实验2012年09级食科食品发酵与酿造工艺技术实验

实验时间：第一次实验 第9周，周二、三、四下午(2:40)

第二次实验 第9周，周日上午8:00, 下午3:00, 晚上7:30 第三次实验 第9周，周二、三、四下午(2:40)

第一次实验

实验一 固体酶制剂的制造 实验二 黄酒酿造试验

第二次实验

实验三 黄豆制酱曲 实验四 果酒的酿造试验

第三次实验

实验五 大豆酱酿造实验 实验六 酸奶的制作

实验一 果酒的酿造实验

一、目的：通过实验初步掌握一般果品酿酒方法及新酒精含量、残糖含量测定方法。

二、1．原理：一切果品都含有糖分，只要予以适当处理都能酿酒。果汁中的可发酵糖经过

酵母的酒精发酵产生酒精，存在于果汁中，并成为营养丰富的果酒。 酵母菌

C6H12O6 酸性条件 2C2H5OH + 2CO2

2．果酒生产总的工艺流程图

水果

酵母菌种 分选

试管 洗涤

三角瓶 SO2 破碎

卡氏瓶 果汁 压榨 果渣

1

酒母瓶 主发酵 白砂糖 自然发酵 换池 酒脚 蒸馏 果渣 饲料

后发酵 水果白酒

SO2 新酒

陈酿

冷冻

加入水果白酒 杀菌 过滤 调配 柠檬酸 装瓶 成品酒 白糖

3．空白试验：

100ml凉开水加一瓶酵母（已消毒的500ml的三角瓶中进行），摇匀，加棉塞，称重，并记录重量。 4．管理：

酵之日起，每隔一天称重一次，直到恒重（即两次重量差小于0.5g），恒重时，称空白试验的重量，并记录。

5．果酒的分类：果酒一般以所用的原料来命名，如苹果酒、梨酒、荔枝酒、山楂酒等。 分类方法一般有三种：依酿制方法分类、依果酒中含糖量、依果酒中所含酒精量进行分类。

（1） 依酿制方法分，可分为四类：

① 发酵酒：用果浆或果汁经酒精发酵而酿制成的果酒。

② 蒸馏酒：水果发酵后，再经蒸馏所得的酒为蒸馏酒，如白兰地。

③ 露酒：用果实、果汁或果皮加入酒精浸泡取其清液，再加入糖和其他配料勾兑

而成的果酒称为露酒，也称配制酒。 ④ 汽酒：含有二氧化碳的果酒属此类。 （2） 依果酒中含糖量多少也可以分为四类：

① 干酒：含糖0.4g/100ml以下。 ② 半干酒：含糖0.4～1.2g/100ml。 ③ 半甜酒：含糖1.2～5g/100ml。 ④ 甜酒：含糖5g/100ml以上。 （3） 依果酒中酒精含量分可分为：

① 低度果酒：含酒度17度以下。 ② 高度果酒：含酒度18度以上。

三、材料

1.果酒酵母Ａs2.346 1管。 2.木瓜0.5斤。 3．白砂糖。

4．柠檬酸及CaCO3。

2

四、方法

1、 工艺流程及操作

木瓜 剥皮 榨汁 果汁 改良

果渣 制白兰地 加酵母5%

含糖25%、酸0.5% 20~25℃ 装瓶（每瓶约200毫升） 主发酵 换瓶去沉渣 约PH4~4.5 15天

10~15℃ 5天后密闭

后发酵 换瓶，去沉渣 调制 陈酿 装瓶 1个月 （1年以上）

杀菌 成品

2、操作说明：

12~16小时 （1）酒母制备

°B′8°曲汁15毫升 装管 接As2.346 酒母（或酒曲+果汁）。 25~28°C

（2）制桔子酒，果实压榨时注意勿过多压碎种子，以免给果汁带来苦味物质。

（3）用波美剂测定果汁含糖量，用白砂糖将果汁调糖至25%，用试纸测酸，调酸至0.5%，酸不足用柠檬酸补，酸过量用CaCO3中和。

（4）果汁加酒母后应称重量体积，主发酵完成换瓶去渣后也要称重量体积。 （5）加酒母12小时后开始进入主发酵，旺盛期为5天，第5天以后即启封。

（6）若制荔枝酒，荔枝含糖量高，含酸适宜，可不调糖酸，为增加果汁单宁含量需加入经洗净灭菌的荔枝壳（用酒精精泡过）3%，发酵旺盛期（3~4天）一过可捞出荔枝壳，以免色泽太深，主发酵期约7天可完成，主发酵完成后即密封。

（7）因时间关系酿造过程到主发酵完成为止，以下工艺过程由实验管理员完成。

（8）按时观察，处理样品，作好记录。果汁接种后即称重，以后每天称重一次，直到衡重为止。

（9）每组做一空白样对照。CO2量=W第一天—W最后一天—W水 三、记录及计算结

操 接种后第一天称重 第三天 第五天第六天称第七天 试 作 （△重+酒母+果汁） 称重 称重 重 称重 …… 样 （g） （g） （g） （g） （g） 1 第n天称重 （g） 3

2 对照 （空白） 项 目试 样 1 2 果汁 重量 体积 含糖量 （g） （ml） （%） 主发酵完成后新酒液 酸含量 重量 体积 酒精含残酒含（%） （g） （ml） 量（%） 量（ml） 备注 附说明：

1、果汁调糖计算：

°B′e20℃=°B′et + 0.05（t-20）

式中：°B′e20℃ 标准温度20℃下的波美度 °B′et t℃测得的波美度 t 测定温度

糖度°Bx=1.8 B′e20℃ –3（3为果汁含有的非糖浸出物）

果汁重（g）×（25%－°Bx） 加糖量= 1－25%

2、由CO2量计算酒精含量和残糖含量的方法 C6H12O6 2C2H5OH＋2CO2 180 2×46 2×44

CO2量=第一天称重－最后一次称重－水分蒸发量

180×CO2量 可发酵性糖=

2×44

4

46×CO2量 酒精量=

44

新酒精量（g）

酒精百分含量= ×100（g/100ml） 新酒精体积（毫升）

残糖总量=果汁总含糖量－可发酵性糖量

残糖总量

残糖含量（g%）= ×100 新酒精重量

五、作业

1、 计算CO2量（g）、酒精百分含量（g/100ml）、残糖百分含量（g/100ml）。 2、 对实验结果进行分析。

实验二 黄酒酿造实验

一、目的

通过实验，掌握纯种根霉制造甜米酒药的方法及淋饭法酿制甜黄酒的方法。 黄酒是我国的民族特产，制法和酒的风味都有独特之处，与世界上其它酿造酒有明显的不同。由于黄酒的酒度较低，香气好，味醇厚，并且营养丰富，素为我国人民所喜爱，也获得国外消费者的好评。 二、原理

糯米淀粉经米根霉中的淀粉糖化酶的作用，分解为可发酵糖和较多的不可发酵的糊精和低聚糖，米根霉中含有的酒化酶利用可发酵性糖产生酒精，从而得香甜醇厚的甜酒酿，再在甜酒酿中加以适量的米烧酒泡制而酿成甜黄酒。 三、材料

1、米根霉As3.866或As3.851 1管菌种 2、麸皮 20g 3、米粉 100g 4、糯米 200g 5、53°米烧酒 80g 四、甜米酒药制造 （一）工艺流程

30℃ 30℃ 30℃ 38℃

根霉斜面试管 三角瓶 米粉 含水酒药 3～4天 2～3天 30小时 干燥

成品酒药

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（二）工艺操作

1、斜面试管培养基：一般为麦芽汁或米曲汁加2%洋菜。1公斤/厘米2蒸汽压灭菌15～20分钟。

2、三角瓶培养基：麸皮加50%水（有的还加少量饴糖），1公斤/厘米2蒸汽压灭菌60分钟。 3、米粉：普通机米粉（30～40目筛）于130℃干热灭菌60分钟。

4、试管斜面培养的根霉菌种，待菌丝长满斜面后，即可转接到500毫升三角瓶（内装20g麸皮加水50～60%）进行法培养，一支试管二瓶，待菌丝接饼后（约30小时左右），把三角瓶倒置过来继续培养，直到菌丝长满结束。三角瓶培养的曲种以0.5%的接种量拌入米粉中（米粉加水40～50%），在30℃培养30小时，米粉即结块成饼，之后切成方块在28℃下进行干燥即为成品甜药酒。

（一） 工艺流程： （二）

糯米 冲洗干净 浸泡24小时 清水冲洗几次 常压蒸煮

米饭熟而不烂 凉水冲至室温 淋去多余水分 加甜酒药，拌匀

入缸搭窝 培菌发酵 加水冲缸

30℃ 加米烧酒

甜酒酿 发酵 封缸陈酿 压榨 灭菌 成品 36小时 1个月

（二）工艺操作

1、蒸饭：先将糯米（粳米或好机米）用水冲洗干净，然后浸泡24小时，浸米过程中米的吸水率为35～40%，浸米后再用清水冲洗几次，放在容器中蒸30～40分钟，蒸熟的米饭应熟而不烂，光而不毛，手捏之软而不粘，内无生心，蒸米过程中的吸水率为14～16%。 称米饭，计算糯米的出饭率

2、入缸搭窝：蒸好的米饭再用凉开水冲洗至室温，淋去多余的水后，按糯米原料置添加甜米酒药，每1kg糯米加酒药0.5～1g，拌匀后放入洁净的容器中，中间留个洞，盖好。 3、培养发酵：入缸搭窝后，放于30℃培养箱中，约经36小时培养发酵，即得甜酿，在这段时间内，根霉得以大量繁殖，大部分淀粉被糖化，并产生了少量的酒精，待窝内甜液满4/5高。就可加水冲缸，使醪液浓度稀释，以利于酶的作用。加水比为1：1。

4、发酵：加水冲缸后，多量残余淀粉得以继续糖化，可发酵性糖得以进一步转化为酒精，约经4天的发酵，即可加入160g 53°的米烧酒（以提高酒度），继续发酵。

5、封缸陈酿：发酵1个月后，封缸陈酿，使其风味趋以完善，陈酿时间约7天，经压榨，灭菌（煎酒）便得成品。

出饭率=米饭的重量/白米的重量 ×100%

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实验三 凝固型酸奶的制作

发酵乳品种类：

 活菌制品：凝固型酸乳，搅拌型酸乳，人工酪乳，活性乳酸菌饮料，嗜酸菌乳，双

歧杆菌发酵乳;

 无菌制品：乳酸菌素、酸奶饮料；

 乳酸菌、酵母菌混合发酵制品：牛奶酒，马奶酒

所谓乳酸菌并不是分类学名词，而是能发酵各种糖类产生乳酸的细菌的统称，它们主要是一些乳杆菌、乳球菌和链球菌等。

 酸奶：酸奶以动物奶为原料，经乳酸菌发酵而制成的乳制品 。

 动物乳液经适当的微生物发酵后不仅风味优良独特，营养更丰富，而且还具有某些

疗效。在酸奶制造中起作用的主要是一些乳酸细菌。它们中一些种除产生乳酸外，还可产生双乙酰、乙醛、乙醇、乙酸、丙酮、二羟基丁酮等，可赋予酸奶制品以特殊的酸、香风味，以及提供“低乳糖乳品”

酸奶种类

 按凝乳状态：凝固型酸奶，搅拌型酸奶，  按脂肪含量：全脂酸奶（脂肪>3.0%），半脱脂酸奶（1～3%）、脱脂酸奶（＜1.0%）  按风味分：普通酸奶，风味酸奶，果料酸奶。

1、基本原理

 乳酸菌在乳中生长时可发生一系列生物化学变化，由β-半乳糖苷酶将如乳糖分解为

葡萄糖和半乳糖，葡萄糖进一步发酵生成乳酸，产酸量达到一定程度，便使乳中钙-酪蛋白-磷酸复合物稳定性破坏，酪蛋白（约占3%左右）变性凝固，而导致全部乳液凝固；

 另外，过程中还会产生双乙酰，3-羟基2-丙酮，乙醛，丙酮，乙酸等；

 以及蛋白质轻微降解定生一定量肽、氨基酸和芳香物质。脂肪也有轻度的降解，产

生脂肪酸及其它呈味物质，这些物质共同构成酸乳特有的风味。  酸乳的价值在于其风味、营养，乳酸菌及其所产的乳酸。 2、一般工艺

 原乳、糖等原料混合→预处理（过滤、打浆、预处理等）→灭菌→均质→冷却→接

种（之前菌种→活化→发酵剂）→分装→保温发酵→冷藏后熟→成品

(1)原料乳：

 使用生鲜牛乳一定要新鲜，品质好，酸度在180T以下，不使用初乳，一定不能含

有抗生素或消毒剂，否则会妨碍乳酸菌生长，影响发酵。据报道，乳中0.1mg/ml的青霉素也会影响乳酸菌的生长发育；

 使用乳粉也要求原乳新鲜度好，不能含有抗生素，一般要按比例加水复原，复原后

要求：

非脂乳固体> 8.7%,其中蛋白质为3.3%～3.8%，脂肪3.0%为佳，为增强非脂乳固体，使凝固结实，可添加脱脂乳粉1～3.5%

(2）砂糖 ：应纯正，无异味杂质，主要提供产品的合甜酸比，一般加量6-8%(M/V)。

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2.2 灭菌

 按所用原料而异，一般灭菌90～95℃，5～10min 或者 80～90℃,20～30min。加热

的作用一可以杀菌，二可以驱氧，有利于乳酸菌生长，因其是偏向厌氧的。  若采UHT灭菌,则最佳条件是：135℃,2～5 s 2.3 均质

 待冷至70℃左右，于20～30Mpa下均质一次或者二次，可使原料中乳颗粒均匀、细

腻，防止乳脂肪上浮，使成品质地细腻，口感稠厚。  本工序是保证酸奶口感良好的重要步骤。 2.4 接种

 此工序对品质影响很大。关键是菌种、菌株的选择，菌株产酸、产香活力等因素。  菌种：目前多用混合菌种，大多是同型乳酸发酵菌，如：  L. bulgaricus与S. thermophilus（1：1）；  L. lactis和L. cremoris（1：1）；  S. lactis与L. acidophilum等。  菌种特性：

 L. bulgaricus(保加利亚乳杆菌)： 发酵乳糖，葡萄糖，果糖， 不发酵蔗糖、半乳糖、

麦芽糖，

 S. thermophilus(嗜热链球菌)：发酵乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖，不发酵麦芽糖。

 接种前一般要先对保藏菌种（斜面或者乳液管）分别用10%脱脂乳培养基活化2～4

次，使活力达0.4以上（即含酸量0.4%），然后再接种发酵；

 保加利亚乳杆菌：一般在42-45℃下培养12h，至牛乳凝固结实即可。  嗜热链球菌：一般在37-42℃下培养12-14h，至牛乳凝固结实即可。

 两菌种分别活化后，再分别接种，使总接种量为2～5%（生产上接种比例稍高些）。  使用混合菌种可以利用菌种间共生作用和拮抗作用，从而提高产酸力和风味形成力。  一般链球菌是微需氧菌，最适pH6.5，乳杆菌是微厌氧菌，最适pH6.5。这样最初链

球菌先开始发育，随着产酸和氧气的消耗，pH逐渐下降，这样的低pH、低氧气可促进乳杆菌稍迟开始发育，后者其蛋白分解力很强，所产氨基酸又促进链球菌生长，链球菌产的甲酸又促进乳杆菌生长，这样两菌共生，大大缩短发酵周期，且形成的芳香物互相补充、适口性良好。

 两菌共同生长达到一定程度，产生大量乳酸，导致不够耐酸的链球菌生长受抑而停

止繁殖。

两菌特性比较： 菌种 L. bulgaricus S. thermophilus 最适pH pH6.5 pH6.5 与氧气关系 微厌氧 微需氧 8

分解蛋白 强 无或者弱 产乳酸及耐酸力 强 较强 产香 产丁二酮、乙酸等 产丁二酮

2.5 保温发酵

 使用不同混合菌种的培养温度不同，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌混合菌种所用发

酵温度为40-45℃，乳酸链球菌与乳脂链球菌混合时则用33-37℃ ；  发酵时间一般为2-5h，以乳凝固或pH降至4.6为准，这与菌种活力有关 2.6 后熟

 大规模生产时主发酵至pH4.6或产酸0.7～0.8%，即应开始冷却；  冷却要求5h内降至20℃以下，在4℃贮藏、销售；  冷藏一来可终止发酵，二来冷藏期间还可缓慢产酸，可由pH4.6降至pH4.1～4.2（酸

度0.8-0.9%或更高)，并同时形成香味。

3、酸乳的品质

酸奶的凝块硬度是其重要指标，一般倒置时凝块不下落也不破碎为优质产品，另外要求凝块均匀，口感细腻，富有弹性，表面光滑，不龟裂，不产气泡，不发生乳清分离，需有优良酸味和风味，无苦味、异味等。 理化指标：

 脂肪≮3% ，  酸度80-1200T，  总糖10%，

 Coliform ≯90MPN /100ml.  曲霉菌≯1个/ml ,  酵母菌≯10个/ml

 L.bulgaricus与S.thermophilus的活菌数均>108cfu/ml。

目的：了解并掌握种子液的扩大培养过程。

原理：就是将乳酸菌接入牛奶，采用恒温发酵法，通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中酪蛋白（约占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％）变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。 酸奶的发酵条件：

1、将原料奶及容器作灭菌处理

2、原料奶中不能含有抗菌素等抑制细菌生长的成分 3、足够数量的乳酸活菌发酵剂

4、温度恒定（最佳发酵温度为40℃～45℃） 5、一定的发酵时间（一般发酵时间为6-8小时）

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操作步骤：

1. 每人秤取18g奶粉+10g蔗糖，用160ml开水溶解，均质（暂时用打浆机代替），巴氏消毒（煮沸即可），当奶液温度降至45℃时，加入2%-3%的乳酸菌种子液（保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌，按1:1加入）。 2. 分装入容器中，1杯/人，42℃培养6-8h，至凝固成豆腐花状。 3. 将培养物平移到4-10℃冰箱中后熟24h. 4. 品尝。请记录感官评价。 乳酸菌种子液的制作：

保藏的乳酸菌 活化1-2次 再转接到大三角瓶中40-42℃培养6-8h，至凝固成豆腐花状，即为乳酸菌种子液。 活化用培养基：12%的脱脂奶粉。

实验四 固体酶制剂的制造

一、目的

掌握粗制固体酶制剂——糖化曲和酱油曲的一、二级种子的制造方法。

试管菌种培养的目的和要求，是在选出的优良原菌的基础上，培养出纯粹、新鲜、繁殖力强、孢子多、色泽正常的曲种，以供扩大之用。 二、材料

黄豆芽 蔗糖 琼脂 麸皮 面粉 试管 烧杯 漏斗 玻棒 量筒 三角瓶 纱布 棉花 台秤 电炉 高压锅 牛皮纸等 三、方法

（一）一级种子（试管菌种）的制造

1、豆芽斜面培养基制法 称1.0g黄豆芽（除去根部），加水100毫升，煮沸半小时，补水至100毫升，用双层纱布过滤，加2.5克琼脂，5克蔗糖，再加热使溶化，补水至体积为100毫升，趁热装入小试管，每管约5毫升，塞棉塞，包牛皮纸，放进高压锅，在1公斤/厘米2的压力下，灭菌半小时，趁热取出做成斜面，冷却放置3～4天，检验无菌后即可使用。 2、培养条件

在无菌条件下，接种一环原菌孢子（As3.800或As3.951或As3.2783）于斜面培养基上，置30℃恒温箱内培养3天，待斜面上长满孢子以后取出备用。 3、菌种保藏

糖化或酱油用的菌种一般保藏方法是将新鲜培养成熟的菌株置于4℃冰箱内保藏，每3～4个月移植一次。如果常温保存，则视季节而定，一般1～2个月移植一次。 （二）二级种子（固体三角瓶培养）的制造 1、固体三角瓶培养基的制法

称取40克麸皮，10克面粉与45毫升水混合均匀，用湿纱布盖半小时后，装入1000毫升的三角瓶，在1/公斤/厘米2的压力灭菌30分钟，取出冷却。 2、接种与培养

接种半管斜面菌种孢子于已冷却的三角瓶培养基中，摇匀，使曲吸去瓶内冷凝水，置30℃温箱保温培养12小时，待菌丝生长后摇瓶一次，24小时菌丝结成饼状，要扣瓶，使空气流动有利于曲霉繁殖。扣瓶后，将瓶横放继续保温至黄绿色孢子充分长满曲料（黑曲霉则产生

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黑褐色孢子）。全程约需三天。 3、应用

刚培养好的新鲜三角瓶扩大曲，发芽力强，发芽率高，应及时使用。如需保存，可放置在4℃冰箱中，但时间也不宜超过10天。

实验十六 大豆酱酿造试验

一、目的

大豆酱是以大豆为主要原料的一种酱类，也称黄豆酱或豆酱，它也是利用以米曲霉As3.951为主的微生物作用制得的，因此，制曲的要求和方法，以及发酵的理论，基本上与酱油酿造相同。本实验采用固态低盐发酵制酱法。 二、材料

大豆 标准面粉 已培养成熟的As3.951三角瓶曲种 瓷盘 量筒 研钵 温度计 纱布 高压锅 台秤 三、方法

1、称200克黄豆、洗净后用清水浸泡48小时，浸泡程度为豆粒表面无皱纹，并能用手指压成两瓣为适度。

2、将浸泡沥干后的大豆，用双层纱布包后放入锅里，常压蒸煮40min（圆汽时计时）。 3、取面粉100克，将其炒成黄色，有浓香味即可。

取约1/10已炒熟的面粉，与预先制好的As3.951曲种3克，混合均匀，并捣碎。

4、取已蒸熟的黄豆放在盘中拌入50克熟面粉，冷至40℃时加曲种，充分搅拌，使面粉与种曲均匀的附在豆粒表面，铺成2公分，然后划成几条小沟，使其通气，放入烘箱培养，培养管理方法基本上与酱油曲相同，具体参阅实验十四，但由于豆粒较大，水分不易散发，制曲时间需适当延长。 5、制酱

将大豆曲倒入大烧杯或大口杯中，表面扒平并压实，自然升温至40℃左右。再将准备好的14.5°Be′热盐水大约200ml（加热至60～65℃）加至面层，让它逐渐全部渗入曲内，最后加盖面盐一层，并将盖盖好。大豆曲加入热盐水后，醋温即能达到45℃左右，以后维持此温度10天，酱醅就成熟，发酵完毕，补加24°Be′盐水及所需细盐（包括封面盐），并充分翻拌，使混合均匀，在室温中后发酵4～5天即得成品。 注：配合比例

大豆曲 100克 14.5°Be′盐水 90克

固态低盐发酵酱醅成熟后，再加入24°Be′盐水40克和细盐10克。

一般经验是100公斤水加盐1.5公斤左右得到盐水1°Be′，波美16°的盐水是用100斤水加24斤盐配成。14.5°Be′食盐水为100公斤水加盐22公斤 注：波美20°的盐水是用100斤水及食盐30斤配成；波美18°的盐水是用100斤水及食盐27斤配成。

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实验六 酒的蒸馏与调配

一、目的：

掌握酒蒸馏与调配的基本方法。 二、原理：

果汁中或大米中可发酵糖经酵母的酒精发酵产生酒精，形成营养丰富的的酒。 酵母菌

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2

经过蒸馏，可使醪液中的酒精以及杂醇油，乙酸乙酯等香气成分蒸馏出来，形成酒，而无用的渣除去。

三、材料与仪器：

番薯酒 米酒发酵醪液 量筒 温度计 酒精计 蒸馏装置 四、步骤：

1、将米酒、番薯酒和果酒称重，量体积。 2、装好蒸馏装置。

3、量取100ml米酒，番薯酒和果酒分别倒入蒸馏烧瓶中，另加入100ml烫开水，摇匀加6粒玻珠，接冷凝水和电炉，开始蒸馏。

4、馏液以100ml量筒承接（要求馏液温度＜30℃），当馏液达85～90ml时，停止蒸馏，以蒸馏水补至馏液中，使其达100ml，摇匀。

5、用酒精计量取馏液酒度，同时测定馏液温度，查表得到校正为20℃的酒度，即为发酵醪的酒度。

6、将杨桃调配成酒精含量16%，糖含量6%的果酒。 五、数据处理 （一） 发酵醪质量（g） 发酵醪体积（ml） 米 酒 番薯酒 果 酒 （二）果酒的调配 M（w%－w2%）

酒 度 温 度 m1＝ m2 = M－m1 （w1－ w2%）

式中w1%：较高度的原酒重量 （%）

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W2%：较低度的原酒重量（%） W%：勾兑后酒的重量（%） M：勾兑后酒的重量（g） m1：较高度酒的原酒重（g） m2：较低度酒的原酒重（g）

实验七 固体酶制剂的制造

一、目的

掌握粗制固体酶制剂——糖化曲和酱油曲的一、二级种子的制造方法。

试管菌种培养的目的和要求，是在选出的优良原菌的基础上，培养出纯粹、新鲜、繁殖力强、孢子多、色泽正常的曲种，以供扩大之用。 二、材料

黄豆芽 蔗糖 琼脂 麸皮 面粉 试管 烧杯 漏斗 玻棒 量筒 三角瓶 纱布 棉花 台秤 电炉 高压锅 牛皮纸等 三、方法

（一）一级种子（试管菌种）的制造

1、豆芽斜面培养基制法 称1.0g黄豆芽（除去根部），加水100毫升，煮沸半小时，补水至100毫升，用双层纱布过滤，加2.5克琼脂，5克蔗糖，再加热使溶化，补水至体积为100毫升，趁热装入小试管，每管约5毫升，塞棉塞，包牛皮纸，放进高压锅，在1公斤/厘米2的压力下，灭菌半小时，趁热取出做成斜面，冷却放置3～4天，检验无菌后即可使用。 2、培养条件

在无菌条件下，接种一环原菌孢子（As3.800或As3.951或As3.2783）于斜面培养基上，置30℃恒温箱内培养3天，待斜面上长满孢子以后取出备用。 3、菌种保藏

糖化或酱油用的菌种一般保藏方法是将新鲜培养成熟的菌株置于4℃冰箱内保藏，每3～4个月移植一次。如果常温保存，则视季节而定，一般1～2个月移植一次。 （二）二级种子（固体三角瓶培养）的制造 1、固体三角瓶培养基的制法

称取40克麸皮，10克面粉与45毫升水混合均匀，用湿纱布盖半小时后，装入1000毫升的三角瓶，在1/公斤/厘米2的压力灭菌30分钟，取出冷却。 2、接种与培养

接种半管斜面菌种孢子于已冷却的三角瓶培养基中，摇匀，使曲吸去瓶内冷凝水，置30℃温箱保温培养12小时，待菌丝生长后摇瓶一次，24小时菌丝结成饼状，要扣瓶，使空气流动有利于曲霉繁殖。扣瓶后，将瓶横放继续保温至黄绿色孢子充分长满曲料（黑曲霉则产生黑褐色孢子）。全程约需三天。 3、应用

刚培养好的新鲜三角瓶扩大曲，发芽力强，发芽率高，应及时使用。如需保存，可放置

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在4℃冰箱中，但时间也不宜超过10天。

实验八 酶糖化淀粉试验

一、目的

掌握用酶法糖化淀粉原料制葡萄糖浆的方法。 二、原理

利用淀粉酶水解原料中的淀粉生成葡萄糖液，经适当浓缩即成葡萄糖浆。 淀粉酶

（C6H10O5）n + n H2O nC6H12O6 淀 粉 葡萄糖

淀粉酶属水解酶类，是水解淀粉类物质的总称，淀粉酶主要分为α—淀粉酶，淀粉（1、4）——葡糖糖苷酶，β—淀粉酶和淀粉（1、6）——糊精酶。制造葡萄糖液关系最大的是α—淀粉酶和淀粉（1、4）葡萄糖苷酶。 1、α—淀粉酶（又称液化酶）：水解淀粉时，能迅速切断淀粉分子的巨大网状结构，生成糊精，降低淀粉的黏度，而变糖则很缓慢，故有称淀粉1、4糊精酶。α—淀粉酶作用的PH范围为5～9，而以6为最佳，能耐热，作用温度以60度为佳。此酶大量存在于米曲酶（As3.800）、麦芽及枯草芽孢杆菌中。

2、淀粉（1、4）——葡萄糖苷酶：水解淀粉时，能以淀粉的非还原性末端开始依次水解α—1，4葡糖糖苷键，放出一个又一个葡萄糖，遇到支链淀粉的1、6—键虽不能水解，但能绕过1、6键继续对1、4键起作用，因此水解的产物几乎全部是葡萄糖。此酶主要存在于黑曲霉As3.2783中。 三、材料

1、已培养成熟的米曲霉三角瓶固体曲种As3.800和As3.2783

2、新鲜番茄、大口杯、表面皿、量筒、温度计、台秤、研钵、纱布、烧杯、小刀、高压锅、电炉等 四、糖化 1、在粗天平上称取已洗净去皮的番茄200克，切成小块后放入大口杯中，加水200毫升，在1公斤/厘米2的压力下蒸煮灭菌半小时。

2、将已蒸熟的番茄取出，并捣烂，待冷到75～70℃时，依次加入黄曲和黑曲，搅匀，随即放入60℃烘箱内，保温糖化22小时。

3、糖化完全后（用碘液试不变蓝色即可）取出用双层纱布过滤于烧杯内，量其滤液的毫升数及波美度。

4、将滤液煮沸浓缩至半固状即可。 注意：（1）黄黑曲的用量视原料中的淀粉含量而定，通常用量为淀粉的15～20%。（番茄含淀粉约20%）

（2）此种应在用酒精消毒的研钵中研碎后使用。 （3）糖化时温度不得低于55℃，不得高于60℃。

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实验九 无盐固态发酵酿造酱油试验

一、目的

通过实验，了解并掌握无盐固态发酵法酿造酱油。

一般酿造酱油，在发酵的过程中为了防止，使用大量的食盐。由于大量食盐的添加而抑制了酶的活力，致使发酵周期延长。无盐固态发酵摆脱了食盐对酶活力的抑制作用，因而在发酵时间上比一般发酵法缩短了很多倍，仅需56小时。但由于发酵温度较高，使制成的酱油风味不足，缺乏酱香气，为此可改为低盐固态发酵。 二、原理

选用富含蛋白酶和淀粉酶的米曲酶（As3.951）繁育于经处理的油饼及淀粉原粉（如麸皮、糠饼等）之上，制成酱曲进行发酵，使之进行蛋白质分解，淀粉糖化，酒精发酵，酸类生成等复杂的生物化学变化，在这些作用的基础上，最后制成色、香、味俱美的制品。 三、材料

1、黄豆（或花生饼）200g 2、面粉（或米粉）30g 3、食盐60g

4、米曲酶As3.951 1管 5、米糠、统糠和花生饼粉 四、方法 （一）曲种：

60克米糠、30克统糠、花生饼粉10克，加70～80毫升水和匀，用湿纱布盖住1小时后，

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分装于二个1000毫升的三角瓶，在1kg/cm的压力下灭菌30分钟，取出冷却，接入2～3环As3.951米曲霉斜面菌种，捣碎，搅匀，并要摇匀，使曲吸去瓶内冷凝水，置于30℃下培养，12小时摇瓶，使水分被曲吸收，24小时菌丝结成饼状，要扣瓶，使空气流通，有利于曲霉繁育，48小时左右，菌丝布满，并着生黄绿色孢子，若瓶内水分多，可打开瓶塞，让水分蒸发，待全满黄绿色孢子即可使用。 （二）酱曲： 1、工艺流程

水 炒面粉 曲种1%

20～22小时

黄豆 浸泡 蒸煮 冷却 拌粉接种 装盘 培养 室温26～28℃ 曲温38℃以下

6～8小时 26～30小时

第一次翻曲 第二次翻曲 酱曲 室温28℃ 室温25℃ 曲温38℃以下 曲温33～36℃

2、操作说明：

（1）浸泡：称取黄豆200克，冲水洗净，加水浸泡5～6小时，以豆粒表面无皱皮，豆内无向心，并能于指间容易压成两瓣为度。若以花生饼为曲料，须先捣碎（粒子为0.5公分左右），加水拌和均匀，加水比以1：1为宜，然后盖上湿纱布，堆积1小时，使水分均匀，最后用纱布包住即可进行蒸煮。

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（2）蒸煮：浸泡适度的黄豆，沥干后放入高压锅内，于1～1.5公斤/平方厘米压力下蒸煮40分钟即可。蒸熟程度以大豆全部均匀熟透，达到即酥又软，保持整粒为烂为标准。 （3）拌粉接种：将已蒸熟的黄豆放在盘中摊凉，称取30克炒面粉（炒至有浓香味），用全部炒粉的90%与摊冷至40℃的熟豆混匀，曲种用量为1%，再将拌有曲种的炒粉撒于豆料面上，翻拌3～4次，使之充分混匀。

（4）培养：将混匀的曲料铺成2公分厚，然后划成几条小沟使其通气，并注意曲料不要碰到曲盘四周。装盘后应立即送入曲室培养。经20～22小时的培养后，进行第一次翻曲，在此期间，室温应保持在26～28℃，曲温控制不超过38℃。翻曲后6～8小时，进行第二次翻曲（又叫扣曲），在此期间，用控制室温在28℃左右，曲温控制在38℃以下。第二次翻曲后，继续培养26～30小时，等曲长成黄绿色即可出曲，在此期间，室温只需维持20～25℃，至于曲温则应保持在33～36℃。注意，酱曲进曲室16～22小时期间，菌丝生长迅速，呼吸旺盛，曲温上升很快，且不断产生水分，所以要经常调节曲室的湿度和温度。 （三）固态无发酵 1、工艺流程：

拌60℃温开水 食盐40克

保温58～60℃

成熟酱油 投入1000毫升烧杯 铺盖面盐 发酵 成熟酱醅 48～60小时 浸泡48小时

补充盐水搅成稀酱 成熟酱醪 酱油 60℃

2、操作说明：

（1）发酵制醅：将酱曲捣碎，称重。把已称重的酱曲放在盘中堆积起来，放入烘箱调节温度，待品温长至47℃时，装入1000毫升大烧杯，加60℃的温开水，拌匀。为了防止杂菌传染，加入40克盖面盐（约2公分厚），均匀地撒布在酱醅表面，再盖好盖子，然后迅速放入58～60℃的烘箱内发酵48～60小时即成酱醅。 拌水量的计算方法：

用水量为无水曲的120%（一般酱曲含水32%） 例：酱曲500g，含水32%。

则：无水曲 = 500×（1－32%）= 340（克） 应加水量 = 340×120%－160 = 248（毫升）

（2）加盐水制醪：发酵完成后的成熟酱醅要迅速补加盐水，且要求盐度准确，一般常用的盐度是波美20°。将制醪用盐称好，溶于60℃的温开水中（制醪用水量）一起拌入酱醅中进行充分搅拌，然后放入烘箱内保温60℃，浸醪48小时，使酱醪中可溶性成分浸出来，即为成熟酱醪，制醪用水及制醪用盐计算方法如下：

一般做酱油的黄豆、面粉和盐、水的比例是： 水重 = 2倍黄豆重 盐重 = 2倍面粉重

本试验投入的黄豆为200克，面粉30克，那么水和盐的总重是： 总水 = 2×200 = 400（毫升） 总盐 = 2×30 = 60（克）

因发酵时已用去一部分的盐和水，故制醪所用的盐应是： 制醪用水 = 总水－发酵用水

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制醪用盐 = 总盐－盖面盐 （3）压榨：

将浸48小时的酱醪取出，用双层纱布过滤，滤液即为原油，约波美25°。 将原油滤渣加波美16°的盐水（温开水加盐），此量等于原油的量，浸泡一天后用双层纱布过滤，滤液即为二油，约波美18°。

将二油的滤渣加温开水，此量等于原油量，浸泡一天后用双层纱过滤，滤液即为三油，约波美8°，加盐水至18°，滤渣可做猪、牛饲料。

将原油、二油、三油混合后即得成品酱油，其波美度要求是21℃，如果不足可补加盐。将混合后的酱油放在锅内煮至80℃，保温30分钟，并加入0.1%苯甲酸钠以防腐，后移入缸中澄清待用。为提高质量，也可只用原油及二油混合制成成品酱油（要求波美23°）， 而三油则作为浸泡原醪的盐水用。

注：波美20°的盐水是用100斤水及食盐30斤配成；波美18°的盐水是用100斤水及食盐27斤配成。

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