微生物限度检查方法适用性验证方案

验证方案组织与实施

微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量治理部门负责组织，质量治理部门有关人员组成验证小组，参与实施。 方案起草

部门/职务 质量治理部QC 方案审核

部门/职务 质量治理部QC经理 方案批准

部门/职务 质量治理部质量总监 批 准 人 目 录

一、 概述

二、 验证目的和风险评估 三、 验证内容 四、方法判定 五、再验证周期 六、参考文献 七、结果评价及结论 1、概述：

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查工程包含需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及操纵菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和操纵菌检查方法的适用性试验，以确认所采纳的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和操纵菌检查。

批 准 日 期 签 名 日 期 签 名 日 期 精品文档

依照中国药典2021版，需氧菌、霉菌和酵母菌及操纵菌均采纳平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估：

验证目的：确认所采纳的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及操纵菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。 风险评估：

工程 未按方案执行 和漂移 试验过程操作不当 3、验证内容： 3.1、培养基来源：

品名 批号 规格 来源 未到达试验标准 正确性 试验失败 潜在失效模式 试验局部工程出现偏差失效影响 直接影响试验结果的 采取措施 严格执行经批准 的试验方案 未严格遵循试验方案规定 确认人： 确认日期： 3.2、检查用培养基配制方法：

培养基名称 胰酪大豆胨琼脂培养基 胰酪大豆胨液体培养基 沙氏葡萄糖液体培养基 沙氏葡萄糖琼脂培养基 . 配制方法 取本品g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 取本品40g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 取本品g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 取本品g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 取本品65.0g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 精品文档 麦康凯琼脂培养基 麦康凯液体培养基 取本品50.0g，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 取本品，加水1000ml，加热溶化，分装，121℃，15分钟灭菌，备用。 确认人： 确认日期： 3.3、使用仪器

名称 数显电热恒温培养数显霉菌培养箱 型号 校验单位 有效期至 确认人: 确认日期： 3.4、验证试验用菌种：

菌种名称 金黄色葡萄球菌 大肠埃希菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉菌 代号 传代代数 来源 确认人： 确认日期： 3.5试验方法：

取供试品10 ml加至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、操纵菌采纳常规法。 3.6菌液的制备：

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金饵，参加胰酪大豆胨液体培养基中置30～ 35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml参加％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至107， 分取各菌悬液1ml注入平皿中，马上倾注胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。

取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，参加沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养24～48h，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml参加％无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10

～7，

～

取菌悬液1ml注入平皿中，马上倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备

两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。

取黑曲霉的新奇培养物接种子沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，参加3-5ml含0.05%聚山梨

.

精品文档

酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。取1ml参加含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至107，取，取菌悬液1ml注入平皿中，马上倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml和1000CFU/ml的菌液备用。

3.7需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验： 供试液制备：

取供试品10 ml，加至100ml→1:10供试液。 实验条件：

需氧菌培养温度：30～35℃ 3～5天 培养箱： 霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃ 5～7天 培养箱：

3.7.3试验方法： .1试验组：

3.7.3.1.1分别取供试液9.9ml，分别铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，混匀后取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

3.7.3.1.2分别取供试液9.9ml，分别白色念珠菌、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml，置30～35℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。另分别取其中1ml注皿, 倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml，置20～25℃或培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

.2菌液对比组：分别取稀释液9.9ml，分别菌液，按试验组操作,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。 .3供试品对比组：取供试液1ml，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。 实验结果 ～2范围内。

比值=试验组菌落数～供试品对比组的菌落数*

对比组菌落数 试验次数：1 供试品批号:

供试品 菌种类型 试验组 菌液组 对比组 比值 ～

.

精品文档 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 检验人： 日期：

复核人： 日期：

试验次数：2 供试品批号:

供试品 菌种类型 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验组 菌液组 对比组 比值 检验人： 日期： 复核人： 日期：

试验次数：3 供试品批号:

供试品 菌种类型 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 白色念珠菌 黑曲霉 试验组 菌液组 对比组 比值 检验人： 日期： 复核人： 日期：

试验次数：1 供试品批号:

.

精品文档 供试品 菌种类型 白色念珠菌 黑曲霉 试验组 菌液组 对比组 比值 检验人： 日期：

复核人： 日期：

试验次数：2 供试品批号:

供试品 菌种类型 白色念珠菌 黑曲霉 试验组 菌液组 对比组 比值 检验人： 日期：

复核人： 日期

试验次数：3 供试品批号:

供试品 菌种类型 白色念珠菌 黑曲霉 试验组 菌液组 对比组 比值 检验人： 日期：

复核人： 日期

3.7.5结论:

检验人： 日期： 复核人： 日期：

操纵菌微生物检测方法适用性试验： .1实验方法：

3.8.1.1试验组：取供试液10ml及不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。试验组应生长良好。

3.8.1.2阴性对比组： 取稀释剂10ml,参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时，阴性对比应无菌生长。

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精品文档

3.8.1.3阳性对比组：取不大于100cfu大肠埃希菌菌液参加胰酪大豆胨液体培养基中，置30～35℃培养18-24小时, 取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24-48小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上30～35℃培养18-72小时。阳性对比组应生长良好。 实验结果：

试验次数：1 供试品批号:

操纵菌 工程 试验组 大肠埃希菌 阳性对比组 阴性对比组 常规法 检验人： 日期：

复核人： 日期：

试验次数：2 供试品批号:

操纵菌 工程 试验组 大肠埃希菌 阳性对比组 阴性对比组 常规法 检验人： 日期：

复核人： 日期：

试验次数：3 供试品批号:

操纵菌 工程 试验组 大肠埃希菌 阳性对比组 阴性对比组 结论：

检验人： 日期： 复核人： 日期：

4. 方法判定：

本品按《中国药典》2021年版〔1105〕、〔1106〕非无菌产品微生物限度检查项下：“微生物计数法〞“操纵菌检测法〞进行试验。

细菌数测定可用 。

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常规法 精品文档

霉菌、酵母菌数测定可用 。 操纵菌 ， 可用 。 5、再验证周期：

当产品的微生物限度检查方法改变、产品组分、工艺改变时，应进行再试验。 6、参考文献： 中国药典2021版 7． 结果评价及结论：

验证标准，该适用性试验方法 接受 。 审核人/日期：

批准人/日期：

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