超速无内毒素质粒大量提取试剂盒操作方法及步骤说明书

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试剂盒组成、储存、稳定性：

保存 室温 室温 室温 室温 室温 室温 -20℃

10次（PL1701） 20次（PL1702） 50ml 50 ml 50 ml 15 ml 18 ml 1.1 ml 1.5ml

100ml 100 ml 100 ml 30 ml 35 ml 2.5 ml 1.5 ml

试剂盒组成 溶液P1 溶液P2 溶液N3 溶液WB 沉淀液A 沉淀液B 内毒素清除剂

本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 储存事项: 1.

环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.

避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 

产品介绍：

本试剂盒在改良碱裂解法基础上，采用本公司独家研发的溶液配方和内毒素清除试剂，只需要几次简单离心去除蛋白质、多糖、内毒素、RNA等杂质，获得高质量的质粒DNA。纯化DNA的OD260/280通常在1.8左右，得到的质粒可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。同时内毒素含量极低，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的工作中。纯化后期过程均在Eppendorf管中操作，方法简单，不需特殊设备，无需过柱，不用酚氯仿抽提。本产品是目前市面上最简捷快速的无内毒素质粒大提产品，属于公司独家产品。

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杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://www.hzhxbio.com

操作步骤：

取过夜培养菌<140 ml菌液，装入合适的离心瓶中，12,000 x g离心3 min沉淀菌体，完全弃除上清。

2. 加入5 ml 溶液P1，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。细菌悬液移入50 ml离心管中。

如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。

3. 加入5 ml 溶液P2，轻轻颠倒离心管6~8次，室温放置5 min，使细菌完全裂解，溶液透明。

温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。

4. 加5 ml溶液N3，立即颠倒翻转离心管6~8次，充分混匀，可见白色絮状物产生。上述混合物于13,000 x g离心10 min，小心吸出上清，移入新的50 ml离心管中。

5. 精确加入上清1/9体积的沉淀液A（约1.7 ml），颠倒离心管，充分混匀。 沉淀液A非常粘稠，吸取的时候应该缓慢，精确吸取所需量。

6. 13,000 x g离心10 min，小心弃去上清，倒置吸水纸上轻轻沥干残余液体，加入900μl灭菌水充分吹打底部和侧壁溶解回收质粒DNA，回收的质粒DNA全部转入一个1.5 ml 离心管。

质粒DNA由于纯度非常高，几百微克质粒常常附着在管底和管壁无法看见，即使看不见，也需要充分吹打涮洗离心后理论上的沉淀所在侧管壁和管底。

7. 精确加入沉淀液B 100μl，颠倒离心管，充分混匀。

沉淀液B非常粘稠，吸取的时候应该缓慢，精确吸取所需量。

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13,000 x g离心5 min，小心弃去上清，留下质粒DNA沉淀。

加入1.5ml 溶液WB，颠倒几次漂洗质粒DNA沉淀后弃去全部溶液WB。

10. 短暂离心数秒，将管壁残留液体收集到管底，用移液器小心将残留液体全部吸弃。 11. 加适量TE或者灭菌水（200~500μl）溶解沉淀（可在37℃水浴中振荡以辅助溶解）。

要注意很多质粒DNA可能附着在离心管侧壁上，即使看不见，也应该充分吹打侧壁溶解回收质粒DNA。

注意：步骤11完成后的质粒纯度已经很高，内毒素含量非常低，可直接用于绝大多数的细胞转染实验。如果对内毒素残留要求极其严格，可加做以下内毒素清除步骤。 12. 上步骤后得到的质粒溶液中加入0.1体积冰预冷的内毒素清除剂，颠倒旋转7-10

次（30秒左右）充分混匀，冰浴或者冰上放置>=10分钟，中间偶尔颠倒混匀几次。

内毒素清除剂加入上清后，上清会变得浑浊，但是冰浴后应恢复清亮。 13. 42℃水浴，溶液又会变为浑浊，颠倒混匀后42℃温育5分钟。

14. 室温16,000 x g离心5-10 min分相（温度低时，内毒素清除剂无法分相，因此必

须至少20°C以上室温离心）。

15. 溶液必须分为上下两相，否则应重复步骤13-14。上层水相含DNA，下层油状相

含内毒素和其它杂质。将含无内毒素质粒DNA的上层水相转移到新管（注意不要吸到油状层），弃油状层。

下相体积较小，室温较高（如夏季）时候可能表现为混浊，和透明的上相分层明显，如果室温较低（如冬季），下相可能表现为透明的油状物质，和透明上相分层仅仅表现为界面的折光性不一致，应该仔细观察。

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