兽医微生物实验指导

兽医微⽣物实验教案

实验⼀显微镜油浸系的使⽤及细菌基本形态构造的观察【⽬的要求】

1.掌握正确使⽤及护理显微镜的⽅法，特别是油浸系的使⽤及护理。2.正确认识细菌的基本形态和构造。【油浸系的原理】

油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴⾹柏油，调整光源检查细菌标本的⽅法。油浸镜是⼀种⾼倍放⼤的物镜，⼀般都刻有放⼤倍数，如95×、100×等。其镜头标记国产镜多⽤“油”字表⽰，国外产品则⽤“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表⽰。⽽且油镜的镜⾝较⾼倍镜和低倍镜为长，镜⽚最⼩，这也是识别的另⼀种标志。其使⽤原理是由于⾹柏油与玻璃的折光率相似(⾹柏油为1.515，玻璃为1.52)。镜检时，滴加⾹柏油的作⽤是使光源尽可能多的进⼊物镜中，避免光线通过折光率低的空⽓(折光率为1.O)⽽散失，因⽽能提⾼物镜的分辨率，使物像明亮清晰。【器材及试剂】

1.菌种：⼤肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本⽚；2.仪器：普通光学显微镜；

3.材料：⾹柏油，⼆甲苯，擦镜纸等。【操作步骤】

(⼀)细菌基本形态构造的观察

1.准备安置显微镜→调节光源→调节双筒⽬镜间距→调节聚光器数值孔径值。

将光圈完全开放，升⾼聚光镜与载物台同⾼，置标本⽚于载物台上，在低倍镜下对光，⽤于转动反光镜以调节之，⾄视野最亮时为⽌。若⽤天然光源宜⽤反光镜平⾯，较弱光源⽤凹⾯。检查未染⾊标本，光不宜太强，染⾊标本需强光。光线强弱可通过放⼤或缩⼩光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。

2.观察将⾹柏油⼀滴滴于标本⽚有颜⾊的观察区，并置于载物台上，⽤⽚夹固定好，⽤推进器将观察区置于物镜正下⽅，依次⽤⾼倍镜→油镜观察。⽤油浸镜检查，使油镜头浸⼊油滴中，⼏乎与标本⾯接触为度。然后由接⽬镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)⾄能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动⼀般不超过1周)，直⾄物像清晰为⽌。包括⼤肠杆菌、葡萄球菌的形态及炭疽芽孢、巴⽒杆菌荚膜和⼤肠杆菌的鞭⽑等细菌的特殊结构。(⼆)显微镜的养护

1.上升镜筒，取下载玻⽚。

2.⽤擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后⽤擦镜纸蘸少许⼆甲苯（⾹柏油溶于⼆

甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后再⽤⼲净的擦镜纸擦去残留的⼆甲苯。切忌⽤⼿或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产⽣划痕，影响观察。3.⽤擦镜纸清洁其他物镜及⽬镜；⽤绸布清洁显微镜的⾦属部件。

4.将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“⼋”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发⽣碰撞危险。作业⼀．名词解释细菌荚膜芽孢油浸系⼆．问答题

1.绘制葡萄球菌、⼤肠杆菌、炭疽杆菌荚膜及芽孢等形态及排列⽅式；2.使⽤油镜时应注意哪些问题？加⾹柏油前载⽚上可否有⽔，为什么？3.细菌有哪些基本形态，各有哪些特征？实验⼆细菌抹⽚的制备及染⾊【⽬的要求】

(1)掌握细菌抹⽚的制备⽅法和⼏种常⽤的染⾊⽅法。(2)认识⾰兰⽒染⾊的反应特性。【基本原理】

1. 简单染⾊法简单染⾊法是利⽤单⼀染料对细菌进⾏染⾊的⼀种⽅法，⼀般⽤于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采⽤⼀种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进⾏染⾊。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着⾊。染⾊后的细菌细胞与背景形成鲜明的对⽐，在显微镜下更易于识别。

2.⾰兰⽒染⾊液G—菌:细胞壁中含有较多类脂质，肽聚糖层较薄、交联度低，故⽤⼄醇或丙酮脱⾊时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱⾊，再经复红复染后就成红⾊。G+菌:细胞壁中肽聚糖层厚且交联度⾼，类脂质含量少，经脱⾊剂处理后使肽聚糖层的孔径缩⼩，通透性降低，故细菌仍保留初染时的颜⾊。【器材及试剂】

1.菌种：培养24h的⼤肠杆菌(Escherichia coli)、⾦黄⾊葡萄球菌、枯草

芽孢杆菌斜⾯菌种；2.仪器：普通光学显微镜；

3.材料：载玻⽚、接种环、酒精灯、⾹柏油、⼆甲苯、擦镜纸、吸⽔纸等；4.染料：美兰染⾊液、草酸铵结晶紫染⾊液，⾰兰⽒碘液，95%⼄醇，0.5%⽯炭酸复红染⾊液。【操作步骤】(⼀)载玻⽚处理

载玻⽚应清晰透明，清洁⽽⽆油渍，滴上⽔后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列⽅法处理。1．滴上95%酒精2-3滴，⽤清洁纱布擦拭，然后以钟摆速度通过酒精灯焰3-4次。

2．若上法仍未能除去油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，⽤纱布擦净，再在酒精灯⽕焰上轻轻拖过。玻⽚洁净后，⽤玻璃铅笔在预涂材料处的背⾯划⼀个直径1.5cm的圆圈，⽤以标记。（⼆）涂⽚⽅法

1．菌落涂⽚⽅法涂⽚时，左⼿握菌种管，右⼿持接种环（⼜称铂⾦⽿）取1-2环⽣理盐⽔，置于载玻⽚上，然后将接种环在⽕焰上灭菌。待冷后，从菌种管内取少许菌落，置于⽣理盐⽔中混匀，涂成直径1.5cm的涂膜，此膜应既薄⼜均匀为好，待于即成。

2．菌液涂⽚法⽤灭菌接种环蘸取菌液（液体培养物、⾎清、乳汁、组织渗出液等）1-2接种环，均匀涂抹在载玻⽚上，使成直径为1.5cm左右圆形或椭圆形涂膜，⾃然⼲燥后备⽤。

3．⾎液涂⽚⽅法先取⼀张⼲净⽆油垢、边缘整齐的载玻⽚，其⼀端蘸取少许⾎液，以450⾓放在另⼀张⼲净⽆油垢的载玻⽚⼀端，从这端向另⼀端推成薄⽽均匀的⾎膜，待⼲后备⽤。

4．组织涂⽚⽅法先⽤镊⼦夹持组织局部，然后以灭菌剪⼑剪取⼀⼩块，夹出后以其新鲜切⾯在载玻⽚上压印或涂成⼀薄层。(三)⼲燥

涂⽚最好在室温中⾃然⼲燥。必要时，可将标本⾯向上，在离酒精灯⽕焰远处烘⼲，切勿紧靠⽕焰，以免标本糊焦⽽不能检查。(四)固定

有两种固定⽅法：

1.⽕焰固定将已⼲燥好的抹⽚，使涂⾯向上，以钟摆速度通过酒精灯⽕焰4次，使固定后的标本触及⽪肤时，稍感烧烫为度。放置冷却后，进⾏染⾊。

2.化学固定⾎液、组织脏器等抹⽚做姬姆萨⽒染⾊或单染⾊时，不⽤⽕焰固定⽽⽤甲醇固定。可将⼰⼲燥的抹⽚浸⼊甲醇中2-3min，取出晾⼲；或者在抹⽚上滴加数滴甲醇使其作⽤2-3min后，⾃然挥发⼲燥。抹⽚做瑞特⽒染⾊时则不必做特别固定，染⾊液中含有的甲醇可达到固定⽬的。(五)染⾊⽅法

1.单染⾊法只应⽤⼀种染料进⾏染⾊的⽅法，如美蓝染⾊法。

美蓝染⾊法：在已⼲燥、固定好的抹⽚上，滴加适量的(⾜够覆盖抹⽚点即可)美蓝染⾊液，经1-2min，⽔洗，沥去多余的⽔分，吸⼲或烘⼲(不能太热)，然后镜检。2.复染⾊法应⽤两种或两种以上的染料或再加助染剂进⾏染⾊的⽅法。染⾊时，有些是将染料分别先后使⽤，有些则同时混合使⽤。染⾊后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分，可以呈现不同颜⾊，有鉴别细菌的作⽤，⼜可称为鉴别染⾊。如⾰兰⽒染⾊法、抗酸染⾊法、瑞特⽒染⾊法和姬姆萨⽒染⾊法等。(1)⾰兰⽒染⾊法

①在已⼲燥、固定好的抹⽚上，滴加草酸铵结晶紫染⾊液，经1-2min，⽔洗。②加⾰兰⽒碘液于抹⽚上媒染，1-3min，⽔洗。③加95%酒精于抹⽚上脱⾊，约30s⾄1min，⽔洗。④加10倍稀释⽯炭酸复红液复染1-2min，⽔洗。

⑤吸⼲或烘⼲，镜检。⾰兰⽒阳性细菌呈蓝紫⾊，⾰兰⽒阴性细菌呈红⾊。作业名词解释⽆菌细胞壁 L型细菌

1.⾰兰⽒染⾊法涂⽚时为何要涂的薄⽽均匀，脱⾊程度要控制得当？2.叙述⾰兰⽒染⾊的原理及⽅法。3. 简述细菌抹⽚的制备过程及注意事项。实验三 培养基的制备【⽬的要求】

(1)掌握⼀般培养基制备的原则和要求。(2)熟悉⼀般营养⾁汤和普通培养基制备的过程。(3)了解⾼压蒸汽灭菌的基本原理及应⽤范围；(4)掌握⾼压蒸汽灭菌器的使⽤⽅法及注意事项。【原理】

培养基是按照微⽣物⽣长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，⽤⼈⼯⽅法配制⽽成的⼀种基质。它包括碳源、氮源、能源、⽣长因⼦、⽆机盐和⽔六类营养要

素。由于不同微⽣物细胞组成不同，因⽽所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微⽣物，必须根据其需要，配制合适的培养基。【器材及试剂】

1.药品：琼脂，1N NaOH 溶液，1N HCl 溶液，⽜⾁膏，蛋⽩胨，氯化钠；

2.材料：具刻度1000ml 塘瓷盅，托盘天平，10×200mm 试管，量筒，⼩烧杯，玻璃棒，⾻匙，pH 试纸，分装漏⽃，纱布，棉花，报纸，棉绳，标签，蒸馏⽔，⾼压锅，电炉。【操作步骤】(⼀)

⼀般培养基的制备过程

（⼆）营养⾁汤及普通琼脂培养基的制备

1.准确称量⽜⾁膏1g ，NaCl 0.5g ，蛋⽩胨1g ，倒于瓷缸中，加适量（约100ml ）蒸馏⽔，加热煮沸(边加热边搅拌)；2.待充分溶解后，定容⾄100ml ，从中取5ml 放⼊试管中，先⽤1/10 mol/L NaCl 调

PH 值⾄7.2-7.6，计算出所⽤的1/10 mol/L NaCl 的量，并换算出需⽤1 mol/L NaCl 的量，并对剩余的95ml 培养基调PH 值7.2-7.6；

3.分装3管每管3ml 营养⾁汤培养基，将所剩余的营养⾁汤培养基按2%加⼊琼脂，加热煮沸（边加热边搅拌）后分装3管每管4ml 普通琼脂培养基，最后将所剩余的培养基倒⼊三⾓瓶中；

4.包裹，⾼压灭菌后制备琼脂斜⾯和普通琼脂平板；5.⽆菌检验合格后，备⽤。作业

⼀．相关名词解释

培养基灭菌碳源氮源⽣长因⼦消毒固体培养基半固体培养基选择培养基鉴别培养基加富培养基⼆．问答题

1.制备培养基的⼀般过程是什么？2.在制备培养基时要注意些什么问题？3.灭菌在微⽣物学实验操作中有何重要意义？4.叙述⾼压灭菌器的使⽤⽅法及注意事项。实验四细菌及真菌分离培养及移植【⽬的要求】

1.学习、掌握细菌分离培养的基本要领和技术；2.掌握钓菌、纯培养及移植技术；3.掌握厌氧菌培养的原理及其⽅法；4.熟悉真菌的⼩培养⽅法。【原理】

从混杂的细菌群体中获得只含有⼀种或某⼀株细菌的过程称为细菌的分离与纯培养。平板划线法是最常⽤的⽅法之⼀，通过沾有样本的接种环在平板上划线，将样本“稀释”，培养后使之形成单个菌落，从⽽达到分离的⽬的。【器材及试剂】

1.器材酒精灯、接种环、恒温箱、记号笔；2.培养基营养⾁汤、普通琼脂斜⾯、普通琼脂平板；

3.菌种枯草杆菌、绿脓杆菌及⼤肠杆菌、⾦黄⾊葡萄球菌、炭疽芽孢杆菌混合菌菌种。

【操作步骤】⼀、平板划线分离法

1 连续划线法2 分区划线法3 划线分离⽰意图

1.连续划线法以⽆菌操作⽤接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘⼀处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开⽫盖的缝隙伸⼊平板，在平板边缘空⽩处接触⼀下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上⾃左向右轻轻划线。划线时平板⾯与接种环⾯成30-40O⾓，以⼿腕⼒量在平板表⾯轻巧滑动划线。接种环不要嵌⼊培养基内划破培养基，线条要平⾏密集，充分利⽤平板表⾯积，注意勿使前后两条线重叠。划线完毕，关上⽫盖。灼烧接种环，待冷却后放置于接种架上。培养⽫倒置于适宜的恒温箱内培养。培养后，在划线平板上观察沿划线出的菌落形态，涂⽚镜检为纯种后再接种斜⾯。2.分区划线法(四分区划线法) 取菌、接种、培养⽅法与“连续划线法”相似。

分区划线法划线分离时平板分4个区， 故⼜称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线⾯积应最⼤。为防⽌第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平⾏，这样区与区间线条夹⾓最好在保持1200左右。先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平⾏线，取出接种环，左⼿关上⽫盖，将平板转动60-700。灼烧接种环，待在平板边缘上冷却后，再按以上⽅法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区做第2次平⾏划线。第2次划线完毕，同时再把平⽫转动60-700，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上⽫盖，倒置于37℃恒温箱中培养24h 后，在划线区观察单菌落。⼆、细菌的钓菌、纯培养和移植

1.接种环移植法 两试管斜⾯移植时，左⼿斜持菌种管和新鲜空⽩琼脂斜⾯各⼀管，使管⼝互相并齐，稍上斜，管底握于⼿中，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出(图实4-15)。右⼿⾷指和拇指执接种环，烧灼接种环，以右⼿⼩指扭开第1管的棉塞，⽆名指扭开第2管的棉塞。棉塞头向掌⼼内，将试管⼝通过酒精灯⽕焰灭菌，待冷却后将接种环插⼊菌种管中，钓取细菌少许取出接种环⽴即接种在新鲜空⽩琼脂斜⾯上，不要碰及管壁，直达斜⾯底部。从斜⾯底部开始划由曲线或直线，向上⾄斜⾯顶端为⽌，管⼝通过⽕焰灭菌后，塞好棉塞。接种完毕，将接种环烧灼灭菌后放好。⽤蜡笔在试管上标明细菌名称和接种⽇期，置37℃温箱中培养。斜⾯接种⽆菌操作过程如图4所⽰。三、穿刺培养

明胶穿刺和琼脂柱穿刺⽅法基本上与纯培养接种相同，不同的是⽤接种针挑取菌落，垂直插⼊培养基中。要从培养基表⾯的中部⼀直刺⼊管底，然后按原⽅向退出即可。

作业

⼀． 名词解释 真菌 菌落 菌苔 抑菌作⽤ 杀菌作⽤⼆． 问答题

1. 在细菌的分离纯化及移植中有哪些注意事项？2. 什么叫纯培养？

3. 常见的细菌分离培养的⽅法有哪些，简述其操作过程？图实4-15 斜⾯接种时试管的拿法图4 斜⾯接种⽆菌操作过程

实验五细菌的分离培养及培养性状的观察

【⽬的要求】

1.掌握细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。2.了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。【原理】

将细菌经接种于培养基上,会出现典型的培养特征,所谓培养特征是指微⽣物在培养基上所表现的群体形态和⽣长情况。细菌培养特征的常规检验包括平⽫培养基上的菌落特征；斜⾯培养基上的菌苔特征；液体培养时的⽣长特征。菌落是指个体微⽣物在固体培养基上⽣长繁殖成的⾁眼可见的群落。菌落连成⼀⽚形成菌苔。在⼀定培养条件下，不同的微⽣物形成的菌落其性状是不相同的，它是鉴别各种微⽣物的依据之⼀。【器材及试剂】1.器材放⼤镜；

2.培养基枯草芽孢杆菌、绿脓杆菌及混合菌分别在营养⾁汤、普通琼脂斜⾯、普通琼脂平板培养性状；3.标本葡萄球菌、链球菌、沙门⽒菌、酵母菌、青霉、⽑霉等多种霉菌等制备保存的各培养性状的标本。【操作步骤】

（⼀）细菌在固体培养基上的⽣长表现

1.琼脂平⽫上的⽣长表现细菌于固体培养基表⾯⽣长繁殖，形成单个⾁眼可见的细菌集落群体，称为菌落。各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在⼀定程度上鉴别某种细菌。如葡萄球菌在琼脂平⽫上，由于产⽣⾊素的不同，形成各种颜⾊的圆形⽽突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平⼲燥、边缘不整齐的⽕焰状菌落，⽤放⼤镜观察时，呈卷发样构造；肠道杆菌属的细菌，形成圆形、湿润、粘稠、扁平、⼤⼩不等的菌落；巴⽒杆菌和猪丹毒杆菌，形成细⼩露珠状菌落。观察菌落的⽅法除⾁眼外，还可⽤放⼤镜，必要时也可⽤低倍显微镜进⾏检查。观察的主要内容有(图1、2)：

(1)⼤⼩ 菌落的⼤⼩,规定⽤毫⽶(mm)表⽰，⼀般不⾜1mm 者为露滴状菌落；1-2mm 者为⼩菌落；2-4mm 者为中等⼤菌落；4-6mm 或更⼤者称为⼤菌落或巨⼤菌落。(2)形状 菌落的外形有圆形、不规则形、根⾜形、葡萄叶形。

(3)边缘 菌落边缘有整齐、锯齿状、⽹状、树叶状、⾍蚀状、放射状等。

(4)表⾯性状 观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、漩涡状、荷包蛋状，甚⾄有⼦菌落等。(5)隆起度 表⾯有隆起、轻度隆起、隆起，也有陷凹或堤状者。

(6)颜⾊及透明度 菌落有⽆⾊、灰⽩⾊，有的能产⽣各种⾊素；菌落是否有光泽；其透明度可分为透明、半透明及⽯透明。(7)硬度 粘液状、膜状、⼲燥或湿润等。

(8)溶⾎情况 若是鲜⾎琼脂平⽫，应看其是否溶⾎、溶⾎情况怎样。

2．琼脂斜⾯上⽣长表现(图3) 将各种细菌分别以接种针直线接种于琼脂斜⾯上 (⾃底部向上划⼀直线)，培养后观察其⽣长表现。3．琼脂柱穿刺培养中的⽣长表现 将各种细菌分别以接种针穿刺接种于琼脂柱中，培养后观察其⽣长表现(图4)。图2 菌落的隆起度1.扁平状2.低隆起3.隆起4.台状5.脐状6.纽扣状7.乳头状8.褶皱凸⾯

图1 菌落的形状、边缘和表⾯构造1.圆形、边缘整齐，表⾯光滑2.圆形、叶状边缘，表⾯有放射状皱褶3.圆形、边缘整齐，表⾯有同⼼圆4.圆形、锯齿状边缘，表⾯较不光滑5.不规则形、波浪状边缘，表⾯有不规则皱纹6.圆形、边缘残缺不全，表⾯呈颗粒状7.⽑状8.根状

(⼆)细菌在明胶柱穿刺培养中的⽣长表现

取⼤肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作⽤各不相同(图5)。

(三)细菌在液体培养基中的⽣长表现(图6)

将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、⼤肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于⾁汤中，培养后观察其⽣长情况，主要观察其浑浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜⾊等。1.浑浊度 细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状不同，有均匀浑浊、轻度混浊或培养基保持透明(表⾯有菌膜或底部有沉淀物)。2.沉淀物 细菌在液体培养基中所形成的沉淀有：颗粒状沉淀、粘稠沉淀、絮状沉淀、⼩块状沉淀。另外还有不⽣成沉淀的细菌。3.表⾯性状 主要是观察细菌在液体培养基中培养后有元菌膜或菌环形成等。

4.颜⾊ 有的细菌在⽣长繁殖过程中能产⽣⾊素，⾊素能溶于⽔，所以细菌在液体培养基中培养后，所产⽣的⾊素会使培养基的颜⾊发⽣变化。

作业

1.什么叫菌落？什么叫菌苔？

2.细菌在固体培养基上的培养特性包括哪些⽅⾯？3．描述⼤肠杆菌、炭疽杆菌、葡萄球菌的菌落特点。图5 细菌明胶柱穿刺培养⽣长表现1.不液化2.⽕⼭⼝状3.芜菁状4.

漏⽃状 5.囊状 6.层状 图6 细菌在⾁汤中⽣长表现 1. 絮状 2. 环状 3. 厚膜状 4. 均匀状 图4 琼脂柱穿刺培养的菌落表现 1.线状 2.棘状 3.珠状 4.绒⽑状 5.根状 图3 琼脂斜⾯直线接种培养的菌落表现1.线状2.棘状3.珠状4.扩散状5.根状

实验六细菌的⽣理⽣化试验

【⽬的要求】

1．掌握细菌鉴定中常⽤⽣理⽣化试验的原理和试验⽅法。2．了解⽣理⽣化实验结果对细菌鉴别的重要意义。【实验原理】1.糖发酵试验

糖发酵试验是常⽤的鉴别微⽣物的⽣化反应，在肠道细菌鉴定中尤为重要，绝⼤多数细菌都能利⽤糖类作为碳源，但是它们在分解糖的能⼒上有很⼤的差异：有些细菌能分解某种糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和⽓体（如氢、甲烷、⼆氧化碳等）；有些细菌只产酸不产⽓。例如⼤肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产⽓；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产⽓，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产⽓，不能分解乳糖。酸的产⽣可利⽤指⽰剂来断定。在配制培养基时预先加⼊溴甲酚紫[pH5.2（黄⾊）-6.8（紫⾊）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫⾊变为黄⾊。⽓体的产⽣可由发酵管中倒置的德汉⽒⼩管中有⽆⽓泡来证明。2.M.R试验

某些细菌(如⼤肠杆菌、志贺⽒菌、产⽓杆菌等)在糖代谢过程中，分解葡萄糖产⽣丙酮酸，丙酮酸再进⼀步分解为⼄酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则使培养基中的pH值愈下降，当降⾄pH4.5以下时，指⽰剂甲基红则呈红⾊，即为阳性反应。如pH值⾼于4.5时则指⽰剂呈黄⾊，即为阳性反应。因此,在培养物中加⼊1滴甲基红试剂，⽴即可以观察到上述结果之⼀。3.⼄酰甲基甲醇试验(V-P反应)

某些细菌（如产⽓杆菌）在糖代谢过程中，利⽤葡萄糖，产⽣丙酮酸，再将丙酮酸缩合。脱羧⽽成为中性的⼄酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下能被空⽓中的氧⽓氧化⽣成⼆⼄酰。⼆⼄酰能与培养基中含胍基的化合物发⽣反应，⽴刻或于数分钟内⽣成红⾊化合物；即为V-P试验阳性。如果培养基含胍基太少，可加⼊肌酸或肌酐酸等含胍基化合物。当加⼊α-萘酚时也可使反应加速进⾏。4.靛基质试验（吲哚试验）

某些微⽣物如⼤肠杆菌、变形杆菌、霍乱弧菌等在代谢过程中产⽣⾊氨酸酶，能分解培养基中的⾊氨酸，产⽣靛基质(indolo)。靛基质与对⼆甲氨苯甲醛作⽤时，形成玫瑰靛基质⽽呈红⾊。5.三糖铁琼脂试验

该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的⽐例为10:10:1，只能利⽤葡萄糖的细菌，葡萄糖被分解产酸可使斜⾯先变黄，但因量少，⽣成的少量酸，因接触空⽓⽽氧化，加之细菌利⽤培养基中含氮物质，⽣成碱性产物，故使斜⾯后来⼜变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄⾊。⽽发酵乳糖的细菌(E.coli)，则产⽣⼤量的酸，使整个培养基呈现黄⾊。如培养基接种后产⽣⿊⾊

沉淀，是因为某些细菌能分解含硫氨基酸，⽣成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，⽣成⿊⾊的硫化亚铁沉淀。【器材及试剂】

1.器材酒精灯、接种环、恒温箱、记号笔；

2.培养基葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、⽢露糖等糖发酵管；蛋⽩胨⽔；葡萄糖蛋⽩胨⽔、三糖铁培养基等；3.菌种⼤肠杆菌、沙门⽒菌菌种。【操作步骤】

⼀、糖类分解（发酵）试验1．试验⽅法

（1）琼脂斜⾯培养物⽤接种针挑取少量菌穿刺接种于糖发酵管深部（勿穿到管底！）。（2）将接种管标记清楚放⼊37℃孵育，24-48h观察结果。2．结果判定

⽆变化 - 培养基不变⾊产酸 + 培养基变黄

产酸产⽓⊕培养基变黄并有⽓泡⼆、吲哚（靛基质）试验1．试验⽅法

①以接种环将待检菌新鲜斜⾯培养物接种于蛋⽩胨⽔溶液中，置37℃培养24-48h（可延长4-5d）。②于培养液中加⼊戊醇或⼆甲苯2-3m1，摇匀，静置⽚刻后，沿试管壁加⼊欧⽴希⽒或Kovacs试剂2m1。③在戊醇或⼆甲苯下⾯的液体变为红⾊者为阳性反应。三、甲基红（M.R）试验／维倍（V-P）⼆⽒试验1．试验⽅法

（1）M.R试验接种细菌于培养基中，在37℃培养24-48h后。于培养物中加⼊⼏滴试剂，变红⾊者为阳性反应，桔红到黄⾊则为阴性。

（2）V-P试验①取出培养24hV.P试验⽤葡萄糖蛋⽩胨溶液lm1。②将6％⼩萘酚酒精溶液0.5ml加⼊，随后加16％KOH 0.5m1，轻摇，然后让其静置10-15min。③在15min内出现红⾊者则为阳性，1h后可出现假阳性。④或者加等量的硫酸铜试剂于培养物中混合，静置，强阳性者约5min后可产⽣粉红⾊反应。四、三糖铁琼脂试验

以接种针挑取待试菌可疑菌落或者纯培养物穿刺接种并涂布于斜⾯，置36±1℃，18-24h观察结果。作业

⼀名词解释吲哚实验

⼆问答题 1. 细菌的糖发酵实验的检测指标有哪些，代表什么含义？

2. 简述三糖铁琼脂实验的单糖的种类、⽐例及其主要的实验现象？试验七细菌的药敏试验[⽬的要求]

1.掌握纸⽚扩散法、稀释法细菌药敏试验的原理、操作⽅法、结果判读及临床意义。2.熟悉纸⽚扩散法、稀释法的质量控制⽴法。⼀、纸⽚扩散法(⼀)原理

含有定量抗菌药物的纸⽚贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸⽚中所含的药物吸收琼脂中的⽔分溶解后便不断地向纸⽚周围扩散，形成递减的梯度浓度。在纸⽚周围抑菌浓度范围内的细菌⽣长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的⼤⼩反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最⼩抑菌浓度(minima1 idIibitoryconcentration,MIC)呈负相关，即抑菌圈愈⼤，MIC 愈⼩。(⼆)实验材料

1.抗菌素纸⽚可购⽤或按下列⽅法制备。

(1)将质量较好的滤纸⽤打孔机打成直径6mm的圆⽚，每100⽚放⼊⼀⼩瓶中，⾼压灭菌 (1.02kg30min)后在60℃条件下烘⼲。

(2)⽤⽆菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml,(含药量按表实17-1所列计算，例如，庆⼤霉素10µg/⽚×100⽚=1000µg/m l，加⼊100⽚纸⽚中，置冰箱内浸泡1-2h，如⽴即试验可不烘⼲，若保存备⽤可，⽤下列⼀种⽅法烘⼲(⼲燥的抗菌素纸⽚可保存6个⽉)。

培养⽫烘⼲法将浸有抗菌药液的纸⽚摊平在培养⽫中，于37℃温箱内保持2-3h即可⼲燥，或放在⽆菌室内过夜⼲燥。真空抽⼲法将放有抗菌药物纸⽚的试管，置⼲燥器内，⽤真空抽⽓机抽⼲。

将制好的各种药物纸⽚装⼊⽆菌⼩瓶中，置冰箱、内保存备⽤。并⽤标准敏感菌株作敏感性试验，记录抑菌圈的直径，若抑菌圈⽐标准敏感菌株的原来缩⼩，则表明该抗菌药物已失效，不能再⽤。抗菌药物纸⽚含药量抑菌圈直径(mm)耐药(R) 中介度(I) 敏感(S)

阿⽶卡星(AMO) 30µg≤14 15~16 ≥17庆⼤霉素(GEN) 10µg≤12 13~14 ≥15青霉素〈PEN) 10units ≤28 —≥29苯唑西林(OXA) 1µg≤10 11~12 ≥13氨苄西林(AMP) 10µg≤13 14~16 ≥17哌拉西林(PIP) 100µg≤17 —≥18头孢唑林(FZN) 30µg≤14 15~17 ≥18环丙沙星(CIP) 5µg≤15 16~20 ≥21万古霉素(VAN) 30µg——≥15克林霉素(CLI) 2µg≤14 15~20 ≥21

复⽅新诺明(SXT) 1.25/23.75µg≤10 11~15 ≥16

注：敏感(S) 表⽰被测菌株感染，可⽤该抗菌药的常⽤剂量治愈。耐药(R) 表⽰被测菌株感染，⽤该抗菌药的常⽤剂量治疗，预期元效。

中介度(I) 出现此结果，有可能因试验技术因素引起的误差，不应报告，必要时⽤稀释法重做。2.培养基Muelk-Hinton(M-H)琼脂

3.试剂及菌种⽆菌⽣理盐⽔、0.5麦⽒标准⽐浊管(McFarland stanard，相当于1.5× 108cfu/ml)。菌种：⾦黄⾊葡萄球菌ATCC 25923、⼤肠埃希⽒菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌 ATCC 27853。

(三)实验⽅法

1.⽤培养16~24h⾎平板上的菌落接种于⽣理盐⽔管中，校正浓度⾄0.5麦⽒标准(相当于 1.5×108cfu/ml) 。

2.⽤⽆菌棉拭于蘸取少量的菌液，在M-H琼脂表⾯均匀涂抹接种3次，每次旋转平板60℃, 最后沿平板内缘涂抹⼀周。

3.将接种的平板置室温下⼲燥3~5min后，⽤⽆菌镊图实17-1药物抑菌试验⽰意图⼦取含药纸⽚紧贴于琼脂表⾯，各纸⽚中⼼相距应⼤于24mm，纸⽚距平板内缘应⼤于15mm，置35℃培养16~18h后观察结果。药物的选择参照表实17-2。表实 17-2 药敏纸⽚的选择待测菌药物

⾦黄⾊葡萄球菌 ATCC 25923 PEN、OXA、CLI、VAN、CIP、GEN、SXT⼤肠埃希菌 ATCC 25922 AMP、FZN、GEN、AMS、FRX、CIP、IMP铜绿假单胞菌 ATCC 27853 CAZ、GEN、PIP、AMK、ATM、CIP、IMP

(四)结果判定根据抗菌药纸⽚周围抑菌区的⼤⼩，测定其药物的敏感性。⽤毫⽶尺测量抑菌圈直径，参照表实17-1的标准判读结果。按敏感(S)或耐药(R)报告。(五)质量控制标准菌株的抑菌圈应在表实17-3所⽰的预期范围内。如果超出该范围，应视为失控⽽不发报告，及时查找原因，予以纠正。表实17-3 质控标准菌株的抑菌圈预期值范围抗菌药物纸⽚含药量抑菌圈直径(mm)⾦黄⾊葡萄球菌ATCC 25923⼤肠埃希菌ATCC 25922铜绿假单胞菌ATCC 27853

阿⽶卡星(AMO) 30µg19~26 20~26 18~26 庆⼤霉素(GEN) 10µg19~26 19~27 16~21 青霉素〈PEN) 10units —26~37 —苯唑西林(OXA) 1µg—18~24 —氨苄西林(AMP) 10µg16~22 27~35 —

哌拉西林(PIP) 100µg24~30 —25~33 头孢唑林(FZN) 30µg29~35 23~29 —

亚胺配南(IMP) 10µg26~32 —20~28 环丙沙星(CIP) 5µg30~40 22~30 25~33 万古霉素(VAN) 30µg—17~21 —克林霉素(CLI) 2µg—24~30 —

复⽅新诺明(SXT) 1.25/23.75µg24~32 24~32 —作业：1.名词解释药敏实验；最⼩抑菌浓度；半数致死量；抑菌圈2.问答题

纸⽚扩散法药敏实验的原理、操作结果⽚段及其有何临床意义？实验⼋⼩动物试验法【实验⽬的】

1．学习并掌握实验动物的接种⽅法。2．学习并掌握实验动物的剖检⽅法。

3.掌握病料采集、包装和运送的基本原则和操作技术。【实验⽤途】

在微⽣物实验和研究⼯作中，动物实验是常⽤的技术之⼀，其主要⽤途有以下⼏⽅⾯：

1．进⾏病原体的分离和鉴定有些直接分离培养有困难的病原菌或需鉴定的细菌，通过易感动物体就可达到⽬的。如从⼦宫分泌物中分离布鲁⽒菌，可⽤豚⿏接种法。2．确定病原体的致病⼒有些细菌在形态、⽣物学特性等⽅⾯性状相似，仅在致病性上不同，可利⽤动物试验鉴别。3．恢复或增强细菌的毒⼒多数病原菌长期通过⼈⼯传代保存后，其毒⼒减弱，须通过易感动物恢复或增强其致病⼒。4．测定某些细菌的外毒素如产⽓荚膜梭菌的毒素测定。5．制备疫苗或诊断⽤抗原如兔化猪瘟疫苗。

6．制备作诊断或治疗⽤的免疫⾎清如作鉴定⽤的沙门⽒菌诊断⾎清。7．⽤于检验药物的治疗效果及毒性等（⼀）实验动物接种法

1．接种材料细菌培养物（⾁汤培养物或细菌悬液）、尿液、脑脊液、⾎液、分泌物、脏器组织悬液等。

2．实验动物常⽤的动物有家兔、豚⿏（也称海豚、荷兰猪、天竺⿏）、⼤⽩⿏、⼩⽩⿏及绵⽺等。所需实验动物以⾃⾏繁殖为最⽅便可靠，如必须向外购买、要选择健康⽆病未做过任何试验的动物。3．实验动物常⽤的接种⽅法

（1）⽪肤划痕接种实验动物多⽤家兔，⽤剪⽑剪剪去胁腹⽑，必要时再⽤剃⼑或脱⽑剂脱去被⽑，以75％酒精消毒，待⼲，⽤⽆菌⼩⼑在⽪肤上划成⼏条平⾏线。划痕⼝可略见出⾎，然后⽤⼑将接种材料涂在划痕⼝上。（2）⽪下接种

家兔⽪下接种由助⼿把家兔伏卧或仰卧保定，于其背侧或腹侧⽪下结缔组织疏松部分剪⽑消毒，术者右⼿持注射器，以左⼿拇指，⾷指和中指捏起⽪肤使成⼀个三⾓形皱褶，或⽤镊⼦夹起⽪肤、于其底部进针，感到针头可随意拨动即表⽰插⼊⽪下。当推⼊注射物时感到流利畅通也表⽰在⽪下，拨出注射针头时⽤消毒棉球按针孔并稍加按摩。

豚⿏⽪下接种保定和术式同家兔。

⼩⽩⿏⽪下接种⽆须助⼿帮助保定，术者在做好接种准备后，先⽤右⼿抓

住⿏尾，令其前⽖抓住饲养罐的铁丝盖，然后⽤左⼿的拇指及⾷指捏住颈部⽪肤，并翻转左⼿使⼩⿏腹部朝上，将其尾巴挟在左⼿掌与⼩⼿指之间，右⼿消毒术部，把持注射器、以针头稍微挑起⽪肤插⼊⽪下，注⼊时见有⽔泡微微⿎起即表⽰注⼊⽪下。拔出针头后，同家兔⽪下注射时⼀样处理。（3）⽪内接种

作家兔、豚⿏及⼩⽩⿏⽪内接种时，均需助⼿保定动物，其保定⽅法同⽪下接种。接种时术者以左⼿拇指及⾷指夹起⽪肤，右⼿持注射器、⽤细针头插⼊拇指及⾷指之间的⽪肤内针头插⼊不宜过深，同时插⼊⾓度要⼩，注⼊时感到有阻⼒且注射完毕后⽪肤上有⼩硬疱即为注⼊⽪内。⽪内接种要慢，以防使⽪肤胀裂或⾃针孔流出注射物⽽散播传染。（4）肌⾁接种

肌⾁注射部位在禽类为胸肌，其它动物为后肢内股部。术者消毒后，将针头刺⼊肌⾁内注射感染材料。（5）腹腔内接种

在家兔、豚⿏、⼩⽩⿏作腹腔接种，宜采⽤仰卧保定、接种时稍抬⾼后躯，使其内脏倾向前腔，在腹后侧⾯插⼊针头，先刺⼊⽪下，后进⼊腹腔、注射时应⽆阻⼒，⽪肤也隆起。（6）静脉注射

家兔的静脉注射将家兔纳⼊保定器内或由助⼿把握住它的前、后躯保定、选⼀侧⽿边缘静脉，先⽤75％酒精涂擦兔⽿或以⼿指轻弹⽿朵，使静脉扩张。注射时，⽤左⼿拇指和⾷指拉紧兔⽿，右⼿持注射器，使针头与静脉平⾏，向⼼脏⽅向刺⼊静脉内，注射时⽆阻⼒且有⾎向前流动表⽰注⼊静脉、缓缓注射感染材料，注射完毕⽤消毒棉球紧压针孔，以免流⾎或注射物溢出。

豚⿏静脉内接种使豚⿏伏卧保定。腹⾯向下，将其后肢剃⽑、⽤75％酒精消毒⽪肤，施以全⾝⿇醉，⽤锐利⼑⽚向后肢内上侧向外下⽅切⼀长约1厘⽶的切⼝，使露出⽪下静脉，⽤最⼩号针头刺⼊静脉内慢慢注⼊感染材料。接种完毕，将切⼝缝合⼀两针。

⼩⽩⿏静脉接种其注射部位为尾侧静脉。选15～20g体重的⼩⽩⿏，注射前将尾部⾎管扩张易于注射。⽤⼀烧杯扣住⼩⽩⿏，露出尾部，最⼩号针头（4号）刺⼊侧尾静脉，缓缓注⼊接种物，注射时⽆阻⼒，⽪肤不变⽩、不隆起，表⽰注⼊到静脉内。（7）脑内接种法

作病毒实验研究时，有时⽤脑内接种法，通常多⽤⼩⽩⿏，特别是乳⿏（1～3⽇龄），注射部位是⽿根连线中点略偏左（或右）处。接种时⽤⼄醚使⼩⽩⿏轻度⿇醉，术部⽤碘酒，酒精棉球消毒，在注射部位⽤最⼩号针头经⽪肤和颅⾻稍向后下刺⼊脑内进⾏注射，先后以棉球压住针孔⽚刻，接种乳⿏时⼀般不⿇醉，不⽤碘酒消毒。家兔和豚⿏脑内接种法基本同⼩⽩⿏，唯其颅⾻稍硬厚，事先⽤短锥钻孔，然后再注射、深度宜浅，以免伤及脑组织。

4．注射量家兔0.2m1，豚⿏0.15m1，⼩⽩⿏0.03m1。凡作脑内注射后⼀⼩时内出现神经症状的动物作废，认为是接种创伤所致。（⼆）实验动物采⾎法

如欲取得清晰透明的⾎清，宜于早晨没有饲喂前抽取⾎液。如采⾎量较多则应在采⾎后，以⽣理盐⽔作静脉（或腹腔内）注射或饮⽤盐⽔以补充⽔份。1．家兔采⾎法

可采⾃其⽿静脉或⼼脏，⽿边缘静脉采⾎⽅法基本与静脉接种相同，不同之处是以针尖向⽿尖反向抽吸其⾎，⼀般可采⾎1～2m1。如采⼤量⾎液，则⽤⼼脏采⾎法。动物左仰卧由助⼿保定，或以绳索将四肢固定，术者在动物左前肢腋下处局部剪⽑及消毒，在胸部⼼脏跳动最明显处下针。⽤⼀⼨半长12号针头，直刺⼼脏，感到针头跳动或有⾎液向针管内流动时，即可抽⾎，⼀次可采⾎15～20m1。

如采其全⾎，可⾃颈动脉放⾎。将动物保定，左颈部剃⽑消毒，动物稍加⿇醉，⽤⼑⽚在颈静脉沟内切⼀长⼝，露出颈动脉并结扎，于近⼼端插⼊⼀玻璃导管，使⾎液⾃⾏流⾄⽆菌容器内，凝后析出⾎清；如利⽤全⾎，可直接流⼊含抗凝剂的瓶内，或含有玻璃珠的三⾓瓶内振荡脱纤防凝。放⾎可达50ml以上。2．豚⿏采⾎法

豚⿏⼀般从⼼脏采⾎。助⼿使动物仰卧保定，术者在动物胸部⼼跳最明显处剪⽑消毒，⽤针头插⼊胸壁稍向右下⽅刺⼊。刺⼊⼼脏则⾎液可⾃⾏流⼊针管，⼀次未刺中⼼脏稍偏时，可将针头稍提起向另⼀⽅向再刺。如多次没有刺中，应换⼀动物，否则有⼼脏出⾎致死亡的可能。3．⼩⽩⿏采⾎法

可将尾部消毒，⽤剪⼑断尾少许，使⾎液溢出，即得⾎液数滴，采⾎后⽤烧烙法⽌⾎。也可⾃⼼脏采⾎，或摘除眼球放⾎。4．绵⽺采⾎法

在微⽣物实验室中绵⽺⾎最常⽤。采⾎时由⼀助⼿半坐骑在⽺背上，两⼿各持其⼀⽿（或⾓）或下颚，因为⽺的习惯好后退，令尾靠住墙根。术者在其颈部上1/3处剪⽑消毒，⼀⼿压在静脉沟下部使静脉努张，右⼿持针头猛⼒刺⼊⽪肤，此时⾎液流⼊注射器或直接流⼊⽆菌容器内，⼀切应⽆菌操作，以获得⽆菌⾎液。5．鸡采⾎法

剪破鸡冠可采⾎数滴供作⾎⽚⽤。少量采⾎可从翅静脉采取，将翅静脉刺破以试管盛之，或⽤注射器采⾎，需⼤量⾎可⽤⼼脏采取：固定家禽使侧卧于桌上，左胸部朝上，从胸⾻脊前端⾄背部下凹处连线的中点垂直刺⼊，约1⼨深即可采得⼼⾎。⼀次可采10～20ml⾎液。（三）病料的采集、包装和运送

1、病料采集、包装、运送的基本原则

（1）要分离病原微⽣物，必须准确采集含菌(病毒)最多的病料。这就必须充分了解各种病原微⽣物在患畜(禽)体内及其分泌物和排泄物中的分布情况。不