骨髓间充质干细胞移植对急性心梗大鼠能量代谢关键酶的影响

文章编号:

1001󰀁6325(2009)03󰀁0238󰀁04

基础医学与临床

Basic&ClinicalMedicineMarch2009Vo.l29󰀁No.3

研究论文󰀁

骨髓间充质干细胞移植对急性心梗大鼠能量代谢关键酶的影响

李󰀁望,胡盛寿,魏英杰

1

1

1*

,张󰀁浩,候剑锋,叶󰀁波

112

(中国医学科学院北京协和医学院1󰀁阜外心血管病医院卫生部心血管疾病再生医学重点实验室,北京100037;

2󰀁肿瘤医院胸外科,北京100021)

摘要:目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对急性心梗的大鼠心肌组织中能量代谢关键酶的影响。方法SD大鼠

18只,随机分为假手术对照组、急性心梗组及MSCs移植组。应用ELISA检测大鼠左心室组织中己糖激酶(HK)、肉毒碱脂酰转移酶(CACT)、脂酰辅酶A合成酶(ACS)、柠檬酸合成酶(CS)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量及活性。结果大鼠心梗后1d左心室组织中CACT、ACS、CS和LDH的含量下降、HK的含量和活力增加(P<0󰀁05或P<0󰀁01)。在经过MSCs移植后上述酶的水平基本恢复。结论急性心梗后左心室组织能量代谢的关键酶发生变化,MSCs移植对这种能量代谢的异常变化具有一定的改善作用。

关键词:骨髓间充质干细胞;移植;心肌梗死;关键酶

中图分类号:R2󰀁22󰀁󰀁文献标志码:A

TransplantationofMSCsanditsimpactontheenergymetabolismenzymes

inacutemyocardialinfarctionrat

LIWang,HUSheng󰀁shou,WEIYing󰀁jie,ZHANGHao,HOUJian󰀁feng,YEBo

2󰀁DivisionofThoracicSurgery,CancerHospita,lPUMC&CAMS,Beijing100021,China)

1

1

1*

1

1

2

(1󰀁KeyLaboratoryofCardiovascularRegenerativeMedicine,CardiovascularInstituteandFu󰀁WaiHospita,lPUMC&CAMS,Beijing100037;

Abstract:Objective󰀁ToinvestigatetheeffectsoftransplantationofMSCsonenergymetabolismenzymesafteracutemyocardialinfarction(AMI).Methods󰀁EighteenSDratswererandomlydividedinto3groups(n=6respec󰀁tively):controlgroup,acutemyocardialinfarctiongroupandMSCsgroup.TheleftventriculartissueofratswasisolatedonedaylaterafterleftanteriordescendingarteryocclusionfordeterminationofHK,CACT,ACS,CS,LDHbyELISA.Results󰀁OnedayafterAMI,theconcentrationandactivityoftheseenzymeschangedobviously(P<0󰀁05~P<0󰀁01).OnedayafterMSCstreatmen,tbothconcentrationandactivityofthoseenzymesreturnedtonormallevels.Conclusion󰀁ThetransplantationofMSCsmayimprovecadiocyte󰀁senergeticsbyregulatingtheconcentrationandactivityoftheenzymes.

Keywords:mesenchymalstemcells;transplantation;myocardialinfarction;keyenzymes󰀁󰀁心血管病的发病率和死亡率呈快速上升趋势,而且越来越年轻化。在心血管疾病中,缺血性心脏

收稿日期:2008-07-08󰀁󰀁修回日期:2008-09-23基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2006AA02Z4B8)

*

病威胁最大,占心血管疾病死亡率的50%

[1]

。近年

来,骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,

通信作者(correspondingauthor):weiyingjie@yahoo.com

2009󰀁29(3)基础医学与临床󰀁󰀁Basic&ClinicalMedicine

239

MSCs)移植在治疗心肌梗死方面倍受关注。MSCs移植对梗死后的心脏具有许多有益的保护作用改变,心肌中的能量减少

[3]

[2]

做横切口开胸,暴露心脏,剪开心包,在肺动脉圆锥与左心耳交界稍下1~2mm处用无创线缝线结扎左冠状动脉前降支,造成左室前壁急性心肌梗死(以结扎部位以下心肌变白,搏动减弱为造模成功)。立即膨肺,关胸。

1󰀁2󰀁4󰀁动物分组及细胞移植:(1)动物分组:将18只8周龄大鼠随机分成3组:󰀁假手术对照组(将大鼠开胸后仅在左冠状动脉下穿线但不结扎);󰀁单纯心梗组;󰀁细胞移植组,每组6只大鼠。(2)细胞移植:选择生长良好的第3代细胞用DAPI标记,制成每管50󰀁L的细胞悬液置于冰上备用。立即制作大鼠急性心梗模型,在冠状动脉前降支结扎后约1h,直视下于梗死周边区用微量注射器植入50󰀁L的MSCs悬液,关胸,维持呼吸机辅助呼吸至自主呼吸恢复。1󰀁2󰀁5󰀁心脏标本处理测定:细胞移植后1d,腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠,打开腹腔后在下腔静脉注射2mLKCl溶液。待心脏停跳后立即取出心脏。冲洗干净后取下左心室组织。假手术对照组的大鼠及单纯心梗组的大鼠在上述相同的时间点取左心室组织,存放于液氮中待检测CACT、ACS、CS、HK和LDH的浓度及HK和LDH活性。做病理分析的大鼠在取下心脏后立即用OCT冰冻切片包埋剂包埋,冷冻于-20󰀁留做冰冻切片病理分析。1󰀁3󰀁统计学分析

结果以x󰀁s表示,采用SPSS软件处理实验数据,组间比较用t检验分析。

󰀁

。

心肌梗死后由于心肌组织缺血缺氧,能量代谢发生

。本实验检测了大鼠在

急性心梗后以及经过MSCs移植后左心室组织中能量代谢的关键酶的变化。

1󰀁实验

1󰀁1󰀁材料

DMEM(Dulbecco󰀁sModifiedEagle󰀁sMedium)高糖培养基(吉诺生物医药技术有限公司)。4,6󰀁联脒󰀁2󰀁苯基吲哚(4,6󰀁diamidino󰀁2-phenylindole,DAPI,Promega公司)。特优级胎牛血清(GibcolBRL公司)。大鼠己糖激酶(hexokinase,HK)、肉毒碱脂酰转移酶(carnitine󰀁acylcarnitinetranslocase,CACT)、脂酰辅酶A合成酶(fatty󰀁acyl󰀁CoAsyn󰀁thetase,ACS)、柠檬酸合成酶(citratesynthase,CS)、乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase,LDH)ELISA分析试剂盒(USCNLIFE公司)。1󰀁2󰀁方法

1󰀁2󰀁1󰀁MSCs的分离、纯化、扩增培养:采用SPF级雄性SD大鼠[2~3周龄,体质量40g,合格证号SCXK(京)2006󰀁0008,购自北京市维通利华实验动物技术有限公司]断头处死后立即用75%乙醇浸泡3~5min。剪开动物腿部皮肤,分离腿部肌肉,取出股骨和胫骨。用完全培养液缓慢冲出骨髓腔中的细胞。将冲出的细胞直接种到塑料培养瓶中。原代培养24h换液。4~5d细胞可达到70%~80%汇合,0󰀁25%胰蛋白酶消化,以1󰀁3传代。

1󰀁2󰀁2󰀁细胞移植准备:移植前24h,将DAPI溶于无血清培养基中,避光备用。在细胞培养瓶中加DAPI溶液前先将细胞换1次液,加入DAPI溶液使其在培养基中的终浓度为50mg/L。避光孵育30min,用无血清细胞培养基洗去细胞培养瓶中未结合的DAPI,荧光显微镜(Nikon公司)观察。采用0󰀁25%的胰蛋白酶消化,收集细胞,离心后每1󰀁0󰀁10个细胞溶于50󰀁L无血清细胞培养基中。

1󰀁2󰀁3󰀁大鼠心肌梗死模型的建立:将SPF级8周龄SD大鼠(体质量250~300g,)用10%水合氯醛按3mL/kg腹腔注射麻醉。气管插管后接人工呼吸机正压辅助呼吸。于大鼠左胸第4肋骨󰀁第5肋骨间

6

2󰀁结果

2󰀁1󰀁MSCs形态学观察

MSCs体外培养2d出现少量多角型贴壁细胞,14d细胞铺满瓶底,呈扁平多角形(图1)。荧光显

图1󰀁细胞培养14d

Fig1󰀁MSCson14thday(󰀁40)

240

基础医学与临床󰀁󰀁Basic&ClinicalMedicine2009󰀁29(3)

微镜下DAPI标记细胞呈蓝色单核细胞(图2)。

表1󰀁左心室组织中CACT、ACS、CS、HK、LDH󰀁󰀁

浓度的变化

Table1󰀁Changeofenzymeconcentration

󰀁󰀁󰀁󰀁(󰀁x󰀁s,U/mL,n=6)

groupABC

*

CACT39󰀁528󰀁5*36󰀁6#

**

*

ACS30󰀁621󰀁5*28󰀁4#

CS15󰀁5󰀁7󰀁1*

*

HK56󰀁13

LDH󰀁530󰀁30

*

79󰀁18*󰀁2󰀁71*59󰀁10#󰀁520󰀁79##

##

##

10󰀁2

P<0󰀁05,P<0󰀁01comparedwithAgroup;#P<0󰀁05,P<0󰀁01

comparedwithBgroup

图2󰀁MSCs经DAPI体外标记Fig2󰀁MSCslabeledwithDAPI(󰀁100)

A󰀁controlgroup;B󰀁acutemyocardialinfarctiongroup;C󰀁MSCsgroup

表2󰀁MSCs移植对实验性心肌梗死大鼠左心室󰀁󰀁组织中HK、LDH活力的影响

Table2󰀁Changeofenzymeactivity(󰀁x󰀁s,U/g,n=6)

groupABC

*

2󰀁2󰀁大鼠心肌梗死模型的制备

大鼠冠状动脉左前降支结扎后的心脏左室颜色变灰暗,搏动减弱。将心脏取下后肉眼可见明显的梗死区,与正常未梗死的心肌组织区别明显(图3)。

HK

󰀁󰀁0󰀁009󰀁0󰀁002󰀁󰀁0󰀁143󰀁0󰀁004*󰀁󰀁0󰀁014󰀁0󰀁002

**

LDH

󰀁󰀁󰀁0󰀁498󰀁0󰀁105

*

󰀁󰀁󰀁0󰀁287󰀁0󰀁211

*

󰀁󰀁󰀁0󰀁528󰀁0󰀁266

P<0󰀁05,P<0󰀁01comparedwithAgroup

A󰀁controlgroup;B󰀁acutemyocardialinfarctiongroup;C󰀁MSCsgroup

图3󰀁制备大鼠心肌梗死模型

Fig3󰀁Myocardialinfarctionmodelwasinduced󰀁󰀁󰀁

intherats

图4󰀁MSCs植入1d时的组织切片

Fig4󰀁HistoricalsectionshowedtransplantedMSCs󰀁󰀁󰀁

labeledwithDAPI(󰀁400)

2󰀁3󰀁ELISA检测

大鼠在心梗后1d左心室组织中的CACT、ACS、CS、LDH含量减少,而HK含量增加,在经过MSCs移植之后上述酶的含量基本恢复(P<0󰀁05)(表1)。

与假手术组大鼠对比,单纯心梗组的大鼠在心梗1d时左心室组织中的HK的活力显著增强,LDH的活力显著下降(P<0󰀁05)。而经过MSCs移植之后HK、LDH的活力有恢复的趋势(表2)。2󰀁3󰀁组织病理学分析

冰冻切片荧光显微镜检测到DAPI标记的MSCs已经成功移植至大鼠心肌的梗死周边区(图4)。

3󰀁讨论

心肌主要通过糖酵解和氧化磷酸化代谢途径产生能量。一般情况下,心肌活动所需能量的60%~90%来自游离脂肪酸量由碳水化合物提供

[4-5][4-5]

,另外的10%~40%的能。有研究发现

[6]

,细胞缺

血缺氧时伴随能量和底物利用的改变,高能磷酸盐的含量减少。Stanton等

[7]

用基因芯片研究了大鼠

心梗前后基因的变化,发现心肌中脂肪酸代谢有关

2009󰀁29(3)基础医学与临床󰀁󰀁Basic&ClinicalMedicine

[8]

241

的基因在心梗后持续下调。有研究者检测了大MSCs移植能够改善心脏的能量代谢,从而促进了心肌细胞能量的产生。这为进一步研究MSCs移植治疗心肌梗死提供了可靠的实验依据。

近年来有研究报道

[9]

鼠急性心梗前后的心梗交界区的基因表达谱差异,发现大量的能量代谢相关基因表达异常。由于生命活动的直接执行者是蛋白质,心肌梗死后以及经过MSCs移植后心肌组织的能量代谢途径中的关键酶在蛋白水平怎样变化,这在国内外还没有研究过。

本实验检测了大鼠急性心梗后左心室组织中LDH、HK、ACS、CACT和CS蛋白水平的变化。发现大鼠心肌梗死后1d时左心室组织中LDH、ACS、CACT和CS的含量明显减少,HK的含量明显增加。而在经过MSCs移植治疗后1d其含量基本恢复至正常水平。HK和LDH的活力与其含量的变化相一致。实验结果说明,在大鼠急性心梗后有氧代谢的关键酶表达下调,而无氧糖代谢的关键酶上调,经过

,MSCs移植入心梗大鼠

梗死区后3个月才能检测到部分心肌细胞及血管内皮细胞表型,而全部表型的出现则需6个月的时间。本实验检测到干细胞移植治疗心梗后1d心肌能量代谢得到一定的改善。由此推测,此效果不大可能是由于干细胞促进血管新生作用,其机制可能是MSCs的旁分泌作用参与了早期能量代谢的改善。MSCs在移植的心脏的部位分泌了哪些改善能量代谢的细胞因子?这些细胞因子在改善心肌能量代谢的过程中是怎样发挥作用的?这些问题有待我们更加深入的研究。

参考文献:

[1]朱洪生,黄日太,连锋,等.骨髓间质干细胞移植对香猪

急性心肌梗死后心肌结构和心功能的影响[J].中国胸心血管外科临床杂志,2004,11:112-115.

[2]AmadoLC,SaliarisAP,SchuleriKH,etal.Cardiacrepair

withintramyocardialinjectionofallogeneicmesenchymalstemcellsaftermyocardialinfarction[J].ProcNatlAcadSciUSA,2005,102:11474-11479.

[3]HuQingsong,WangXiaohong,LeeJ,etal.Profound

bioenergeticabnormalitiesinperi󰀁infarctmyocardialregions[J].AmJPhysiolHeartCircPhysio,l2006,291:H8-H657.

[4]StanleyWC,LopaschukGD,HallJL,etal.Regulationof

myocardialcarbohydratemetabolismundernormalandis󰀁chaemicconditions.Potentialforpharmacologicalinterven󰀁tions[J].CardiovascRes,1997,33:243-257.

[5]VanderVusseGJ,GlatzJF,StamHC,etal.Fattyacidho󰀁

meostasisinthenormoxicandischemicheart[J].PhysiolRev,1992,72:881-940.

[6]DashRK,LiY,KimJ,etal.Modelingcellularmetabolism

andenergeticsinskeletalmuscle:large󰀁scaleparameteresti󰀁mationandsensitivityanalysis[J].IEEETransBiomedEng,2008,55:1298-1318.

[7]StantonLW,GarrardLJ,DammD,etal.Alteredpatternsof

geneexpressioninresponsetomyocardialinfarction[J].CircRes,2000,86:939-945.

[8]张会亮,张荣利,罗,等.大鼠心肌梗死急性期缺血

交界区基因表达谱特征[J].医学研究杂志,2006,35:11-33.

[9]DaiW,HaleSL,MartinBJ,etal.Allogeneicmesenchymal

stemcelltransplantationinpostinfarctedratmyocardium:short󰀁andlong󰀁termeffects[J].Circulation,2005,214-223.

112: