奶牛胚胎移植的研究进展

《乳业科学与技术》　、　、：　、：　２００６年第４期　（总第１１９期）　１９５　５繁殖育种《　ｆ　Ｉ、　ｆ　奶牛胚胎移植的研究进展　师志海，郭剑英，李守军　，邢会杰　（华南农业大学兽医学院，广东广州５１０６４２）　摘要：胚胎移植技术作为一项实用的繁殖技术，在奶牛改良和繁殖育种中广泛应用。本文就奶牛胚胎　移植的研究现状以及对包括胚胎冷冻保存、胚胎分割与融合、核移植、性别控制技术、体外受精技术、转　基因技术等胚胎移植相关技术进行阐述。　关键词：胚胎移植；奶牛　中图分类号：￥８２３．９　１．３＊６　文献标识码：Ａ　文章编号：１６７１－５１８７（２００６）０４－０１９５－０４　Ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｎ　Ｃｏｗｓ’Ｅｍｂｒｙｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｓｈｉ　Ｚｈｉｈａｉ，Ｇｕｏ　Ｊｉａｎｙｉｎｇ，Ｌｉ　Ｓｈｏｕｊｕｎ，Ｘｉｎｇ　Ｈｕｉｊｉｅ　（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ　ｏｆ　Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ　５　１０６４２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒｃｔ：Ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｓ　ａｎ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｂｒｅｅｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｈａｓ　ｂｅｅｎ　ｗｉｄｅｌｙ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ＣＯＷＳ　ｕｐｇｒａｄｅ　ａｎｄ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｔｈｉｓ　ａｒｔｉｃｌｅ　ｒｅｖｉｅｗｅｄ　ＣＯＷＳ’ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｃｔｕａｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｅｍｂｒｙｏ　ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ｅｍｂｒｙｏ　ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ　ａｎｄ　ｆｕｓｉｏｎ，ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｓｅｘ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｉｎ－ｖｉｔｒｏ　ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｅｔｃ．　Ｋｅｙ　Ｗｏｒｄｓ：Ｅｍｂｒｙｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ；Ｃｏｗ　胚胎移植技术被誉为家畜繁殖技术的第二　次，是可以和人工授精相提并论的现代繁殖　技术，其首次成功是由英国剑桥大学的学者　Ｗａｌｔｅｒ　Ｈｅａｐｅ（１８９０）￣造的，直到二十世纪３Ｏ年　代以后，才开始大量研究，１９５１年在牛上获得成　功，１９７４年第一头胚胎移植登记荷斯坦奶牛在美　国出生。我国对牛胚胎移植研究起步较晚，１９７８　１超数排卵　在胚胎移植技术的实施中，对供体母畜进行　超数排卵为胚胎移植技术程序中不可缺少的一　个环节。通过超数排卵可以获得大量整齐、优质　的卵子，使得优良后代数增加几倍甚至几十倍，　加快了优良品种扩繁和动物育种的步伐。牛是单　胎动物，产犊数量少，Ｒｏｗｓｏｎ等（１９７１）用双侧输　卵管胚胎移植实验首次证实，是奶牛排卵数而不　是子宫容纳量双胎和多胎的出现，因而人们　一年手术法胚胎移植犊牛降生，１９８０年非手术法移　植获得犊牛，１９８２年冷冻胚胎移植成功。应用胚　胎移植技术加速品种改良及扩大种群，是目前国　际上推动畜牧业发展的重要途径之一。奶牛胚胎　移植技术作为奶牛改良及增殖的有效手段，正在　直都很重视对母牛超数排卵的研究。但是母牛　个体间较大的超排反应差异使得人们在生产实　践中无法准确预测其超排效果，这样大大影响了　胚胎移植的效益。从国际胚胎移植协会（ＩＥＴＳ）的　被广泛普及利用。我国目前应用这一技术的速度　是十分惊人的。本文就近年来奶牛胚胎移植的研　究进展进行综述。　报道可以看出，最近１Ｏ年来，每头供体牛获得的　可用胚胎数平均在６枚左右，说明超数排卵技术　基本稳定。　１．１超数排卵研究现状　收稿日期：２００５—１１—２１；修回日期：２００６－０１—１３。　奶牛对超排的反应和可用胚胎的产量变异　基金项目：广东省科技攻关项目（２００４Ｂ２０２０１０２１）　作者简介：师志海（１９８２一），男，临床硕士研究生。　为通讯作者。　范围很大，使得在生产实践中无法预测奶牛个体　维普资讯 http://www.cqvip.com

１９６　师志海等：奶牛胚胎移植的研究进展　（ＧｎＲＨ）方法进行研究，结果表明：延长排卵前卵　的超排反应，以至于许多研究者认为超排反应是　无法预测的，因此在这一方面有许多探索性研　究。Ｍａｐｌｅｔｏｆｔ　ＲＪ等总结以往的胚胎移植记录发　现，每个供体母牛的排卵率和可用胚胎数是相　对稳定的，一次超排处理效果好的牛以后各次　处理效果都好，而一次超排处理效果不好的牛　往往在以后处理时效果也都不好。Ｔｏｎｈｍｉ　Ｈ等　统计了２９４１头母牛的５３８７次超排反应，认为超　泡的发育时间增加了成熟卵泡的数量和提高了排　卵率，但是最终可用胚的数目没有增加。分析其原　因认为，这可能是由于外源性激素处理使得输卵　管环境发生紊乱，从而导致胚胎的发育受到了不　利影响。　１．２．４　ＧｎＲＨ及其类似物的应用　排反应不具有遗传性。因此，可以用上一次超排　ＧｎＲＨ可以促使垂体释放促黄体素（ＬＨ），提　高奶牛多卵泡排卵的同期化程度。此外，有报道认　的结果来预测下一次超排反应，而不能依据遗　传特性推测。Ｄｆｉａｎｃｏｕａ　ＭＡ的研究表明，母牛卵　巢对超排处理的反应依赖于超排时存在的对促　性腺激素敏感的卵泡的数量，也就是说在用促　性腺激素处理时，母牛卵泡波所处的阶段对超　排有重要的影响。Ｈａｓｌｅｒ　ＪＦ等研究表明使用重　组体牛生长激素（ｒｂＳＴ）处理会增加牛的超排效　果。Ａｌｉ　Ａ等通过超声扫描技术确定卵泡的形　态，通过抽吸卵泡的卵泡液并测定其中雌激素　（Ｅ）／孕酮（Ｐ４）的比例来区别生长卵泡和闭锁卵　泡，通过注射前列腺素（ＰＧＦ２ｃｔ），使处于周期不　同阶段的黄体退化，诱导优势卵泡的排卵。这表　明，应用超声技术预测超排效果是一个有希望　的辅助手段。总之，目前对超排效果的预测还只　是停留在经验水平上，准确地预测超排反应还　需要更进一步的研究。　１．２超排效果的改进设想　１．２．１小剂量促卵泡素（ＦＳＨ）预处理　Ｗｉｔｂａｎｋ　Ｍ　Ｃ等研究认为，在第一个卵泡波　出现后的ＦＳＨ峰与下一个卵泡波（即开始超排处　理时）中存在的对ＦＳＨ敏感的２￣６ｍｍ卵泡的群　体大小有关。因此，在发情周期的初期用小剂量　ＦＳＨ对母牛进行预处理，使得更多的储备卵泡变　为有腔卵泡，可以提高周期内９—１３ｄ有腔卵泡的　数量，从而改善超排效果。　１．２．２抑制素主动免疫　卵巢颗粒细胞释放的抑制素（ＩＮＨ）可以选择　性地作用于垂体抑制ＦＳＨ的分泌。用抑制素免疫　动物后，内源性抑制素被抗体中和，血液中ＦＳＨ浓　度升高，达到增加排卵率的目的。研究表明，使用抑　制素免疫后获得超排反应可以维持较长时问，而　且使用较少剂量的ＦＳＨ即可获得较好的超排效　果；但也有相反的报道。因而如何用抑制素免疫来　改善超排效果还需进一步研究。　１．２．３延长排卵前卵泡的发育　Ｖａｎ　ｄｅ　Ｌｅｅｍ等采用先使用外源性孕酮栓，　在孕酮栓撤除之后注射促性腺激素释放激素　为，ＧｎＲＨ还具有改善超排牛输卵管及子宫环境　的作用，有利于胚胎的发育，促进子宫内膜的进一　步成熟。　超数排卵作为一种实用的高新技术，应该通　过进一步研究来完善和简化其程序。同时，对超排　技术的研究也会使人们进一步明白卵泡的募集、　优势化和排卵或闭锁的机制，从而对家畜的繁殖　起到一个大的推动作用。　２同期发情　利用某些外源激素人为控制并调整一群母畜　发情周期的过程，使之在预定的时间内集中发情，　以便有计划地合理组织胚胎移植所进行的同期化　处理方法，也称同步发情。处理方法由单纯一类制　剂向两类或以上制剂配合使用发展，如ＰＧＦ２０ｃ一　次法、ＰＧＦ２ｅｔ二次法、ＧｎＲＨ＋ＰＧＦ￣法、ＣＩＤＲ（孕　酮栓）＋ＰＧＦ￣法、ＣＩＤＲ＋ＧｎＲＨ＋ＰＧＦ￣ｔ法、包埋法　等，并在牛胚胎移植中得到广泛研究与应用，得到　较好同期发情效果。常用的激素药物有ＰＭＳＧ、　ＧｎＲＨ、ＦＳＨ、ＬＨ、ｈＣＧ、ＰＧＦ　Ｐ４及类似物等。李树　静等用ＰＧＦｚｃｔ二次法，注射后３６　４８ｈ有４５％　６０％母牛表现发情；刘广振等采用Ｅｓｔｒｕｍａｔｅ　（ＰＧＦｚｃｔ类药物）一次注射法对２２２头奶牛进行同　期发情处理，其中有１６１头静立发情，发隋率为　７２．５２％；和占星等试验表明ＣＵＥ—ＭＡＴＥ孕酮栓＋　ＰＧＦ２０ｃ法的同期发情率达９４．２％，其中有９７．３％　集中在取栓后７２ｈ内发情，可移植率４９．６％。为了　更准确地判断同期发情处理的效果和掌握发情的　确切时间，可使用鉴定器帮助鉴定发情。　３收集胚胎　从超排供体收集胚胎（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｅｍｂｒｙｏｓ）的　技术对家畜胚胎移植来讲是关系到能否广泛应用　于生产中的关键性环节。胚胎收集有手术法和非　手术法。手术法通常以发情日为第０ｄ，在第７ｄ以　手术子宫冲洗法采集胚胎，术前２４ｈ停食。在此时　期，胚胎朝向子宫推进。当冲胚时，将特地配制的　维普资讯 http://www.cqvip.com

《乳业科学与技术》　２００６年第４期　（总第１１９期）　１９７　冲卵液经导管注入子宫，如此则子宫内的胚胎都　集合于冲胚液中，随后再导出于贮液器内，并保存　在３７ｃ【二条件下，尽量减少体外环境，如温度和灰　尘等不良因素的影响。奶牛非手术法移植技术的　成功是胚胎移植技术向产业化转化过程中的重要　里程碑。１９７６年奶牛的非手术法移植获得成功，　５．２胚胎分割与融合　为了充分利用胚胎资源，增加胚胎来源，对胚　胎进行胚胎分割（ｅｍｂｒｙｏ　ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ），胚胎切割技　术是提高胚胎移植效率的很好补充。Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ和　Ｐｏｌｇｅ首先建立了对胚胎进行分割生产同卵双生　牛犊的技术。从理论上讲胚胎的切割可能是无限　的，但是实践证明只有二分胚的发育能力最强。近　大大简化了操作程序、减少了因手术对供、受体母　牛的伤害，使胚胎移植在奶牛中的应用得到飞速　发展并于１９７７年开始进入商业化应用，开始了产　几年提高实验证明，二分胚直接移植的受胎率也　可达到４０％以上，这无异提高了胚胎利用率。利　业化进程。　４移植胚胎　移植胚胎（ｅｍｂｒｙｏ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）是将体外　培养至２～８个细胞的早期胚胎移植给受体母畜。　与收集胚胎方法相似，移胚也分为手术法和非手　术法，前者适用于不能进行直肠操作的中小动物，　后者适用于大家畜。然而，在牛，手术法比非手术　法的妊娠率高，且妊娠率变化范围也较小，因为手　术法可以直接看到子宫角，但所需条件较高。目前　奶牛生产中主要应用非手术法移胚。　５胚胎移植相关技术　５．１胚胎冷冻保存　如果说奶牛非手术法移植（１９６４）技术的成功　是推动牛胚胎移植技术向产业化转化的重要里程　碑，那么冷冻胚胎技术的研究成功为这项技术在　畜牧业生产中发挥作用奠定了基础。为了便于胚　胎移植的集约化生产应用，建立胚胎库和胚胎的　长途运送，就必须解决胚胎冷冻问题，而冷冻胚胎　的大量使用是目前牛胚胎移植技术发展最显著的　标志。　１９７２年，英国学者Ｗｈｉｔｔｉｎｇｈａｍ等人首次利　用慢速冷冻方法保存小鼠胚胎获得成功。１９７３　年，Ｗｉｌ　ｍｕｔ等首次成功地进行了牛胚胎冷冻保　存。此后许多学者对冷冻方法进行了广泛的研究　和应用。１９７７年，Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ发明了快速冷冻法，将　原来需要半天的冷冻过程缩短到２小时之内。　Ｒａｌｌ和Ｆａｈｙ在１９８５年首次报道了用玻璃化方法　来冷冻保存小鼠胚胎。这种方法不仅大大简化了　冷冻过程，而且减少了由于细胞冰晶形成所引起　的一系列物理化学损伤。目前，这项技术被成功地　应用在牛的胚胎移植上了。根据这种技术的发展，　牛胚胎冷冻大体上可分为慢速冷冻法、一步冷冻　法、快速冷冻法和玻璃化冷冻法。特别是２００１年，　Ｍｌｏｐａｔａｒｏｖａ等应用ＯＰＳ（Ｏｐｅｎ　ｐｕｌｌｅｄ　ｓｔｒａｗ）法进　行牛胚胎的冷冻保存，取得很好的效果。　用显微外科技术将早期胚胎分割为两个或多个，　分割后的两个半胚可以不用考虑性别，直接移植　给同一头受体牛，而不用担心造成异性孪生母犊　不育。　胚胎融合（ｅｍｂｒｙｏ　ｆｕｓｉｏｎ）技术不仅为动物胚　胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段，而且　已经证实，嵌合体（ｃｈｉｍｅｒａ，由不同基因型的细胞　和组织混合在同一个体，由２个或２个以上的受　精卵发育而成的复合体，具有两个以上的亲代）后　代可集不同品种或不同动物的不同基因于一体，　完全有可能把母代动物的优良遗传性能集中表现　出来，从而形成具有高度杂种优势的杂合体。另　外，嵌合体母畜与公畜交配后，能产生具有正常繁　殖力的后代。胚胎融合可以缩短奶牛品种改良时　间，为创造新型奶牛品种提供了技术手段；而且为　不同品种间的杂交改良开辟了新的渠道，对分析　胚胎的发生机制和基因表现机制以及了解性别分　化或免疫机理等具有极重要价值。　５－３核移植　１９９７年和１９９８年是生物技术取得飞跃性发　展的年代，１９９７年无性克隆绵羊Ｄｏｌｌｙ诞生，１９９８　年克隆牛降生。从优良母亲获得的受精卵的卵裂　球制作克隆胚胎，再由克隆胚胎生产出新的克隆　胚胎，从理论上讲这个过程是可以重复无限次的，　但实际上并非如此。仅能生产出有限的克隆家畜，　第二代克隆牛尚可生产，但第三代的生产在各代　中效果最差，就根本妊娠不了，所以说克隆　化的继代有效性问题还没有解决。　胚胎克隆技术可以大幅度提高胚胎分割效　率，目前该项技术已近成熟，达到应用程度。这一　生物技术方法的关键是将胚胎细胞核移植到去核　卵细胞中，即核移植技术。当然目前克隆后可用胚　胎的移植成功率仅为３０％，因此尚有一系列技术　难题有待于探索。　５．４性别控制　因为奶牛性别与其经济用途和生产性能有着　密切的关系，所以性别控制技术在奶牛生产中具　维普资讯 http://www.cqvip.com

１９８　师志海等：奶牛胚胎移植的研究进展　有重要的意义，也因此吸引了许多科研工作者对　这项技术进行广泛地研究。目前奶牛性别控制主　要从两方面进行研究，即受精前Ｘ精子和Ｙ精子　的分离和早期胚胎（移植前）的性别鉴定。前者主　要有沉淀法、电泳法、流式细胞光度法、免疫法；后　者主要有性别遗传学、ｘ染色体连接酶活力测定　法、ＰＣＲ技术、活组织检查、Ｈ—Ｙ抗原法。Ｈ—Ｙ抗　原法不损害胚胎，准确率比较高，牛雌性鉴定准确　率可达８９％。　胚１０００余枚，移植４０余枚，产犊９头。迄今胚胎　体外生产技术仍在进一步深入探讨，总体技术水　平尚未达到体内胚胎生产的水平。　５．６转基因　１９８０年首例转基因小鼠成功，从而促进了其　它家畜转基因工作的发展，主要侧重在转基因猪　的培育。关于转基因牛的报道甚少，培育转基因牛　的成功率也很低，但人们仍将人生长激素基因导　入奶牛，以提高产奶量和生长速度，改变奶成分和　品质。目前，人们对控制牛经济性状的基因了解甚　少，但在奶牛业中应用转基因技术以改变牛奶成　分的计划，从而可以使转基因奶牛作为生物反应　器来产生医用蛋白质和营养保健品。　在奶牛性别控制领域，ｘ，Ｙ精子分离技术的　成功尚早，而胚胎性别鉴定的分子生物技术方法　已完全成熟。在分子生物技术方法中，Ｌｅｏｎａｒｄ　（１９８７）首次报道用牛Ｙ染色体特异性探针鉴定　牛囊胚性别获得成功，准确率为９５％；Ｈｅｒｒ（１９９０）　首先采用ＰＣＲ技术扩增Ｙ染色体特异性重复序　列鉴定了牛、羊胚胎性别；Ｐｅｕｒａ（１９９１）用ＰＣＲ技　６结束语　奶牛胚胎移植技术作为现代生物技术中的一　项重要的应用技术，日臻成熟。该技术将会加快奶　牛繁殖选育的速度，缩短奶牛生产性能改良所需　时间及世代间隔，充分发挥优秀母牛的遗传和繁　术对牛的部分胚胎进行了鉴定，准确率达９０％～　９５％。目前，人们利用ＰＣＲ对牛的早期胚胎性别　进行了鉴定，该方法的准确率达９４％～１００％，且具　有省时、灵敏度高、特异性专一等优点，对于胚胎　性别鉴定无疑是一个合适的方法。　５．５体外受精　２０世纪８０年代以来，牛体外受精技术已日　趋成熟，为商品化生产牛体外受精冷冻胚胎打下　了良好基础，已在生产中得到部分的应用。据报　道，商品母牛在屠宰前用激素处理，一次可有２０～　５０个卵泡发育，可获得２０～５０个卵母细胞，因而　可更充分地利用卵巢内卵母细胞，进一步挖掘优　良母畜的繁殖能力。近几年，中国学者将体外受精　殖潜力，快速扩大优秀种畜后代群体，培育出更多　符合人们需要的理想的奶牛品种。奶牛胚胎移植　技术在我国的推广应用，将对我国奶牛业的发展、　满足饲养者对良种奶牛的急迫需求发挥重要的作　用。随着对胚胎移植深入研究将会促进各相关学　科的协同发展，使人们更加深入地了解一些生殖　机理，这也将反过来促进胚胎移植技术的进一步　发展，以解决目前还未彻底解决的问题，所以将是　一件很重要也是很有意义的一项工作。　技术应用在转基因牛的研究上，陈永福等在新西　兰利用当地屠宰场提供的卵巢，通过体外受精生　产转基因牛的研究，已累计生产体外受精（ＩＶＦ）　参考文献　（２０篇，略。需要者请与作者或本刊编辑部联　系）　别忘了夏天也要给犊牛降温　成年奶牛并不是唯一受夏季高温影响的，犊牛同样受到热应激的困扰。这种影响的结果是日增重减　少，免疫功能降低，并导致脱水。为了保持犊牛正常而健康的生长发育，美Ｉ￥１￣Ｌ卡罗莱纳州的专家提供了　以下对付犊牛夏季热应激的建议：　・将犊牛圈放在遮荫布下面或置于阴凉处。　・犊牛圈的空间应足够大，以使空气流通良好，要打开所有通风孔；而且，犊牛圈外也要留有一定的　空间。　・可考虑给犊牛圈床铺上沙子，这会比用稻草或橡胶床垫让犊牛感到更凉快；而且，如果保持清洁　与干燥的话，使用沙子还有助于减少蚊蝇。　・任何时候都要给犊牛提供足够而清洁的饮水，从犊牛出生之日起就必须这样做。　［Ｃｈａｒｌｉｅ编译自Ｈｏａｒｄ’ｓ　Ｄａｉｒｙｍａｎ，２００５（７），４６８１