６ ２０１５．Ｖｏ１．３５，Ｎｏ．１７ 农业与技术 ※农业科学 纳豆激酶发酵过程放大策略的研究 王万春，李天文，薛建 （吉林农业科技学院生物工程学院，吉林吉林１３２１０１） 摘要：作为一种新型的溶血栓药物，纳豆激酶与当前使用的溶血栓药物相比，具有安全性好、作用迅速，成本低，以 及可通过液体发酵大规模生产等优点。利用单因素试验，对在纳豆激酶生产茵液体发酵中溶解氧和剪切力对生产纳豆 激酶的影响，从而确定纳豆激酶发酵罐发酵放大的主要控制策略。结果表明，纳豆激酶对溶解氧浓度要求较高，并且 可以承受较低的搅拌桨剪切力。 关键词：纳豆激酶；发酵放大策略；溶解氧；剪切力 中图分类号：ＴＳ２１４．２ 文献标识码：Ａ ＤＯＩ：１０．１１９７４／ｎｙｙｊｓ．２０１５０９３２００３ 纳豆是盛行于日本的传统发酵大豆食品，至今已有 近２０００年的历史，它不仅作为食品被广泛食用，而且 还作为药品用来预防和治疗心脑血管性疾病”】。Ｓｕｍｉ等 人 １９８７年从纳豆中提取出具有溶血栓功能的物质， １．２ 试剂 纤维蛋白原（Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ），凝血酶（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）， 尿激酶（Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ），购于Ｓｉｇｍａ公司；其他试剂均为 国产分析纯。 将其定名为纳豆激酶。该酶能显著溶解机体内外血栓， 明显缩短优球蛋白的溶解时间，并能激活静脉内皮细胞 产生纤维蛋白溶酶原激活剂（卜ＰＡ）ｐ。 。 一１＿３ 培养基 斜面培养基：ＬＢ固体培养基（蛋白胨ｌＯｇ／Ｌ，酵母 膏５ｇｌＬ，ＮａＣ１ １０・ｇ／Ｌ，１琼脂粉５ｇ／Ｌ，ｐＨ ７．０，） 般的工业发酵过程研究可分为实验室研究，小试 液体种子培养基与液体发酵培养基：采用ＬＢ液体 培养基，组成除无琼脂粉外同ＬＢ固体培养基。 １．４ 培养条件 采用ＬＢ液体培养基，接种量２％，３０￣（２下摇床培养 及中试 个阶段，以验证并完善发酵—ｒ艺，进行大规模 生产。这一研究过程中，在实验室研究所获得的产物的 产量往往较高，而在小试和中试的放大过程中，产物的 产量不断下降，无法重现实验室试验的结果，影响了其 ２ｄ，取发酵上清液测定酶活。 Ｔ业生产的效率，因此对发酵过程的放大策略进行研究， 尽可能地降低“放大效应”，既具有重要的理论意义， 又会产生良好的经济效益。 本研究主要利用摇瓶发酵研究溶解氧和剪切力对纳 豆激酶发酵的影响，来确定其发酵罐生产的主要放大策 １．５ 溶氧量对纳豆激酶活－性的影响 摇瓶发酵是空气通过瓶口的介质扩散提供氧气的， 可通过降低摇瓶装液量，提高瓶内空气量，提高摇瓶的 溶氧水平。在转速一定的情况下，设计６个不同体积的 装液量进行单因素优化试验。 略，从而为纳豆激酶作为新型溶栓药物的未来Ｔ业化生 产提供了科学依据和前期基础，对预防和治疗心脑血管 栓塞性疾病具有一定的意义。 １．６ 剪切力对纳豆激酶活性的影响 发酵罐采用机械搅拌方式增加溶氧水平，剪切力与 搅拌桨转速和搅拌桨半径的平方成正比，因此发酵罐中 １ 材料与方法 １．１ 菌种 纳豆激酶生产菌（吉林农业科技学院生物：【程学院 实验室保藏） 翥 １．７ 纳豆激酶活力检测 嘉蓑 曩 影响。在各组摇瓶中添加玻璃珠：设定１－６个添加数量， 装液量均为３０ｍｌ／２５０ｍｌ，进行单因素优化试验。 基金项目：吉林农业科技学院大学生科技创新科研项目（项目编号：吉农院合字２０１ ３第０６４号）资助：吉林省教育厅 十二五科技技术研究项目（项目编号：吉教科合字［２０１ ２］第３０８号） 为本文通讯作者 ※农业科学 农业与技术 ２０１５，ＶｏｌＪＳ，Ｎｏ．１７ ７ 按照Ａｓｔｒｕｐ 法制备纤维蛋白平板。将不同浓度的 性也只降低１０％，这表明纳豆激酶在进行发酵罐生产时， 尿激酶（ＵＫ）标准品（０．２，０．４，０．６，０．８，１．０，１．２，１．４， 搅拌桨可以以较低的速度进行搅拌，从而在不过多影响 １．６Ｕ）点样于新配制的平板上，置于３７￣Ｃ培养箱培养１６ 酶产量的情况下，维持发酵液中的溶氧浓度。 ｈ。测定溶圈的垂直直径，计算溶圈面积，制作标准曲线 （ｙ＝Ｏ．４７５＋２．８１ｘ，ｙ：溶圈面积／ｃｍ ，ｘ：酶活单位／ｕ）。 将纳豆激酶生产菌发酵液进行１００００ｒ／ｍ离心，取上 清ｌ０ Ｌ点样于新制备的纤维蛋白平板，根据所测样品 ３ 讨论 溶解氧是影响发酵过程的最主要因素之一，本研究 结果表明，纳豆激酶发酵生产过程中，对溶解氧的要求 的垂直直径计算的面积，利用标准曲线求得相应的酶活 较高，这表明在今后的发酵罐放大过程中，维持一定的 性。 ２ 结果 ２．１ 溶氧量对纳豆激酶活性的影响 表１溶氧量对纳豆激酶活性的影响 从表１数据可见装液量对纳豆激酶液体发酵的影响 很大。在２５０ｍｌ三角瓶中装量为１５ｍｌ时，产酶酶活最高， 随着装液量的增加，酶活逐渐降低。装液量增加至３０ｍｌ 之后，酶活下降至６８１．４９ＩＵ／ｍｌ，相对酶活降至７７％；随 着装液量继续增加至３５ｍｌ和４０ｍｌ，酶活变化较慢。说 明纳豆激酶液体发酵生产过程对溶氧要求较高。 ２．２ 剪切力对纳豆激酶活性的影响 表２剪切力对纳豆激酶活性的影响 …． 三降 ！ 表２感： 着 苎妻 力 剪 力 导 活竺 ，．篓ｉ 等 ， 但即使当加入的玻璃珠增加到３个时，纳豆激酶活 三 产 对 切 篓罄 业生物环境与，通气量可促进纳豆激酶产量；发酵过程中溶解氧主要受 通气、搅拌、罐压、发酵液性质影响，本研究还表明纳 豆激酶发酵生产过程对剪切力较敏感，在菌体无法承受 较高的剪切力，即发酵罐放大过程中不允许高强度的搅 拌。在今后的生产过程中，可以维持较低的搅拌速度， 保证纳豆激酶产量。所以本研究可为纳豆激酶今后的发 酵过程放大与生产提供一定的理论基础和科学依据。 参考文献 【１］铃木英也，木内斡．高纤溶活性食品一纳豆开发的现状【Ｊ１ ．食品 科学，１９９１（６）：８５． ［２］Ｓｕｍｉ Ｈ，Ｈａｍａｄａ Ｈ，Ｔｓｕｓｈｉｍａ Ｈ， ｅｔ ａ１．Ａ ｎ０ｖｅｌｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｃｈｅｅｓｅＮａｔｔｏ；ａ ｔｙｐｉｃａｌ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｒ ｓｏｙｂｅａｎ ｆｏｏｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｊａｐａｎｅｓｅｄｉｅｔ【ＪＪ．Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ， １９８７，４３（１０）：１１１０． ［３］Ｆｕｊｉｔａ Ｍ，Ｎｏｍｕｒａ Ｋ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｉｆｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ（ｎａｔｔｏｋｉ—ｎａｓｅ） ｉｎ ｔｈｅ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｃｈｅｅｓｅ ｎａｔｔｏ，ａ ｐｏｐｕｌａｒ ｓｏｙｂｅａｎ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｏｄ ｉｎ ＪａｐａｎＩＪ】．ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎ，１９９３，１９７（３）： １３４０． 【４】Ｆｕｊｉｔａ Ｍ，Ｈｏｎｇ Ｋ，Ｉｔｏ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ ｏｎ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｒａｔ【Ｊ］． ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌｌ，１９９５，１８（１０）：１３８７． ［５１ Ｃｈａｎｇ Ｃ Ｔ，Ｆａｎ Ｍ Ｈ，Ｋｕｏ Ｆ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｔｅｎｔ ｆｊｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ ａ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＭＲ—ＮＫ １【Ｊ】．ＪＡｇｒｉｃ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ，２０００，４８（８）：３２１０． ［６］Ａｓｔｒｕｐ Ｔ，Ｍｕｌｌｅｒｔｚ Ｓ．Ｔｈｅ ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］＿Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，１ ９５２，４０ （３）：３４６－３５１． ０ 。作者简介：王万春，吉林农业科技学院吉林农业科技学院级生物技术专业学生；薛健，博士，讲师， 。 源工 。 。 ’ 研究方向：农
