DNA步骤说明2014-2-26

药品

70%的酒精

20ml氯仿，用棕色带螺口瓶子装 1X的TAE，（50X的TAE稀释50倍） 灭菌

戴手套，准备以下物品：

移液嘴：20微升3盒；200微升6盒；1毫升3盒。全用报纸单个包装好，橡皮筋捆，MARK笔做标记

EP管：0.5ml用2个玻璃瓶装，盖紧盖子；1.5ml 用2个500ml烧杯装，10ml用500ml烧杯装，报纸封口

Water：先润洗，再用玻璃瓶装2小瓶，标签写明无菌水，盖子拧紧！（water不用倒太多，一小半瓶就好，若是污染了就浪费了） 2个镊子，一把剪刀

以上物品，高压灭菌30min，之后50~60℃烘干，烘干时带盖子的瓶子（water除外），稍微拧松盖子，烘干后物品不可拆开报纸，用时拆，拆过的不能用做PCR扩增这一步！

注意：以上准备的所有物品（除镊子、剪刀外）必需准备有双份的量，以备不时之需！

提取DNA

1.湿污泥离心去除上清液，得污泥样品，取4份0.5g污泥样品，用10ml EP管装，标记号

2.加入950uL的Lysis Solution HE和50uL的Lysis Solution 20S （20S水浴65℃融化）

3.使用涡旋仪混匀，5min

4.水浴65℃培养1h，隔10min摇匀一次

5.离心1min，离心力大于12000，室温（2号转子，转速11500rpm）

6.取出上清液600uL ，放于2mL的EP管中

7.添加400uL的Purification Solution，然后充分混合。

8.在通风橱中，加入600uL的氯仿，涡旋15s，室温下离心15min，离心力大于12000（1号转子，转速12800rpm），离心结束后极小心取出EP管，并开制冷，上限4℃，下限1℃

9.极小心的取出800uL的上清液于新的2mL EP管中，加入800uL 的Precipitation Solution，充分混合，4℃下离心15min，离心力大于12000。

10.倒掉上清液，留住沉淀，沉淀物在底部相对固定，尽量倒掉上清液，可以用纸接住

11.加入1ml Wash Solution，敲打底部沉淀下来，混匀。4℃下离心10min，离心力大于12000

12.尽可能倒掉上清液，加入1ml 70%乙醇，2 uL的Ethachinmate ，混匀，抖一下，4℃下离心5min，离心力大于12000

13.倒掉上清液，到洁净台通风晾干（闻一闻有无酒精味）

14.加入100uL 的无菌水，用核酸检测仪检测DNA

PCR扩增

用酒精擦拭洁净台，把需要用的物品放进洁净台，紫外消毒30min，之后通风 酒精擦手，所有拿进洁净台的物品均需用酒精擦拭

引物的处理：引物为干粉，不可见，需室温离心2~3min，10000转。先稀释引物至10uM

27F 引物：5uL+45uL的无菌水，做2管，标明日期，浓度 1492R引物：同上

再用涡旋仪混合、离心，放冰盒里。 16s PCR 25uL 体系： 名称 单位uL ddH2O 17 27F 1 1492R 1 10X PCR Buffer 2.5 MgCl2 1.5 dNTP 0.5 Taq酶 0.5 （ddH2O必须最先加，Taq酶必须最后加） 总计24uL ，加入1uL的模板后为25uL，不加模板的为阴性（视作空白）。

首先确定要做多少个平行组，设为X组，计算各药品所需量，按（X+1）组来计算，如下： 名称 单位uL ddH2O 17*（X+1） 27F 1*（X+1） 1492R 1*（X+1） 10X PCR Buffer 2.5*（X+1） MgCl2 1.5*（X+1） dNTP 0.5*（X+1） Taq酶 0.5*（X+1） 在0.5mL 的EP管中按上表计算得知的量配制体系 取X个0.5ml的EP管，分别加入24uL 配制好的体系，并加入1uL模板，留1~2个EP管不加模板，作为阴性。做标记！！！！涡旋混匀，离心混匀，放入PCR仪中进行扩增，扩增完后放入4℃冰箱保存。 扩增程序： 预变性 94℃ 5min 变性 94℃ 1min 退水 55℃ 1min 30个循环 延伸 72℃ 2min 再延伸 72℃ 10min 结束 22℃ pause 凝胶的制备

量取150ml 1XTAE于烧杯中，加入1.5g琼脂糖，搅拌均匀 微波加热至琼脂糖溶解

加入6u的gold view，搅拌均匀，去除气泡

倒入至胶槽中，在胶槽中插入2把梳子，等待凝胶冷却成形 凝胶成形后，拔出梳子，将凝胶转移至电泳槽中

点样与电泳

取5u的Marker加入第一个点样孔中

取4u的经过PCR扩增的DNA，与2u的Loading Buffer充分混合后，加入下一个点样孔中

点样完毕后，盖上电泳槽的盖子，开启电泳，等待30~60min 照相

关闭电泳，取出凝胶，放置于凝胶成像仪器的抽屉里，打开计算机，打开凝胶成像系统电源，打开凝胶成像系统软件，照相……..保存图片……..