HPLC检测苦参中苦参碱和氧化苦参碱的含量

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二○○九年·第五期

研究报告

HPLC 检测苦参中苦参碱和氧化苦参碱的含量

黄华树 1 叶能胜 1 郝晓丽 1 刘 妮 1 谷学新 1* 范国强 2

(1.首都师范大学化学系 北京 100048

(2.北京同仁堂股份有限公司科学研究所 北京 100011

摘 要 建立 HPLC 法测定苦参中苦参碱和氧化苦参碱含量。色谱柱采用 Aichrom NH 2 (250×4.6mm,5μm ,流动相为乙腈 -乙醇 -3%磷酸溶液 (80∶ 10∶ 10 ,流速 :1.0 mL/min,检测波长 :210nm ,进样量为 10μL ,柱温 :30℃。苦参碱在 0.5~10μg/mL范 围内有良好的线性关系 (r=0.9998,氧化苦参碱在 0.5~10μg/mL范围内有良好的线性关 系 (r=0.9997。苦参碱平均加标回收率为 100.42%(n=5, RSD 为 1.91%; 氧化苦参碱平均 加标回收率为 100.26%(n=5, RSD 为 2.03%。该方法操作简单、重现性好、检测灵敏度、 准确度高, 且样品分离效果好。 本方法适用于苦参药材中苦参碱和氧化苦参碱的含量测定。 关键词 高效液相色谱法 苦参 苦参碱 氧化苦参碱

苦参是常用中药之一,具有清热燥湿、祛风杀 虫、利尿之功效,为临床常用中药,用于热

痢,便 血,黄疸尿闭,赤白带下,阴肿阴痒,湿疹,皮肤 瘙痒疥癣麻风 ; 外治滴虫性阴道炎。苦参植物中主 要含有生物碱、挥发油、黄酮类化合物和脂肪酸。 其中生物碱类的主要药效成分苦参碱和氧化苦参 碱具有抗肿瘤、抗肝纤维化、抗乙肝病毒、对异 常肝细胞凋亡的阻断、平喘和抑菌作用 [1,2]。高 效液相色谱法(High Performance Liquid Chroma-tography , HPLC 是中药质量控制研究中的常用方 法 [3,4],应用 HPLC 法测定苦参中苦参碱和氧化苦 参碱的含量已有报道,田娟 [5]等和汪文来 [6]等分 别用高效液相色谱法测定不同产地的苦参中苦参碱 和氧化苦参碱的含量,灵敏度较高,操作简单,但 是杂质干扰较大。为较好地控制该品种的质量,本 文参考《中国药典》方法,对样品处理方法和色谱 分离系统进行优化,建立高效液相色谱法测定苦参 药材中苦参碱和氧化苦参碱含量的方法,本方法简 便,快速、重现性好,样品分离度好。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

Agilent 1200 Series 高效液相谱仪 (美国 Agi-lent 公司 ; 苦参碱对照品 (批号 : 110805-200507

与氧化苦参碱对照品 (批号 :1100780-200405均为 中国药品生物制品检定所提供 ; 苦参药材购于同仁 堂药店,产地山西 ; 乙腈为色谱纯,水为超纯水 ; 其余试剂均为分析纯。

1.2 色谱条件

色谱柱 :AichromNH 2(250×4.6mm,5μm ,流 动相 :乙腈 -乙醇 -3%磷酸溶液 (80∶ 10∶ 10 , 流速 :1.0mL/min,检测波长 :210nm ,进样量为 10μL ,柱温 :30℃,色谱图(见图 1

。

图 1 标准品、苦参样品及样品加标色谱图

A 苦参碱、氧化苦参碱标准品 ; B 样品 ; C 样品加标苦参碱 1. 苦参碱(matrine ; 2. 氧化苦参碱(oxymatrine

1.3 对照品溶液的制备

准确称取苦参碱和氧化苦参碱各 5.0mg ,分别 置于 5mL 容量瓶中,加乙腈 -乙醇 -3%磷酸溶液 (80∶ 10∶ 10 ,制成浓度为 1.0mg/mL的对照品 溶液。

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1.4 供试品溶液的制备

取苦参药材,剪碎,准确称取 5.1g ,加入 40 mL70%乙醇, 90℃恒温水浴提取 2次,每次 2h , 合并提取液,过滤待用。准确移取提取液 1mL ,通 过中性氧化铝柱 (100~200目, 2g ,内径 1cm , 依次以三氯甲烷、三氯甲烷 -甲醇 (7∶ 3 各 4mL 洗脱,收集洗脱液,回收溶剂至干后,加乙醇适量 使溶解,并转移至 25mL 容量瓶中,加乙醇稀释至 刻度,摇匀,作为供试品溶液。进样前用微孔滤膜 (0.45μm 过滤。

1.5 浓度曲线测定

准确移取苦参碱和氧化苦参碱的对照品储备溶 液,用流动相稀释,分别制成浓度为 0.5μg/mL、 1.0μg/mL、 2.0μg/mL、 4.0μg/mL、 6.0μg/mL、 8.0μg/mL、 10.0μg/mL苦参碱和氧化苦参碱的对 照品溶液,进样测定。以峰面积为纵坐标,苦参碱

和氧化苦参碱浓度为横坐标作标准曲线,并得到苦

参碱的回归方程为 :Y=26.326X+0.0579, r=0.9998;

氧化苦参碱的回归方程为 :Y=11.653X–3.112, r= 0.9997。表明苦参碱和氧化苦参碱在 0.5~10μg/mL

质量浓度范围内有良好线性关系。以信噪比 S/N=3计算方法检出限,苦参碱与氧化苦参碱含量的检出 限分别为 0.08μg/mL和 0.20μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的选择

表 1 不同浓度乙醇及不同方法提取效果比较

超声

冷浸 恒温水浴回流

30%乙醇 2.04%1.81%2.19%50%乙醇 2.15%1.87%2.30%70%乙醇

2.22%

1.88%

2.36%

注:表中参考数值为苦参药材中苦参碱与氧化苦参碱总碱的百分含量

取 同 一 份 供 试 样 品 溶 液, 分 别 于 0.5h 、 1h 、 2h 、 4h 、 8h 、 12h 、 24h 按色谱条件测定, 以苦参碱、

氧化苦参碱峰面积计算,

RSD 分别为 1.93%、 1.03%, 表明供试样品在 24 h内稳定。 2.3 精密度试验

取同一批药材,准确称取 6份样品,分别制备 6份供试溶液,按上述方法平行测定苦参碱、氧化 苦参碱含量(见表 2 , RSD 分别为 1.71%、 1.55%(n=6 ,表明本方法精密度较好。

1.71

1.55

2.4 重现性试验

由不同的人员,按上述样品制备方法及色谱条

件,重复测定同一批样品 6次,结果苦参碱、氧化 苦参碱的 RSD 分别为 2.43%和

1.99%(n=6 ,表 明本法重现性较好。 2.5 回收率试验

采用加标回收法,取 6份样品,准确称定,分 别加入苦参碱、氧化苦参碱对照品,按样品溶液的 制备方法制备待测样品,每个样品平行测定 3次, 取平均值,计算回收率(见表 3, 4 。

表 3 苦参碱回收率测定结果

加入苦参 碱量(μg 实测总量 (μg

回收率 (% 平均回收 率(%

RSD (%

02.03-100.42

1.91

6.40

100.46

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2.6 样品测定

取山西产苦参药材,分别制备 5份样品,进样 测定(见表 5 。苦参中含苦参碱、氧化苦参碱的 平均百分含量分别为 0.082%、 2.28%, RSD 分别 为 1.80%、 1.66%。

表 5 样品测定结果(n=6 苦参药材样品中苦 参碱的含量(%

苦参药材样品中氧化 苦参碱的含量(%

1.80

1.66

3 结论

建立高效液相色谱法测定苦参药材中苦参碱与 氧化苦参碱含量的方法,样品前处理采用中性氧化 铝柱预分离被测组分和杂质,以乙腈 -乙醇 -3%磷 酸溶液 (80∶ 10∶ 10 为流动相,样品中各组分 能达到完全分离(见图 1B 。由于标准品和样品溶 液中溶剂组分不同,导致实验中样品待测组分的保 留时间和标准品略有差别,经过加标实验后,确认 样品色谱图中的 1号峰与 2号峰分别是苦参碱与氧 化苦参碱(见图 1C 。杂质对测定无干扰,检测结 果符合药典规定,方法学考察表明,本方法简便, 快速、重现性好,样品分离度好,可作为苦参药材 中苦参碱与氧化苦参碱含量测定的参考方法。

参考文献

1 郑虎占, 董泽宏, 佘靖等 . 中药现代研究与应用, (第三卷 [M],北京 :学苑出版社 , 2008

2 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典, (一部 [S] , 北京:化学工业出版社, 2005

3 张丽娟,贾俊,王海等 . 现代仪器分析技术在中药领域中 的应用 [J],现代仪器, 2008, (6:6~94 武凌艳, 贾俊, 王海等 . 清咽润喉丸质量控制方法研究 [J], 现代仪器, 2007, (6:40~43

5 田娟,王智民,王维皓等 . HPLC 测定苦参药材中苦参碱 和氧化苦参碱的含量 [J],中国实验方剂学杂志, 2006, 12(2:23~25

6 汪文来,赵红霞,贾海骅等 . HPLC 法测定不同产地苦参 中苦参碱和氧化苦参碱的含量 [J],中国中医基础医学杂 志, 2007, 13(10:799~801

Determination of matrine and oxymatrine in sophora flavescens by HPLC

Huang Huashu1 Ye Nengsheng1 Hao Xiaoli1 Liu Ni1 Gu Xuexin1* Fan Guoqiang2

(1. Department of Chemistry, Capital Normal University , Beijing 100048 (2. Research Institute , Tongrentang Group Co. Ltd. , Beijing 100011

Abstract A high performance liquid chromatography (HPLC method was established to determine the contents of matrine and oxymatrine in Sophora flavescens Ait . Aichrom NH2 (250 × 4.6 mm , 5 μm , acetonitrile -ethanol -3 %phosphoric acid (80∶ 10∶ 10 as the mobile phase, with a detection wavelength at 210 nm. The flow rate was 1.0 mL/min. The injection volume was 10 μL, and the column temperature was set at 30 ℃ . The calibration curves of matrine and oxymatrine were in good linearity over the rang of 0.5~10 μg/mL ( r=0.9998 and 0.5~10 μg/mL ( r= 0.9997. The average recovery were 100.42%, 100.26%, and RSD were 1.91 %, 2.03% (n = 5 for matrine and oxymatrine. The method is simple, and accurate, and can be used for the determination of matrine and oxymatrine in Sophora flavescens Ait.

Key words HPLC Sophora flavescens Ait matrine oxymatrine

表 4 氧化苦参碱回收率测定结果

加入氧化苦参 碱量(μg 实测总量 (μg

回收率 (% 平均回 收率(% RSD (%

058.36-100.26

2.03

85.34

100.30