使用干酪乳杆菌生产发酵乳制品的方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 108882718 A(43)申请公布日 2018.11.23

(21)申请号 201780007143.7(22)申请日 2017.01.23(30)优先权数据

16152207.3 2016.01.21 EP(85)PCT国际申请进入国家阶段日

2018.07.18(86)PCT国际申请的申请数据

PCT/EP2017/051299 2017.01.23(87)PCT国际申请的公布数据

WO2017/125600 EN 2017.07.27(83)生物保藏信息

DSM 252 2014.06.12DSM 253 2014.06.12DSM 22935 2009.09.08DSM 210 2014.06.12DSM 19465 2007.06.27

(71)申请人 科·汉森有限公司

地址 丹麦赫斯霍尔姆

(72)发明人 M·库里克-鲍登　

L·露西安娜·吉梅内斯　

梅特·O·朗格　K·吉尔洛特　P·F·詹森　(74)专利代理机构 北京世峰知识产权代理有限

公司 11713

代理人 康健　王思琪(51)Int.Cl.

A23C 9/123(2006.01)C12R 1/245(2006.01)C12R 1/46(2006.01)A23C 9/152(2006.01)C12R 1/225(2006.01)C12N 1/20(2006.01)C12N 15/00(2006.01)

权利要求书2页 说明书11页PCT/RO/134表4页 附图2页

()发明名称

使用干酪乳杆菌生产发酵乳制品的方法(57)摘要

本发明涉及一种生产发酵乳制品的方法，包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述细菌包括干酪乳杆菌和至少一种除干酪乳杆菌以外的菌种的其他乳酸菌菌株，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷但能够代谢乳中存在的除乳糖以外的一种或几种碳水化合物。

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1.生产发酵乳制品的方法，包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述乳酸菌包含干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的至少一种其他菌株，所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷但是能够代谢乳中存在的除乳糖之外的一种或几种碳水化合物。

2.根据权利要求1所述的生产发酵乳制品的方法，其中，具有乳糖代谢缺陷的所述乳酸菌的至少一种其他菌株能够代谢选自由蔗糖、半乳糖和葡萄糖组成的组的一种或多种碳水化合物，并且其中所述碳水化合物在发酵前加入到乳中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述干酪乳杆菌菌株选自由保藏为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431和保藏为DSM19465的干酪乳杆菌CHCC2115所组成的组。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中，所述其他菌株选自以下组成的组：(a)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株，所述菌株为：(i)以保藏编号DSM 252于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心的菌株；

(ii)或衍生自DSM 252的菌株，其中所衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；(b)嗜热链球菌菌株，所述菌株为：(i)以保藏编号DSM 253于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心的菌株；

(ii)或衍生自DSM 253的菌株，其中所衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；

(c)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)菌株，所述菌株为：

(i)以保藏编号DSM 210于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心的菌株；

(ii)或衍生自DSM 210的菌株，其中所衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力。

5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中具有乳糖代谢缺陷的所述其他菌株是嗜热链球菌的蛋白水解菌株，其中蛋白水解菌株的特征在于：

(a)存在活性细胞壁蛋白酶；和/或(b)与对照样品相比，在含有荧光标记的酪蛋白的培养基中所述菌株生长6小时引起荧光增加。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的生产发酵乳制品的方法，其中，所述方法产生浓度为1×108至5×109CFU/g，优选1×109至5×109CFU/g，更优选1×109至3×109CFU/g的干酪乳杆菌。

7.干酪乳杆菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的至少一种其他菌株在生产发酵乳制品中的用途，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷但能够代谢乳中存在的除乳糖以外的一种或几种碳水化合物。

8.根据权利要求7所述的干酪乳杆菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的用途，其中所述用途还包括向所述乳中添加蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖。

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9.根据权利要求7或8所述的干酪乳杆菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的用途，其中具有乳糖代谢缺陷的所述乳酸菌的至少一种其他菌株为选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的菌种的细菌。

10.包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌的组合物，其中所述乳酸菌的至少一种其他菌株具有乳糖代谢缺陷。

11.根据权利要求10所述的包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌的组合物，其中至少一种其他细菌为选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的菌种的细菌。

12.包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌的食品或饲料产品，其中所述乳酸菌的至少一种其他菌株具有乳糖代谢缺陷。

13.根据权利要求12所述的食品或饲料产品，其中所述乳酸菌的至少一种其他菌株为选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的菌种的细菌。

14.根据权利要求12或13所述的食品或饲料产品，包含浓度为1×108CFU/g至5×109CFU/g，优选1×109CFU/g至5×109CFU/g，更优选1×109CFU/g至3×109CFU/g的干酪乳杆菌。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的食品或饲料产品，其中所述食品或饲料产品是发酵乳饮料。

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使用干酪乳杆菌生产发酵乳制品的方法

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发明领域

[0001]本发明涉及一种生产发酵乳制品的方法，该方法包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述乳酸菌包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和至少一种除干酪乳杆菌以外的菌种的其他乳酸菌菌株，例如嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)。背景技术

[0002]培养的益生菌饮料，也称为益生菌注射剂，通常含有干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。在本申请中，术语干酪乳杆菌用于指菌种干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌的细菌。这些益生菌饮料在世界许多地方包括中国、韩国和远东地区以及墨西哥都非常受欢迎。在世界其他地区，这些饮料的受欢迎程度也在增加。[0003]该产品通常通过使用单一干酪乳杆菌菌株发酵乳来获得。干酪乳杆菌在乳中的生长缓慢，因此发酵缓慢。发酵通常需要50至96小时。作为生长缓慢的进一步结果，发酵通常需要特定措施以防止污染和与其他乳酸菌的交叉污染。[0004]使干酪乳杆菌菌株生长直至达到pH 4.2至3.7。在该阶段，加工发酵乳并任选地用糖浆以发酵乳：糖浆的比例为30:60至75:25进行稀释。最终产品通常以一份65-100ml的份量包装。最终稀释的发酵乳饮料中干酪乳杆菌的靶细胞计数高于1×10 8CFU/ml。[0005]为了增加酸化并因此缩短生产时间，干酪乳杆菌与其他乳酸菌菌种(包括嗜热链球菌，例如使用FD-DVS CT-01)一起发酵。通过这种方法，发酵时间减少至约15至20小时。然而，辅助菌种比干酪乳杆菌生长得更快，并且由于辅助培养物的生长而产生的酸引起干酪乳杆菌生长的抑制，干酪乳杆菌浓度仅达到3至5×107CFU/ml。因此，仍然需要改进使用干酪乳杆菌进行发酵生产发酵乳制品的方法。

发明内容

[0006]本发明现在解决了这个问题，本发明涉及一种生产发酵乳制品的方法，该方法包括向乳中加入乳酸菌，其中所述乳酸菌包括干酪乳杆菌和至少一种除干酪乳杆菌之外的菌种的其他乳酸菌菌株。其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷但能够代谢乳中存在的除乳糖之外的一种或几种碳水化合物。[0007]本发明人惊奇地发现，使用干酪乳杆菌产生发酵乳制品时遇到的问题可以通过用干酪乳杆菌和至少一种具有乳糖代谢缺陷的其他菌株发酵乳来克服。其他菌株可以例如能够代谢蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖。这些碳水化合物中的一种或几种可以低浓度添加到待发酵的乳中。其他菌株会迅速代谢这些碳水化合物，从而开始快速酸化乳。酸化降低了由污染引起的不希望的乳酸菌生长的风险。其他菌株的生长加速了干酪乳杆菌的生长。这显然是由于其他菌株通过蛋白水解酪蛋白和其他乳蛋白在乳中产生氨基酸和肽。氨基酸和肽加速干酪乳杆菌的生长。然而，其他菌株不会生长到使干酪乳杆菌的生长受到显著抑制的程度，或者使乳酸化到使干酪乳杆菌的生长受到显著抑制的程度。在制备本发明的生产发酵乳制品的方法中，干酪乳杆菌实现与在不使用其他LAB的制备干酪乳杆菌的方法相同的最大细

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胞数。换句话说，在较短的时间内实现高浓度的干酪乳杆菌，同时降低了污染的风险。[0008]在一个方面，至少一种具有乳糖代谢缺陷的其他乳酸菌菌株是蛋白水解菌株。在一个优选的方面，至少一种具有乳糖代谢缺陷的其他乳酸菌菌株是高度蛋白水解菌株。[0009]在相关方面，至少一种具有乳糖代谢缺陷的其他乳酸菌菌株是菌种嗜热链球菌和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的细菌。

[0010]本发明的其他实施方案涉及干酪乳杆菌细菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的至少一种其他菌株在生产发酵乳制品中的用途，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷，但能够代谢乳中存在的除乳糖以外的一种或几种碳水化合物。

[0011]本发明还提供了包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌的组合物，其中所述乳酸菌的至少一种其他菌株具有乳糖代谢缺陷。存在于组合物中的具有乳糖代谢缺陷的至少一种其他细菌优选是嗜热链球菌和/或德氏乳杆菌保加利亚亚种。

[0012]在另一个实施方案中，本发明提供食品或饲料产品，其包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌，其中所述乳酸菌的至少一种其他菌株具有乳糖代谢缺陷。特别地，食品或饲料产品可以是发酵乳饮料。具体实施方式

[0013]一般而言，本发明提供了生产发酵乳制品的方法，包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述乳酸菌包含干酪乳杆菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的其他至少一种菌株，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷，但能够代谢乳中存在的除乳糖以外的一种或几种碳水化合物。

[0014]在本申请的上下文中，术语“乳”广泛用于其通常含义，是指由动物的乳腺或植物产生的液体。根据本发明，可以加工乳，术语“乳”包括全脂乳、脱脂乳、无脂乳、低脂乳、全脂乳、乳糖减少乳或浓缩乳。无脂乳是无脂肪或脱脂乳产品。低脂乳通常定义为含有约1％至约2％脂肪的乳。全脂乳通常含有2％或更多的脂肪。术语“乳”是指涵盖来自不同哺乳动物和植物来源的乳。乳的哺乳动物来源包括但不限于牛、绵羊、山羊、水牛、骆驼、美洲驼、母马和鹿。乳的植物来源包括但不限于从大豆、豌豆、花生、大麦、大米、燕麦、藜麦、杏仁、腰果、椰子、榛子、大麻、芝麻籽和向日葵籽中提取的乳。[0015]在本发明的方法和产品中，最优选使用源自奶牛的奶作为发酵的起始材料。[0016]乳糖减少和脂肪减少的乳可用于本发明的方法中。乳糖减少和脂肪减少的乳可商购获得，并且可根据本领域熟知的方法生产，包括通过乳糖酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，或通过纳滤、电渗析、离子交换色谱和离心。[0017]术语“乳基料”在本申请中广泛用于指基于乳或乳组分的组合物，其可用作LAB的生长和发酵的培养基。乳基料包含衍生自乳的组分和可用于LAB生长或发酵的任何其他组分。

[0018]如上所述，用于本申请的术语“干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)”和“L.casei”指菌种干酪乳杆菌或副干酪乳杆菌(L.paracasei)的细菌。干酪乳杆菌的任何菌株，包括菌株的混合物，可用于本发明的上下文中。优选使用干酪乳杆菌的食品级菌株。各种菌株可从

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各种来源获得。

[0019]在本申请的上下文中，术语“乳酸菌”或“LAB”用于指产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸的食品级细菌。这些细菌通过其常见的代谢和生理特征相关，通常为革兰氏阳性，低GC，耐酸，无孢子，无呼吸，杆状芽孢杆菌或球菌。在发酵阶段，这些细菌对乳糖的消耗导致形成乳酸，pH降低并导致形成蛋白质凝结物。因此，这些细菌负责乳的酸化和乳制品的质地。如本文所用，术语“乳酸菌”包括但不限于属于乳酸杆菌(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)、链球菌(Streptococcus spp)、乳球菌(Lactococcus spp)属的细菌，诸如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)和明串珠菌(Leuconostoc spp)。[0020]制造发酵乳制品的方法的发酵步骤包括向乳中添加乳酸菌。添加到乳中的细菌通常被定义为起子培养物。本文中使用的术语“起子培养物是指一种或多种食品级微生物，特别是乳酸菌的培养物，其负责乳基料的酸化。起子培养物可以是新鲜的、冷冻的或冷冻干燥的。为了生产发酵乳制品，可以以任何量添加起子。通常，以达到乳总量的体积的0.001至3％，优选0.001至0.025％的浓度的量添加起子。[0021]在本发明的上下文中术语“乳糖代谢缺陷”和“乳糖缺陷”用于表征LAB，其部分或完全丧失使用乳糖作为细胞生长来源或维持细胞活力的能力。各个LAB能够代谢选自由蔗糖、半乳糖和葡萄糖组成的组一种或几种碳水化合物或另一种可发酵碳水化合物。由于这些碳水化合物没有以足以支持乳糖缺陷型突变体发酵的量天然存在于乳中，因此有必要将这些碳水化合物添加到乳中。乳糖缺陷和部分缺陷的LAB可以表征为在含有乳糖和X-Gal的培养基上的白色菌落。[0022]因此，本发明的一个方面提供了一种生产发酵乳制品的方法，包括向乳中添加乳酸菌，其中所述细菌包含干酪乳杆菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的其他至少一种菌株，其中具有乳糖代谢缺陷的乳酸菌的至少一种其他菌株能够代谢一种或多种选自由蔗糖、半乳糖和葡萄糖组成的组的碳水化合物，并且其中所述碳水化合物在发酵前加入到乳中。

[0023]在一个优选的实施方案中，提供了一种生产发酵乳制品的方法，其中乳糖代谢缺陷的菌株是蛋白水解菌株，例如嗜热链球菌的蛋白水解菌株，更优选具有乳糖代谢缺陷的其他菌株是嗜热链球菌DSM 252。[0024]如上所述，其他菌株的生长加速了干酪乳杆菌的生长，这显然是由于其他菌株通过蛋白水解酪蛋白和其他乳蛋白在乳中提供了氨基酸和肽。因此，使用具有蛋白水解活性的另外的LAB代表了本发明的有利实施方案。[0025]根据本发明，如果LAB含有活性细胞壁蛋白酶，则LAB是蛋白水解LAB。细胞壁蛋白酶水解乳蛋白，例如酪蛋白，因此改善了作为具有氨基酸营养缺陷型的LAB快速生长的培养基的乳的质量。已经在许多LAB中详细鉴定和表征了细胞壁蛋白酶，包括乳酸乳球菌的

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PrtP，嗜热链球菌的PrtS和保加利亚乳杆菌的PrtB。因此可以通过编码细胞壁蛋白酶的基因的存在来鉴定蛋白水解LAB。[0026]另外，蛋白水解LAB可以通过荧光底物异硫氰酸荧光素标记的酪蛋白或FITC酪蛋白测定来鉴定，其中确定了与不含所述菌株细胞的对照样品相比由菌株在含有荧光标记的酪蛋白的培养基中生长6小时引起荧光增加。实施例1中提供了该测定的全部细节。[0027]因此，本发明提供了生产发酵乳制品的方法，包括向乳中添加乳酸菌，其中所述细菌包含干酪乳杆菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的至少一种其他菌株，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷但能够代谢乳中存在的除乳糖之外的一种或几种碳水化合物，并且其中具有乳糖代谢缺陷的其他菌株是嗜热链球菌的蛋白水解菌株，其中蛋白水解菌株的特征在于：[0028](a)存在活性细胞壁蛋白酶；和/或[0029](b)与对照样品相比，所述菌株在含有荧光标记的酪蛋白的培养基中生长6小时引起荧光增加。

[0030]在本发明方法的一个具体实施方案中，具有乳糖代谢缺陷的其他菌株是嗜热链球菌的蛋白水解菌株，其中蛋白水解菌株的特征在于：[0031](a)存在活性细胞壁蛋白酶；和/或[0032](b)与对照样品相比，所述菌株在含有荧光标记的酪蛋白的培养基中生长6小时引起荧光增加。

[0033]在本发明方法的一个具体实施方案中，蛋白水解嗜热链球菌菌株选自由以下组成的组：[0034](a)嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)菌株，所述菌株为：[0035](i)于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B(Inhoffenstr.7B)D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 252的菌株；[0036](ii)或衍生自DSM 252的菌株，其中所述衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；[0037](b)嗜热链球菌菌株，所述菌株为：[0038](i)于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 253的菌株；[0039](ii)或衍生自DSM 253的菌株，其中所述衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；

[0040]在本发明方法的一个具体实施方案中，干酪乳杆菌菌株选自由保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431和保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌的CHCC2115组成的组。[0041]在另一方面，本发明的方法使用选自以下一种或多种菌株的乳酸菌：[0042](a)保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；[0043](b)保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌CHCC2115；[0044](c)保藏编号为DSM252的嗜热链球菌CHCC17861，一种缺乏乳糖代谢的菌株。[0045]在一个优选的方面，该方法使用选自以下菌株组合之一的乳酸菌：[0046](i)保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431和保藏编号为DSM 252的嗜热链球菌CHCC17861，一种乳糖代谢缺陷的菌株；或

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(ii)于2007年6月27日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物

保藏中心，保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌CHCC2115和保藏编号为DSM 252的嗜热链球菌CHCC17861，一种乳糖代谢缺陷的菌株。

[0048]乳糖缺陷型LAB及其制备方法已在包括WO2013/160413，PCT/EP2015/063767和PCT/EP2015/063742在内的现有专利申请中进行了一般描述，举例说明和保藏，它们描述了生产具有乳糖代谢缺陷的LAB的方法和通过这些方法获得的特定菌株。

[0049]任何具有乳糖代谢缺陷的LAB和不同菌株混合物都可用于本发明的方法中。在本发明方法的一个优选实施方案中，具有乳糖缺陷的其他菌株选自嗜热链球菌(ST)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(LB)。这些乳糖缺陷的LAB代谢除乳糖以外的碳水化合物，例如蔗糖。在本发明方法的一个优选实施方案中，所述其他菌株选自：[0050](a)嗜热链球菌菌株，所述菌株为：[0051](i)于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 252的菌株；[0052](ii)或衍生自DSM 252的菌株，其中所述衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；[0053](b)嗜热链球菌菌株，所述菌株为：[00](i)于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 253的菌株；[0055](ii)或衍生自DSM 253的菌株，其中所述衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力；[0056](c)德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgaricus)菌株，所述菌株为：[0057](i)于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 210的菌株；[0058](ii)或衍生自DSM 210的菌株，其中所述衍生菌株的特征还在于具有在含有乳糖和X-Gal的培养基上产生白色菌落的能力。[0059]在本发明的上下文中使用术语“能够代谢乳中存在的除乳糖之外的一种或几种碳水化合物”来描述乳糖缺陷的LAB的代谢活性，所述乳糖缺陷的LAB导致使用乳糖以外的碳水化合物产生作为碳水化合物发酵的主要代谢终产物的乳酸。为了实现可检测的基于除乳糖之外的碳水化合物的代谢活性，可能必须将其他碳水化合物添加到乳中。[0060]在某些实施方案中，本发明的方法使用能够代谢蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖的LAB。因此，本发明提供了在发酵前将蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖加入到乳中的方法。添加到乳中的碳水化合物的量可以根据所用的LAB和主要由除干酪乳杆菌以外的LAB引起的所需酸化容易地确定。在大多数情况下，蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖以一定量加入到乳中，产生在0.4g/l至10g/l、或者在1g/l至8g/l、或者2g/l至6g/l的范围内的浓度。

[0061]本领域普通技术人员可以容易地确定在发酵开始时在起子培养物或乳中的干酪乳杆菌和至少一种具有乳糖代谢缺陷的其他LAB菌株的细菌细胞计数的比例。在一个具体实施方案中，干酪乳杆菌：其他LAB菌株的比例范围为95：5至5:95。优选的比例范围为80:20至20:80，优选70:30至30:70，更优选60:40至40:60，诸如约50:50。

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在本发明方法的一个实施方案中，发酵在22至45℃，优选约30℃的温度进行。通常

进行发酵直至达到低于pH4.5，优选约pH4.0，例如pH3.7至4.3。

[0063]本发明的方法的特征尤其在于获得高浓度的干酪乳杆菌，优选浓度为1×108至5×109CFU/g，更优选1×105至5×109CFU/g，最优选1×109至3×109CFU/g。这些浓度在相对短的时间内实现，例如在30至50小时的时间段内，最优选在35至45小时的时间段内。[00]本发明特别提供了生产发酵乳制品的方法，包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述细菌包括：[0065](a)干酪乳杆菌和[0066](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物，

[0067]其中细菌以(a)：(b)为95：5至5:95的比例加入到乳中，其中该方法在35和45小时的时间段产生浓度为1×108至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌。[0068]本发明进一步提供了生产发酵乳制品的方法，包括将乳酸菌添加到乳中，其中所述细菌包括：[0069](a)选自以下的干酪乳杆菌菌株[0070](i)保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；和/或[0071](ii)保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌CHCC2115；[0072](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物，优选包含保藏编号为DSM 252的嗜热链球菌菌株CHCC17861；[0073]其中细菌以(a)：(b)为95：5至5:95的比例加入到乳中，其中该方法在35和45小时的时间段内产生浓度为1×108至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌。[0074]在一个优选的实施方案中，具有乳糖代谢缺陷的乳酸菌的至少一种其他菌株是选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的菌种的细菌。[0075]在本发明方法的一个具体实施方案中，具有乳糖代谢缺陷的乳酸菌程度至少一种其他菌株是嗜热链球菌菌种的细菌。

[0076]在本发明方法的一个具体实施方案中，具有乳糖代谢缺陷的乳酸菌显示至少一种其他菌株是德氏乳杆菌保加利亚亚种的细菌。[0077]在一个相关的实施方案中，本发明提供了干酪乳杆菌和除干酪乳杆菌以外的菌种的乳酸菌的至少一种其他菌株用于生产发酵乳制品的用途，其中所述其他菌株具有乳糖代谢缺陷，但能够代谢乳中存在的除乳糖以外的一种或几种碳水化合物。干酪乳杆菌细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的这种用途可包括向乳中添加蔗糖、半乳糖和/或葡萄糖。[0078]在优选的实施方案中，该用途的特征还在于，具有乳糖代谢缺陷的乳酸菌的至少一种其他菌株是选自由嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种组成的组的菌种的细菌。[0079]在另一方面，本发明提供了包含菌种干酪乳杆的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌的组合物，其中所述至少一种其他乳酸菌菌株具有乳糖代谢缺陷。在本发明的一个具体实施方案中，所述组合物包含根据权利要求10的菌种干酪乳杆菌的细菌和至少一种其他乳酸菌菌株的细菌，其中所述至少一种其他细菌是选自由以下组成的组的菌种的细菌：嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种。

[0080]本发明的组合物可包含任何数量的其他组分，包括发酵乳、食品添加剂、稳定剂、

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冷冻保护剂、调味剂、人造甜味剂等。该组合物可以用作使用如上所述的本发明方法生产发酵乳制品的起子培养物。[0081]或者，这些组合物代表发酵乳制品本身。[0082]本发明进一步涉及食品或饲料产品，其包含菌种干酪乳杆菌的细菌和乳酸菌的至少一种其他菌株的细菌，其中所述乳酸菌至少一种其他菌株具有乳糖代谢缺陷。[0083]在本发明的食品或饲料产品的一个具体实施方案中，所述乳酸菌的至少一种其他菌株是选自由以下组成的组的菌种的细菌：嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种。

[0084]本发明的食品或饲料产品的一个具体实施方案包括浓度为1×108CFU/g至5×109CFU/g，优选1×109CFU/g至5×109CFU/g，更优选1×109CFU/g至3×109CFU/g的干酪乳杆菌。

[0085]在本发明的食品或饲料产品的特定实施方案中，食品或饲料产品是发酵乳饮料。[0086]在特别优选的实施方案中，食品或饲料产品包含：[0087](a)浓度为1×108至1×1011CFU/g或浓度为1×109至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌，和[0088](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自由嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物。[00]例如，本发明提供的食品或饲料产品包含：[0090](a)浓度为1×108至1×1011CFU/g或1×109至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌菌株，其中所述菌株选自：[0091](i)保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；和/或[0092](ii)保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌CHCC2115；以及[0093](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物，优选包含嗜热链球菌CHCC17861。

[0094]任何食品或饲料产品可以是任何发酵乳制品，包括酸奶、水果酸奶、酸奶饮料或奶酪。

[0095]在本申请的上下文中，术语“酸奶”是指包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种和任选的其他微生物如德氏乳杆菌乳酸亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)或由其衍生的任何微生物的产品。包括除嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种之外的乳酸菌株以使最终产品具有各种性质，例如促进菌群平衡的性质。如本文所用，术语“酸奶”包括凝固型酸奶、搅拌型酸奶、饮用酸奶、小瑞士奶酪(Petit Suisse)、热处理酸奶，以高蛋白质水平为特色的脱乳清酸奶或希腊式酸奶以及酸奶类产品。

[0096]特别是，术语“酸奶”包括但不限于根据法国和欧洲法规定义的酸奶，例如，通过仅通过特定的嗜热乳酸菌(即被同时培养并且发现在最终产品中以至少1000万CFU(菌落形成单位)/g的量存活的德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌)进行乳酸发酵获得的凝固乳制品。酸奶可任选地含有添加的乳制品原料(例如奶油)或其他成分，例如糖或甜味剂、一种或多种调味剂、水果、谷物或尤其是维生素、矿物质和纤维的营养物质以及稳定剂和增稠

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剂。在一个替代方案中，酸奶满足AFNOR NF 04-600标准和/或Codex StanA-lla-1975标准的发酵乳和酸奶的规格。为了满足AFNORNF 04-600标准，产品在发酵后不得加热，乳制品原料必须至少占最终产品的70％(m/m)。[0097]本发明的食品还包括干酪，包括通过将上述方法应用于本领域熟知的干酪制造技术(Hoier et al.(2010)in The Technology of Cheesemaking，2ndEd.Blackwell Publishing，Oxford；166-192)而生产的马苏里拉奶酪、比萨饼干酪和菲达奶酪。[0098]在一个优选的实施方案中，本发明提供了通过上述方法获得的发酵乳饮料，例如发酵的酸奶。例如，发酵乳饮料可以表征为包含：[0099](a)浓度为1×108至1×1011CFU/g或1×109至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌；和[0100](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物。

[0101]该发酵乳饮料尤其可以包含：[0102](a)浓度为1×108至1×1011CFU/g或1×109至1×1011CFU/g的干酪乳杆菌菌株，其中所述菌株选自：[0103](i)保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；和/或[0104](ii)保藏编号为DSM 19465的干酪乳杆菌CHCC2115；以及[0105](b)具有乳糖代谢缺陷的细菌，选自嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种及其混合物，优选包含嗜热链球菌CHCC17861。附图说明

[0106]图1显示了使用不同起子培养物的乳的酸化曲线。

[0107]图2显示发酵和储存后干酪乳杆菌的细胞计数(CFU/g)。[0108]图3显示发酵和储存后干酪乳杆菌的细胞计数(CFU/g)。[0109]实施例1[0110]FITC分析：使用Hamilton液体处理单元测量乳酸菌(LAB)中蛋白酶活性的方案。[0111]细胞壁相关蛋白酶有助于乳中LAB的快速生长。蛋白酶还负责酪蛋白降解的第一步，从而产生风味。该测定基于荧光底物异硫氰酸荧光素标记的酪蛋白(FITC)。[0112]材料

[0113]Costar深孔板-2.0ml[0114]微量滴定板：Nunc，黑色板，(Cat.No.237105)，Nunc(产品编号167008)，MJR PCR板(V形，产品编号HSP-9665)

[0115]Hamilton液体处理机器人[0116]Hamilton一次性无菌吸头[0117]二水氯化钙(Merck Cat.No.1.02382.1000)[0118]MES水合物，最低99.5％滴定(Sigma M8250-1kg)[0119]Tris，(Sigma Cat.No.T1503)[0120]Costar深孔板样品(2.0ml)[0121]Enspire，2300多标签阅读器，PerkinElmer[0122]对照菌株：LH-Emfour，批号No.2995517，材料号：501638

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作为解冻的DVS(50μl)添加的LH-32批号2990465，材料号616703以生长过夜(o/

n)。当使用新批次的对照时在使用前将蛋白水解活性与旧批次进行比较。[0124]500mM Tris-HCL，pH 8.5：[0125]60.55g Tris-HCl。添加Milli-Q水至800ml，用1M HCl调节pH至8.5。用Milli-Q水填充至1000ml。[0126]FITC，FITC标记的酪蛋白(Sigma C3777)[0127]5mg/ml FITC，在无菌过滤的Milli-Q水中制备。[0128]MES 100mM+CaCl 2，pH 6.5[0129]19.52g MES和7.35gCaCl2。添加水至800ml，调节pH至6.5，加水至1000ml，无菌过滤器。

[0130]5％TCA

[0131]将5g三氯乙酸溶于Milli-Q水中至总体积为100ml。[0132]培养基：BD5-3肉汤[0133]方法

[0134]洗涤细胞

[0135]菌株以适当稀释度生长过夜，从WS-Plate以10％接种到具有1800μlBD5-3肉汤的深孔板中。乳球菌在30℃孵育；乳酸杆菌和链球菌在37℃孵育。用冷的MES缓冲液pH6.5洗涤3次(每次洗涤后离心深孔板，在10℃4000rpm离心4分钟)，测量OD620，并从中对FITC底物测量蛋白酶活性的样品取样并在37℃孵育平板6小时。[0136]FITC方案[0137]-将8μl FITC溶液分配到MJR PCR微量滴定板(V形孔以便在孵育期间使蒸发最小化)。

[0138]-将40μl洗涤过的细胞悬浮液分配到MJR PCR微量滴定板并密封板。[0139]-在37℃孵育MJR PCR微量滴定板0-6小时(Lb's&St's)。[0140]-将115μl 5％w/v TCA分配至MJR PCR微量滴定板。[0141]-在室温下孵育MRJ PCR微量滴定板1小时或在冰浴上孵育30分钟。[0142]-离心MJR PCR微量滴定板(3700rpm，10分钟，10℃)。[0143]-将125μl Tris-HCl 0.5M(pH8.5)分配至Nunc Black微量滴定板。[0144]-从MJR PCR微量滴定板吸取45μl至Nunc Black微量滴定板。[0145]-在Enspire，2300多标记阅读器，PerkinElmer上读取497nm激发-515nm发射的荧光。

[0146]T0未孵育的样品

[0147]T6样品在用MES-缓冲液洗涤后立即在37℃孵育6小时。[0148]数据处理：从T6中减去T0，制作图形，然后除以洗过的细胞的OD，制作新的图形。检查非常高的活性是否是由于低OD造成的。检查对照是否在正常范围内。[0149]实施例2

[0150]使用单独的以下两种不同的Chr.Hansen的干酪乳杆菌菌株中的一种或与以下Chr.Hansen的嗜热链球菌菌株组合发酵乳：[0151]保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；

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保藏编号为DSM19465的干酪乳杆菌01，CHCC2115；和

[0153]保藏编号为DSM 252的嗜热链球菌CHCC17861。[01]嗜热链球菌菌株具有乳糖代谢缺陷。[0155]当组合使用时，使用以下比率：[0156](1)50:50[0157](2)90:90；和[0158](3)10:90。

[0159]使用单独的乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌和使用单独的两种干酪乳杆菌菌株中的每一种用作对照。

[0160]标准乳用于试验(3.8％蛋白质，1.5％脂肪)。将蔗糖(0.4％w/v)添加到乳中以使具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌快速酸化至pH5.50。酸化在39℃和37℃进行。[0161]在发酵过程中测定pH的发展。在发酵后第1、7和14天测定细胞计数的发展。[0162]进行三次重复以确认数据。[0163]典型结果如图1和2所示。如图1所示，单独的干酪乳杆菌01具有非常长的滞后期并且仅在发酵40小时后达到pH 4.5。然而，当与不同比例的具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌结合时，滞后期显著缩短(单独干酪乳杆菌01达到pH 6.3为8小时；而与具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌组合仅时为1小时)。在蔗糖耗尽后，单独的具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌将pH值降低至最终pH值5.1。然而，当与干酪乳杆菌01组合时，由于能够使用乳中存在的乳糖的干酪乳杆菌01的存在，酸化继续。[01]使用干酪乳杆菌CRL 431在37℃下进行的试验获得了相同的结果(数据未显示)。[0165]干酪乳杆菌01细胞计数如图2所示。图2显示，与单菌株发酵相比，具有乳糖代谢缺陷的干酪乳杆菌01和嗜热链球菌的共培养不会降低干酪乳杆菌细胞计数。[0166]因此，干酪乳杆菌01与Lac(-)ST的组合增强干酪乳杆菌01而没有干扰其生长(没有竞争)。该组合允许大大缩短滞后期，同时保持高细胞计数。[0167]实施例3

[0168]使用单独的Chr Hansen的干酪乳杆菌菌株或与下列Chr Hansen的嗜热链球菌菌株的组合进行发酵：[0169]保藏编号为ATCC 5的干酪乳杆菌CRL 431；与以下组合：[0170]1)保藏编号为嗜热链球菌DSM 252的嗜热链球菌CHCC17861。该菌株缺乏乳糖代谢(Lac(-))；或

[0171]2)保藏编号为DSM22935的嗜热链球菌CHCC11977，没有乳糖代谢缺陷(CHCC17861的母株)(Lac(+))。

[0172]当组合使用时，使用以下比率：[0173](1)50:50[0174]用于本实验的乳基料是以9.6％重构的脱脂奶粉(SMP)。乳基料在99℃下进行热处理15分钟。将蔗糖(0.3％w/v)加入到乳中以使具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌快速酸化至pH5.50。酸化在39℃下进行。

[0175]发酵后40小时测定细胞计数的发展。[0176]进行一次重复的实验。

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如图3所示，当干酪乳杆菌菌株与常规嗜热链球菌菌株(没有乳糖代谢缺陷(Lac

(+))一起生长时，干酪乳杆菌细胞计数与当干酪乳杆菌单独生长时相比显著降低。此外，与当干酪乳杆菌单独生长时相比，当干酪乳杆菌菌株与具有乳糖代谢缺陷的嗜热链球菌菌株(Lac(-))一起生长时，干酪乳杆菌细胞计数显著增加。[0178]保藏和专家解决方案

[0179]申请人要求保藏的微生物样品应仅供申请人批准的专家使用。

[0180]嗜热链球菌菌株于2014年6月12日保藏于布伦瑞克D-38124英豪丰街7B的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 252。

[0181]嗜热链球菌菌株于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7BD-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM 253。

[0182]嗜热链球菌菌株于2009年9月8保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM22935。

[0183]德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株于2014年6月12日保藏于布伦瑞克英豪丰街7B D-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM210。

[0184]干酪乳杆菌菌株于2007年6月27日保藏于布伦瑞克英豪丰街7BD-38124的DSMZ-德国微生物保藏中心，保藏编号为DSM19465。

[0185]这些保藏是根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约完成的。

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图3

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