农业生物技术学报 JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(2):279~282 · ·研究论文与南瓜矮生基因连锁的分子标记 * 李云龙 1,2 ， 李海真 1 **， 崔崇士 2 ， 张海英 1 ， 宫国义 1 北京 1000；哈尔滨 150030) (1.国家蔬菜工程技术研究中心， 2.东北农业大学园艺系， 摘要: 以中国南瓜( （矮 10） 为供体亲本， 以印度蔓生南瓜( Duch)矮生突变体 （蒙日南 Duch) 经 6 代回交和 2 代自交选育出 S1~S9共 9个南瓜矮生近等基因纯合株系， 其中 S2株系再与蒙日南瓜杂交获 瓜） 为轮回亲本， 得 F （nearisogeniclines,NILs） 分析法， 结果表明， 在 0 条随机引物 2 分离群体共 306 株。利用 RAPD 技术, 采用近等基因系 中，发现 RAPD标记 SCAR标记 与矮生单基因 。 呈现连锁关系，遗传距离为 2.29cM。RAPD 标记成功转化成更为稳定的 矮生基因 ； 关键词：南瓜； 近等基因系； RAPD； SCAR 中图分类号: S184S188 文献标识码:A 文章编号: 10061304(2007)02027904 MolecularMarkersLinkedtotheDwarfGeneinSquash 1,2 1 2 1 1 ， Haizhen Chongshi ， ， LIYunlong LI** ，CUIZHANGHaiying GONGGuoyi Thefirstdiscovereddwarfmutant（Ai10） ofthe mal Duchwasusedasthedonorparent,andthenor Duch(Mengri)wasusedasrecurrentparent.Ninepurelinesofthenearisogeniclines(NILs)namedS1~S9weregot usingRAPDandNILsapproach throughthe6timesbackcrossesandtwiceselfcrosses.The306F 2 individualswerederivedfromthesinglecrossbetweentheNILS2 andMengri.Allofthe0randomprimerswerescreenedforthemarkerlinkedtothedwarfgene es.TheresultsshowedthattheRAPDmarker beentransformedtoSCARmarker squash;NILs;dwarfgene ;RAPD;SCAR waslinkedtothedwarfgene.Thegeneticdistancewas2.29cM,andithas 不 矮杆 （矮生） 半矮秆作物具有茎秆短小粗壮， 易倒伏， 耐肥抗倒， 降低茎秆同化的特点， 从而可显 著地提高农作物产量(刘杰和李润植， 2005)。目前， 各国学者在多种作物矮生资源的研究与利用方面开 半矮 展了大量的研究工作， 育成了许多优良的矮生、 生品种， 并成功地克隆了小麦矮秆基因 矮秆基因 、 拟南芥 基因等(Peng 、 水稻半 其矮 研究证明， 南瓜的矮生和蔓生是一对相对性状， 生性状由显性矮生单基因 控制（周祥麟和李海 真， 。该基因的定位和克隆对了解南瓜矮化机 1991）制，丰富植物矮生基因资源及利用基因工程手段实 现品种矮化的遗传改良具有重大意义。 目的基因的克隆与分离往往依赖于与该基因连 锁的分子标记。 本研究以育成的南瓜矮生近等基 因系为试材， 利用 RAPD(赵淑清和武维华， 2000)技 （nearisogeniclines， 术， 采用近等基因系 分析 NILs） 法(方宣钧， 寻找与矮生基因 2002)， 紧密连锁的分 克隆及南 子标记， 为最终将该矮生基因的精细定位、 瓜分子标记辅助选择体系的建立提供基础资料。 Sasaki ,2002;Helliwell .,1999; ,1998)。但由于这些 矮杆 （矮生） 半矮秆基因的作用机理研究还不完全清 楚， 使其在农作物改良方面的应用还十分有限(刘杰 和李润植， 2005)。寻找新的矮源基因一直是各国学 者的关注重点。1982 年在山西省境内发现了一株中 国南瓜矮生突变体，是首次发现的极其珍贵的矮生 南瓜类型(周祥麟和李海真， 1991;王甲生， 1986)。经 1 材料和方法*基金项目： 北京市自然科学基金(No.5042008)， 北京市优秀人才培养专项经费项目和山西省自然科学基金项目(No.20011096)资助。 **通讯作者。Authorforcorrespondence.研究员，
. 主要从事南瓜属蔬菜作物遗传育种及相关应用基础研究。Email： Tel： 01051503010 20060414 接受日期： 20060601 收稿日期： 280农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年 1.1 供试材料 实验材料由国家蔬菜工程技术研究中心南瓜育 种课题组提供。包括印度蔓生南瓜( Duch)（蒙日） 和中国南瓜( Duch)矮生 突变体 （矮 10）， 经 6 代回交和 2 代自交选育出的 9 个矮生南瓜近等基因纯合株系 （S1~S9）， 蒙日与该 近等基因纯合株系中的 S2 杂交获得的 F 2 分离群体 共 306 个单株， 以及其它 5 个印度蔓生南瓜品种。 1.2 方法 1.2.1 DNA 提取 采用 CTAB 法 (Murryand Thompson,1980) 提取基因组 DNA， DNA 浓度和质 量用琼脂糖凝胶电泳检测，最后将浓度调至 30 ng/滋L 。 1.2.2 PCR 扩增与产物检测 PCR 反应在 DNA PTC100(东胜创新生物技术有限公司)上进行。 反应 体系共 13.5 滋L ， 包括： ddH2 O7.05 滋L ； 10伊buffer （含 Mg 2+） 1.25滋L ； dNTP（2.5mmol/L） 1.0 滋L ；引物 （15 ng/ 滋L ） 2.0 滋L ；模板 DNA(30ng/ 滋L)2.0 滋L ； DNA聚合酶 （5U/滋L ） 0.2滋L 。 反应程序为 94 ℃ 5min 预变性， 然后进入下列 循环： 94 ℃ 30s→37 ℃ 30s→72 ℃ 1min， 35 个循 环； 最后 72 ℃ 7min； 4 ℃保温。扩增产物在 1.5%琼 脂糖凝胶中电泳，利用 KodakEDAS120 凝胶分析 仪(日本 EASTMANKODAK 公司)进行成像分析， 记录多态性片段。 1.2.3 数据记录、 标记命名与连锁分析 采用 Join Map3.0 软件(vanJoijenandVooripd,2001)分析所得 RAPD标记和矮生基因 之间的连锁关系。根据 F2 单株的蔓生、 矮生田间调查记录， 并按照 JoinMap3.0 软件的规定进行命名： F2 矮生单株记作 a； 蔓生单株 记作 b；所得标记在 F 2 各单株电泳谱带上的有、 无 分别记作 a 和 b。最终计算出所得 RAPD 标记与矮 生基因 之间的遗传距离。 1.2.4 SCAR 分析 RAPD标记的回收、转化与克 隆: 用所得到的连锁标记引物进行 RAPD 重新扩 增，产物在 1%的琼脂糖凝胶上检测，切下目标条 带， 采用购自 TaKaRa公司的 DNA凝胶纯化回收试 剂盒对目的片段进行纯化。PCR 产物与载体的连接 采用 Promega公司的 PGEMTeasyVector 系统。参 照 《分子克隆实验指南》 中的方法进行重组质粒的转 化与筛选。 利用碱式裂解法提取重组质粒， 酶切后进 行 PCR 检测。 目的片段的测序, 委托上海生工生物工程技术 服务有限公司及奥科生物工程技术服务有限公司进 行测序并提供结果。 根据测序结果设计 SCAR 引物并在上海生工 生物工程技术服务有限公司进行合成。 上游引物： 5'CTTGTCCATTCCTCCTCC3'; 下游引物： 5'TCCACTCCCTCTTTTTCA3'。 SCAR 扩增反应体系共 25 滋L ，包括： ddH2 O 16.3 滋L ； 10伊buffer2.5 滋LdNTP （2.5mmol/L） 2.0 滋1.0L ； 滋PrimerL ； 模板 1（ DNA15 ng/ ； （ 5滋Lng/ ） 1.0 滋L 滋） L2.0 ； Primer 滋L ； 2（ E（15 5ng/U/滋滋LL ） ） 0.2滋L 。 SCAR 扩增的反应程序： 94 ℃预变性 5min， 94 ℃变性 1min， 58 ℃退火 1min， 70 ℃延伸 2min， 35 个循环， 最后 72 ℃下延伸 10min， 4 ℃保存。 PCR 仪 型号为 DNAThermal480（ PERKINELMER， USA）。 SCAR 标记的验证与扩增产物的快速检测： 以 SCAR 引物对双亲、 9 个矮生南瓜近等基因纯合 株系和 306 个 F 2 单株进行 PCR 扩增，将扩增产物 上样于含 0.5 滋g/mLEB 的 1.0%琼脂糖凝胶中， 以 GeneRulerTM100bpDNALadderPlus 做标准分子 量标记 （MBI分装）， 以 1伊TBE 为电泳缓冲液， 120V 稳压电泳进样，在 100V 电场强度下稳压电泳约 1 h， 至指示剂距底端约 1cm。利用 KodakEDAS120 凝胶分析仪进行分析保存。 2 结果与分析 2.1 突变体矮生性状的遗传分析 本实验所用 F 2 分离群体共 306 株， 田间调查统 计结果显示， 矮生植株 223 株， 蔓生植株 83 株， 经计 算 字2 =0.736 （ 字2 0.05,1 =3.841）， 符合 3颐1 的分离比例， 说 明该矮生性状由显性矮生单基因控制。 2.2RAPD 引物的筛选 通过对 0 条随机引物的扩增筛选， 共有 13 条 RAPD 引物在矮 10 和矮生南瓜近等基因纯合株系 （S2） 之间扩增出稳定可重复的特异性条带， 而在蒙 日中未出现该条带 （图 1）。 在蒙日和 S2 杂交后代的 306 个 F2 单株中分别随机选取 7 株矮生型和蔓生 型植株进行初步连锁分析， 发现由引物 S1225 所扩 增出的多态性片段 （经测序为 8bp，定名为 ） 在矮生型植株中均出现， 而在蔓生型植 株中均未出现 （图 2）。最终用引物 S1225 对 306 个 F 2 单株进行 RAPD扩增验证， 发现除 7株不符外(表 1)，其余 299 株扩增带的有无和田间蔓性记载完全 相符， 其中矮生型后代中有 3 株未出现该特异条带； 蔓生型后代中有 4株出现了该条带， 经多次验证， 该 扩增结果稳定重复。 不符单株的出现， 可能是由于在 自交过程中标记和矮生基因 之间发生了交换， 失 去了连锁关系， 导致了上述 7 个单株的 RAPD 标记 与田间株型表现不符。 第 2 期 李云龙等：与南瓜矮生基因连锁的分子标记 281图1.13条 RAPD引物在蒙日、 矮 10和S2之间的扩增结果 Fig.1.RAPDprofilesgeneratedby13polymorphicprimersinMengri,Ai10andS2 1， 2， 中国南瓜矮生突变体）3， S2(矮生近等基因纯合株系)。箭头表示引物扩增的特异条带。 蒙日 （印度蔓生南瓜）；矮 10（；1,Mengri( );2,Ai10(dwarfmutantof );3,S2(purelineoftheNIL).Arrowsindicateamplificationbands 用引物 S1225 进一步验证表明， 在其它 8 个矮 生近等基因纯合株系中也扩增出该特异条带(图 3)， 而在包括轮回亲本 （蒙日） 在内的 6 个印度蔓生品种 中该特异条带不存在(图 4)。 图 4. 引物 S1225对蒙日、 矮 10和S2及其它5个印度蔓生南 瓜品种的 RAPD扩增结果 Fig.4.RAPDpatternsofMengri,Ai10,S2andtother5cultivars of byprimerS1225 M， marker； 1， 2， 3， S2； 蒙日；矮 10；4~8， 其它5个印度蔓生南瓜品种。 M,marker;1,MengRi( );2,Ai10(dwarfmutantof );3,S2(purelineoftheNIL);4~8,other5cultivarsof .(Whitearrowindicatesthemarker ) 图 2. 引物 S1225对蒙日、 矮 10和S2及部分F 2 单株的 RAPD扩增结果 Fig.2.RAPDpatternsofMengri,Ai10,S2andsomeF 2 individualsbyprimerS1225 M， marker； 1， 2， 3， S2； 4~10， F 11~17， 蒙日；矮 10；2 部分蔓生植株； F 2 部分矮生植株。 M,marker;1,Mengri( );2,Ai10(dwarfmutantof );3,S2(purelineoftheNIL);4~10， normalplantsintheF 2 population;11~17， dwarfplantsintheF 2 population.(Whitearrow indicatesthemarker ) 表1 与株型在杂交F 2 代分离群体中的共分离 andphenotypeintheF 2 遗传距离/cM Geneticdistance Table1Cosegregationfor populationfromMengri伊Ai10progeny 株型 Phenotype蔓生型 Long 矮生型 Dwarf 株数 No.ofplants 83存在 Presence4不存在 Absence 79 2.29 2232203 图3.引物 S1225对蒙日、 矮 10和 S2及近等基因系的其它 8个纯合株系的RAPD扩增结果 Fig.3.RAPDpatternsofMengri,Ai10,S2andtheother8pure linesoftheNILsbyprimerS1225 M， marker； 1， 2， 3， S2； 4~11， 蒙日；矮10； 近等基因系的其它 8个纯合株系 （S1,S3~S9）。 M,marker;1,Mengri( );2,Ai10(dwarfmutantof ) ); 3,S2(purelineoftheNIL);4~11,other8purelinesofNILs(S1,S3~S9). (Whitearrowindicatesthemarker 2.3 所得 RAPD 标记与矮生基因 的连锁关系 以及 F2 在 F2 各单株上的表现， 代单株的蔓生、 矮生田间调查记录， 采用 JoinMap3.0 根据 软件对所得 RAPD 标记 和矮生基因 进行连锁关系分析，结果表明该标记与矮生基因 其连锁距离为 2.29cM。 存在紧密连锁关系， 2.4SCAR 分析 并根据测序结果， 利 将连锁标记进行克隆测序， 用oligo6 和 PrimerPremier5 软件设计 SCAR 引物， 282农 业 生 物 技 术 学 报 2007 年 其中引物 SCAR 在 58 ℃退火条件下获得较好的扩 增结果， PCR 产物大小为 398bp，并且与其相对应 的 RAPD 引物扩增结果完全对应 ， 命名为 （图 5）。 图 5. 引物 SCAR3对蒙日、 矮10及部分 F 2 单株的 SCAR扩增结果 Fig.5.SCARpatternsofMengri,Ai10andsomeF 2 individuals byprimerSCAR3 M， marker； 1， 蒙日；2， 矮10；3~10， F 2 群体中的部分蔓生植株； 11~14， F 2 群体中的部分矮生植株。(SCAR3398)。 M,marker;1,Mengri( );2,Ai10(dwarfmutantof ); 3~10;normalplantsintheF 2 population;11~14,dwarfplantsintheF 2 population.(Whitearrowindicatesthemarker ) 3 讨论 3.1 本研究的目的基因 （矮生基因 ） 为一显性基因， 虽然在幼苗后期也可从表型上进行蔓性鉴别， 但从播 种至蔓性可明显鉴别也需要大约 35d， 且蔓性的表现 还受到水、 肥等外界生长条件的影响， 表型直观鉴别 准确性不高。本研究成功地将获得的与矮生基因 D 紧密连锁的 RAPD标记转化成 SCAR 标记利用其进 行蔓性的鉴别， 在两片子叶期 （从播种至此约需 5d） 即可进行， 大大缩短了鉴别周期， 同时极大的提高了 参 考 文 献 FangXJ(方宣钧),WuWR(吴为人)andTangJL(唐纪良) PlantDNAMolecularMarkerAssistedBreeding(M.)Bei jing:SciencePress.2002.(inChinese) HelliwellCA,SheldonCC,OliveMR,WalkerAR,ZeevaartJ ADandPeacockWJ.Cloningofthe oxidasegeneGA 3(J). ,1998,95:9019~9024 LiuJ(刘洁)andLiRZ(李润植).DwarfgeneandGAsignal transductionpathwayincrops(J). (中国农学通报),2005,21:37~40(inChinese withEnglishabstract) MurryHGandThompsonWF.Rapidisolationofhighmolecu larweightplantDNA(J). 1980,8: 4321~4325 PengJR,CarolP,RichardsDEandHartleyNM.Greenrevolu tiongenesencodemutantgibberellinresponsemodulators(J). 鉴别的准确率， 在矮生南瓜选育过程中具有重要的应 用价值。 为南瓜矮生基因分子标记辅助育种选择体系 的建立， 提高育种效率提供了技术基础。 3.2 与分离体分组混合分析法相比， 近等基因系法 虽然在建立实验群体时需要通过多次回交筛选， 耗 费时间较长， 但一旦建立， 理论上除了目标基因及邻 近极小区域不同外， 其它区段完全一致。 如果在近等 基因系中检测出多态性，差异位点必定在目标基因 及邻近区域中，所获得的标记就与目标基因紧密连 锁。本研究所获得的 RAPD标记与目标基因的遗传 距离仅为 2.29cM，充分体现了近等基因系分析法 的优越性。但本研究在建立南瓜矮生基因近等基因 系时只回交了 6 代，理论上轮回亲本基因组所占的 比例应为 〔1-（ 1/2） 6〕 =98.438% ， 所以找到的连锁标 记的遗传距离仍较大，如果在回交过程中再增加回 交代数，就能够更高效地筛选到连锁更为紧密的分 子标记。此项工作本实验室正在进行。 3.3 在本研究中，除引物 S1225 被确定与矮生基 因 紧密连锁外， 另有 12 条 RAPD 引物在蒙日、 矮 10 和矮生南瓜近等基因纯合株系 （S2） 之间也扩增 出了稳定可重复的多态性条带。 经对 19 个中国南瓜 品种进行进一步验证，这些条带为中国南瓜的特有 谱带，这一结果对南瓜作物在分子水平上的遗传分 类研究将有实际意义。 3.4 在本研究发现 7 个单株的标记与田间株 型表现不符， 为此我们将利用 “侧翼分子标记分析” 法寻找更为紧密的连锁标记，同时继续扩大 F 2 群 体， 进一步将该矮生基因 进行精细定位、 克隆， 以 丰富矮生基因资源。 ,1999,400:256~261 SasakiA,AshikariM,UeguchiTanakaM,ItohH.Greenrevo lution:Amutantgibberellinsynthesisgeneinricenewinsight intothericevariantthathelpedtoavertfamineoverthirty yearsago(J). 2002,416:701~702 vanOoijen,JWandVooripsR.E.JoinMap3.0Softwarefor the CalculationofGeneticLinkageMaps(M).Wageningen,the Ntherlands:PlantResearchInternational,.2001. 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