基和孢子活化液按照体积比为1000∶1的比例配比后接种到种子培养基中，接种后于37℃下进行发酵培养15-30h。

7.根据权利要求1或6所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2PO40.8g/L，余量为蒸馏水。

8.根据权利要求1所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的第三步具体为：将发酵培养基和种子培养液按照体积比为10∶1的比例配比后接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养，培养5-30h时后每100mL培养基中添加0.01-0.5mL无水乙醇使其在培养基中浓度达到0.01-0.5％，继续培养72-108h后发酵结束。

9.根据权利要求1或8所述的井冈霉素发酵生产方法，其特征是，所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl 1g/L以及KH2PO41.5g/L，余量为蒸馏水。

2

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书井冈霉素发酵生产方法

1/7页

技术领域

[0001]

本发明涉及的是一种生物工程技术领域的方法，具体是一种井冈霉素发酵生产方

法。背景技术

井冈霉素国外又称“有效霉素”(Validamycin)，是我国及东南亚水稻主产区用于防治水稻纹枯病的最佳生物农药之一，施用后无耐药现象，同时还是生产阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)两种糖尿病临床用药的直接原料。本次采用菌株是上海农药所报道的吸水链霉菌井冈变种5008菌株(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)，该菌株能同时产生井冈霉素和静丝霉素两类抗生素，其有效成分井冈霉素现阶段在我国的年需求量超过6万吨，年产值超5亿元，是迄今为止我国使用最广的一种农用抗生素。

[0003] 经对现有技术文献检索发现，在井冈霉素工业化生产的30多年中，人们多采用菌种选育和培养基优化来提高井冈霉素发酵产量。1970年Iwasa首次报道了有效霉素并对吸水链霉菌柠檬变种发酵生产有效霉素A和B进行了探索，最终获得的优化后产量为620mg/L。2003年陈力力和鲁迎新采用微波诱变选育井冈霉素生产菌，获得了遗传稳定的高产菌株，产量较出发菌株提高了20％左右。2007年，虞龙和安肖探索使用金属离子和气体离子交替注入诱变方法，得到了较高的正突变率和突变增幅，获得了比出发菌株提高.4％的遗传稳定的高产菌株。

[0004] 目前井冈霉素的工业生产中多采用玉米粉、黄豆饼粉等廉价碳氮源外加适量钾钠盐为主要培养基发酵生产该抗生素。从碳源代谢的角度来看，吸水链霉菌5008用于产次级代谢物井冈霉素的碳源比例已经达到相对较高的水平，同时也显示仅仅通过碳氮源优化和菌株诱变的方法来提高井冈霉素的产量遇到了瓶颈。[0005] 经过对现有技术的检索发现，中国专利文献号CN101298623中记载了一种提高发酵温度来增加井冈霉素产量的发酵方法，但该技术同时存在发酵后期菌体数量下降较快影响井冈霉素总产量的问题。而且提高温度必然会影响工业化发酵过程的成本。因井冈霉素发酵结束后，会产生一定量的菌渣，其主要成分是未完全利用的培养基和发酵后剩余菌体；另外，中国专利文献号CN101134976记载了一种使用循环发酵法生产井冈霉素的方法，但其主要目的是实现无菌渣和无废水排放减少环境污染，在井冈霉素节能增产方面未见改善。因此，在现有优化后的发酵水平基础上，控制能耗成本的前提下，如果能通过添加微量的细胞刺激物影响次级代谢的水平，从而实现次级代谢物的高效发酵也许将会是突破井冈霉素产量瓶颈的重要手段。

[0002]

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种井冈霉素发酵生产方法，通过添

加微量乙醇的方法，刺激吸水链霉菌代谢，特别是次级代谢系统，使井冈霉素的产量进一步

[0006]

3

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书

2/7页

提高。本发明的方法在不加大能耗的前提下，缩短了发酵周期，提高了设备利用率，获得较高的井冈霉素产量，降低了生产成本，在工业化生产中具有应用价值。[0007] 本发明是通过以下技术方案实现的，包括以下步骤：

[0008] (1)将孢子悬浮液进行菌种活化与平板培养制成孢子活化液，具体为：[0009] 将-70℃保存的吸水链霉菌井冈变种5008菌株的孢子悬浮液融化，将其涂布于含有固体培养基的平板上，然后将平板倒置，并于37℃培养5-8天后取平板表面覆盖的孢子，制成孢子活化液；

[0010] 所述的吸水链霉菌井冈变种5008菌株(Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008)属于放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、链霉菌科、链霉菌属，其生物保藏信息为：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院)，菌种保藏号CGMCC4.1026。

[0011] 所述的孢子悬浮液为平板培养5-8天的孢子，加入5-10mL 20％甘油(v/v)混匀得到的悬浮液。

[0012] 所述的固体培养基的组分为：黄豆饼粉20g/L、甘露醇20g/L以及琼脂20g/L，余量为蒸馏水。

[0013] (2)将孢子活化液接种于种子培养基中进行初步培养，得到种子培养液，具体为：[0014] 将种子培养基和孢子活化液按照体积比为1000∶1的比例配比后接种到种子培养基中，接种后于37℃下进行发酵培养15-30h；[0015] 所述的种子培养基的组分为：玉米粉30g/L、黄豆饼粉22g/L、酵母粉10g/L、NaCl 2g/L以及KH2PO40.8g/L，余量为蒸馏水。

[0016] (3)将种子培养液接种于发酵培养基中进行发酵培养，实现井冈霉素的发酵生产，具体为：

[0017] 将发酵培养基和种子培养液按照体积比为10∶1的比例配比后接种到发酵培养基中，接种后于37℃下培养，培养5-30h时加入微量乙醇使其在培养基中浓度达到0.01-0.5％(每100mL培养基中添加0.01-0.5mL无水乙醇)，继续培养72-108h后发酵结束，进行井冈霉素测定。

[0018] 所述的发酵培养基的组分为：玉米粉100g/L、黄豆饼粉25g/L、酵母粉5g/L、NaCl 1g/L以及KH2PO41.5g/L，余量为蒸馏水。

[0019] 本发明利用微生物生长外源刺激物酒精可以抑制或激活某些次级代谢物分泌的规律，使用了添加低浓度乙醇的发酵培养基来提高井冈霉素的发酵产量和生产速率。本发明确定了乙醇的最适添加时间为发酵开始12h，最适添加浓度为0.05％，96h发酵培养后井冈霉素的绝对积累量从12g/L提高到了约20g/L，降低了生产成本。而且为获得井冈霉素可在96h终止发酵，使发酵提前一天结束，缩短了发酵时间，获得了更高的相对效价。附图说明

图1为实施例中乙醇的添加时间对井冈霉素发酵产量的动态影响图。[0021] 图2为实施例中乙醇的添加浓度对井冈霉素发酵产量的动态影响图。

[0020]

4

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书

3/7页

具体实施方式

[0022] 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。[0023] 实施例1

[0024] 发酵培养基中乙醇添加时间对井冈霉素产量的影响考察，选择3个时段：种子液接种前即0h、发酵开始后12h、发酵开始后24h，分别添加不同浓度乙醇进行发酵试验。实施步骤和结果如下：[0025] 1.实施步骤

[0026] (1)菌种活化与平板培养[0027] 将黄豆饼粉、甘露醇、琼脂按2％的浓度配成平板培养基，灭菌倒平板冷却后待用。将-70℃保存的井冈霉素产生菌吸水链霉菌5008的孢子悬浮液融化，将其涂布于固体培养基平板上，然后将平板倒置，于37℃培养5-8天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子长势良好的平板上加入5mL无菌水，使用涂布棒轻轻刮动平板表面覆盖的孢子，使其悬浮于无菌水中。[0028] (2)种子培养

[0029] 将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250mL锥形瓶底部，装入50mL种子培养基(成分：玉米粉3g、黄豆饼粉2.2g、酵母粉1g、NaCl 0.2g、KH2PO40.08g、蒸馏水100mL)，灭菌。待培养基冷却至室温，吸取孢子悬浮液50μL加入摇瓶中接种。接种后，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养24h，至少设置3个平行样。[0030] (3)发酵培养[0031] 对照组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基(成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g、KH2PO40.15g、蒸馏水100mL)。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。[0032] 乙醇添加组：设置了三个乙醇添加时间0h、12h、24h，设置相对较宽的添加浓度范围0.001％、0.01％、0.1％。0h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基，灭菌冷却后直接加入不同剂量的乙醇(0.001％、0.01％、0.1％)，因0.001％组乙醇添加量较少，可先无菌水稀释10倍后添加，另两个浓度组可直接添加分析纯乙醇。每个剂量组至少3个平行样，然后将9个摇瓶转接种子液。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。12h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，将摇瓶取出在超净台中加入不同剂量的乙醇(0.001％、0.01％、0.1％)，每个剂量组至少3个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行12h即到达24h取样点，依次在24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。24h添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形

5

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书

4/7页

瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到24h时，将摇瓶取出在超净台中先取出2mL培养液作为井冈霉素检测样品(24h取样点)，然后摇瓶内加入不同剂量的乙醇(0.001％、0.01％、0.1％)，每个剂量组至少3个平行样，然后将9个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，培养再进行一天即到达48h取样点，依次在48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。[0033] (4)井冈霉素产量检测[0034] 样品处理：发酵液2mL于10000g离心5min，菌体上清分离。发酵上清液0.5mL加入等体积的氯仿，剧烈震荡数分钟直至形成乳浊液。室温静置15min，以最大转速离心5min，转移上清至新管中，稀释5倍(200μL+800μL蒸馏水)，样品0.22μm滤膜过滤、最大转速离心5min后作为HPLC上样样品。井冈霉素标品处理：井冈霉素配成10g/L(0.1g/10mL)，取100μL、200μL、300μL、400μL、500μL加水至1mL(浓度约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L，乘以标品纯度即为标品准确的实际浓度)。流动相配置：使用5mmol/L pH 7.0的磷酸盐缓冲液作为流动相(磷酸盐缓冲液∶色谱纯甲醇＝98∶2体积比)，NaH2PO4·2H2O 0.78g+100mL水(取51mL)、Na2HPO4·12H2O 1.79g+100mL水(取49mL)，得到100mL混合液，混匀定容至1000mL，用稀释10倍的母液调pH 7.0。流动相抽滤、超声波处理20min，液相上磷酸盐流动相时先使用10％的甲醇过渡。液相检测条件：流速1mL/min，检测波长210nm，使用依利特Hypersil ODS25um、4.6mm×250mm分析柱，控制柱温25℃，保留时间约为8min。根据峰面积比对标准曲线得到井冈霉素含量，因样品处理时均稀释5倍所以比对得到的含量乘以5得到井冈霉素的发酵产量。[0035] 2.实施结果分析

[0036] 通过实施结果比对知乙醇添加组最高发酵产量形成于96h，不同处理组与对照组乙醇不同添加时间下井冈霉素的最高产量分别为对照组12.45±1.407g/L、0.001％浓度下乙醇0h添加组12.58±1.743g/L、0.001％浓度下乙醇12h添加组13.68±1.662g/L、0.001％浓度下乙醇24h添加组13.04±1.323g/L、0.01％浓度下乙醇0h添加组13.76±1.338g/L、0.01％浓度下乙醇12h添加组18.30±1.617g/L、0.01％浓度下乙醇24h添加组13.03±2.212g/L、0.1％浓度下乙醇0h添加组10.69±1.020g/L、0.1％浓度下乙醇12h添加组11.76±1.683g/L、0.1％浓度下乙醇24h添加组11.47±2.9g/L，由此可见在几种乙醇不同添加量的处理组都存在12h添加组井冈霉素产量高的现象。其中乙醇添加量在0.01％时相对于对照组井冈霉素产量有较大提高，所以对其在不同添加时间的动态影响作图(见图1)。经试验结果分析发现，井冈霉素生产菌吸水链霉菌5008在发酵进行到12h时处于细胞代谢最旺盛的对数生长期，相对于0h和24h添加乙醇，12h添加乙醇对井冈霉素的产量影响更为明显，比其他时间段添加产量可提高40％，与对照组相比可提高50％。[0037] 实施例2

[0038] 发酵培养基中在12h添加乙醇可促进井冈霉素产量提高，接下来更加详细地比较了不同乙醇添加量对井冈霉素产量的影响，先选择4个相对较低添加浓度：0.001％、0.005％、0.01％、0.05％。实施步骤和结果如下：[0039] 1.实施步骤

[0040] (1)菌种活化与平板培养

6

CN 101851653 ACN 1018516 A[0041]

说 明 书

5/7页

将黄豆饼粉、甘露醇、琼脂按2％的浓度配成平板培养基，灭菌倒平板冷却后待用。将-70℃保存的井冈霉素产生菌吸水链霉菌5008的孢子悬浮液融化，将其涂布于固体培养基平板上，然后将平板倒置，于37℃培养5天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子长势良好的平板上加入5mL无菌水，使用涂布棒轻轻刮动平板表面覆盖的孢子，使其悬浮于无菌水中。[0042] (2)种子培养

[0043] 将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250mL锥形瓶底部，装入50mL种子培养基(成分：玉米粉3g、黄豆饼粉2.2g、酵母粉1g、NaCl 0.2g、KH2PO40.08g、蒸馏水100mL)，灭菌。待培养基冷却至室温，吸取孢子悬浮液50μL加入摇瓶中接种。接种后，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养18h，至少设置3个平行样。[0044] (3)发酵培养[0045] 对照组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基(成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g、KH2PO40.15g、蒸馏水100mL)。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到12h、14h、18h、24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。[0046] 乙醇添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，作为12h取样点先每瓶取出2mL发酵液，然后在超净台中加入不同剂量的乙醇(0.001％、0.005％、0.01％、0.05％)，0.001％和0.005％两个浓度组添加时先把乙醇用无菌水稀释10倍后再添加，0.01％和0.05％两个浓度组直接添加分析纯乙醇。每个剂量组至少3个平行样，再将21个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，依次在14h、18h、24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。[0047] (4)井冈霉素产量检测[0048] 同实施例1。

[0049] (5)吸水链霉菌5008生物量检测[0050] 样品处理：2mL样品离心后沉淀下来的菌体用STE缓冲液(pH 8.0)悬浮、离心、洗涤两次后，恢复到2mL(STE溶解)混匀，分装2个离心管(250μL/管+250μLSTE)，一管加50mg/mL溶菌酶溶液20μL，另一管为空白对照。将处理样、空白样一起放入37℃水浴保温1h，不断振荡。加入10μL 10％SDS进一步裂解细胞并充分振荡(低浓度条件下用对照可以消除SDS的干扰)。12000g离心10min，吸取上清液根据浓度情况稀释25倍至测定范围内，利用Bradford法测定蛋白浓度。其中STE缓冲液组成为：1mol/LTris-HCl(pH 8.0)2.5mL、0.5mol/L EDTA 0.5mL、5mol/L NaCl 5mL定容至250mL。[0051] 样品测定：分别取试管，其中一支加入1.0mL空白样，另外一支加入同体积的处理样，加入5mL考马斯亮蓝G250摇匀放置5min，595nm处测吸光度，用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清蛋白的mg数，乘以稀释倍数(2×25)得蛋白量表征的生物量。[0052] (6)发酵培养基残糖测定[0053] 样品处理：2mL发酵液离心取100μL上清液，48h前样品(包括48h)梯度稀释

7

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书

6/7页

1000倍，72h后样品(包括72h)梯度稀释500倍；标品处理：葡萄糖烘干1天，0.1g加水10mL(10g/L)稀释100倍(100mg/L)，取三份200μL、400μL、600μL、800μL、1000μL加水至1mL(浓度：20mg/L，40mg/L，60mg/L，80mg/L，100mg/L)。样品测定：加入5％苯酚溶液1mL，再与5mL浓H2SO4混合均匀，快速加入边加边震荡，放置反应10min，冷却后在488nm处测吸光度。比照标准曲线，分别乘以1000或500得残糖量。[00] 2.实施结果分析

[0055] 乙醇添加量在0.05％和0.01％时，井冈霉素产量较对照组有较大提高(图2)，低浓度范围最适添加量为0.05％。最高产量出现在0.05％乙醇处理组发酵96h，从12g/L提高至约20g/L，产量提高了8g/L，涨幅超过60％。在最高产量点上，乙醇处理的吸水链霉菌5008的生物量没有显著差异(96h样品：对照组胞内蛋白表征的生物量3.974±0.2474g/L，0.01％乙醇处理组3.9±0.09426g/L，0.05％乙醇处理组3.782±0.6991g/L)，表明单位细胞井冈霉素的产量也得到了提高。工业化井冈霉素生产过程中为防止乙醇对细胞的毒害作用，发酵过程中没有外源乙醇的加入，但由本实施例可以看到适量乙醇的添加对发酵生产次级代谢物的刺激作用并由此可体现其工业应用价值。[0056] 实施例3

发酵培养基中在12h添加乙醇可促进井冈霉素产量提高，接下来更加详细地比较

了不同乙醇添加量对井冈霉素产量的影响，选择3个相对较高的添加浓度：0.1％、0.5％、1％。实施步骤和结果如下：[0058] 1.实施步骤

[0059] (1)菌种活化与平板培养[0060] 将黄豆饼粉、甘露醇、琼脂按2％的浓度配成平板培养基，灭菌倒平板冷却后待用。将-70℃保存的井冈霉素产生菌吸水链霉菌5008的孢子悬浮液融化，将其涂布于固体培养基平板上，然后将平板倒置，于37℃培养7天后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子长势良好的平板上加入5mL无菌水，使用涂布棒轻轻刮动平板表面覆盖的孢子，使其悬浮于无菌水中。[0061] (2)种子培养

[0062] 将不锈钢弹簧卷曲成环状，置于250mL锥形瓶底部，装入50mL种子培养基(成分：玉米粉3g、黄豆饼粉2.2g、酵母粉1g、NaCl 0.2g、KH2PO40.08g、蒸馏水100mL)，灭菌。待培养基冷却至室温，吸取孢子悬浮液50μL加入摇瓶中接种。接种后，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养30h，至少设置3个平行样。[0063] (3)发酵培养[00] 对照组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基(成分：玉米粉10g、黄豆饼粉2.5g、酵母粉0.5g、NaCl 0.1g、KH2PO40.15g、蒸馏水100mL)。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养，至少设置3个平行样。培养进行到24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。

[0057] [0065]

乙醇添加组：发酵摇瓶选择放入弹簧的250mL锥形瓶，瓶内装入50mL发酵培养基。转接时首先将三个平行种子液混合均匀，然后使用灭过菌的5mL移液管吸取5mL种子液转移到发酵摇瓶中，将摇瓶至于37℃下、转速220rpm培养。培养进行到12h时，作为12h

8

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书

7/7页

取样点先每瓶取出2mL发酵液，然后在超净台中直接加入不同剂量的分析纯乙醇(0.1％、0.5％、1％)，每个剂量组至少3个平行样，再将21个摇瓶放置摇床内按37℃、220rpm继续培养，依次在24h、48h、72h、96h、120h每个摇瓶分别取出2mL培养液进行井冈霉素检测。[0066] (4)井冈霉素产量检测[0067] 同实施例1。

(5)吸水链霉菌5008生物量检测

[0069] 同实施例2。

[0070] (6)发酵培养基残糖测定[0071] 同实施例2。[0072] 2.实施结果分析

[0073] 乙醇添加量在0.1％、0.5％、1％时，井冈霉素产量较对照组均无提高的现象(图2)，特别是浓度1％时对井冈霉素产量已有明显的抑制作用。残糖量测定发现在乙醇添加量达到0.1％时，发酵初期糖代谢开始受到一定抑制(对照组0h、24h、48h、72h、96h、120h的残糖量分别为90.35±0.8763g/L、46.50±0.3125g/L、12.75±2.475g/L、8.190±2.812g/L、7.900±0.775g/L、6.680±3.003g/L；0.1％乙醇组分别为90.35±0.8763g/L、56.70±0.9712g/L、32.04±3.329g/L、13.56±1.574g/L、9.760±2.278g/L、7.270±2.171g/L)，相对较高浓度的乙醇(＞0.1％)添加会产生相反的效应，引起农药产量的下降，不利于工业化生产。所以在实际应用过程中应严格控制乙醇添加浓度和添加时间，才能提高经济效益降低工业生产成本。

[0068]

9

CN 101851653 ACN 1018516 A

说 明 书 附 图

1/1页

图1

图2

10