第六章 微生物菌种的选育考试重点汇总

第六章 微生物菌种的选育

第一节 从自然界中分离筛选菌种

*1.基本步骤：采样→增殖培养→纯种分离→筛选(初筛、复筛) 2.环境条件对土壤样本中微生物分布的影响：（1） 营养环 境（2）水分（3）温度：采样以秋季为好（4）通风（5）酸碱度：细菌、放线菌：中性或偏碱；霉菌、酵母：偏酸 3. .采样方法

（1） 去除表层土

（2） 取5-15cm土样几十克，装入无菌牛皮低袋或塑料袋中 4.增殖培养（富集培养）

目的：提高样品中目的菌的数量和比例

原理：通过控制营养成分和/或培养条件，使样品中目的 菌得以大量繁殖而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓，从而提高样品中目的菌 的数量和比例

*方法：（1）控制营养成分

（2） 控制培养基pH

（3）控制培养温度：30℃左右培养，可培殖嗜温微生物50~60℃培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株

（4）热处理——增殖芽孢细菌 样品悬浮液经80℃、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌（5）添加抑制剂 5.纯种分离

（一）纯种分离的方法

目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养

方法：涂布平板分离法、倾注平板分离法、平板划线分离法、组织分离法 **（二）平皿反应快速检出法

依据是检测单菌落是否产目的产物并对目的产物的产量进行粗略估计

A纸片培养显色法：以饱浸含有某种指示剂的固体培养基的滤纸搁置在培养皿中，用牛津杯架空，下放一小团浸有3%甘油的脱脂棉保湿，用接种环将适量细胞悬液接于滤纸上，保温培养，得到分散的单菌落，菌落周围形成对应的颜色变化。指示剂变色圈与菌落直径之比值大者表示产物的产量高，由此可以挑选产量较高的菌株。所用的指示剂是酸碱指示剂或能与产物反应产生有色物质的其他指示剂。

B透明圈法：利用混浊的底物被分解后形成透明圈的大小，可以检出微生物分解利用此物质的能力。可溶性淀粉——淀粉酶，粉末碳酸钙——有机酸，酪素——蛋白酶

C变色圈法：直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，或喷洒至已形成菌落的培养基的表面，根据显色圈或变色圈等形成而对目的菌进行检出，稀碘液与淀粉 变色圈的颜色及大小 E生长圈法：生长圈法是根据工具菌在目的菌周围形成生长圈而对目的菌进行检出。工具菌一般为某种生长因子的营养缺陷型，而对目的菌在缺乏该生长因子的琼脂培养基上生长并分泌生长因子或生长后分泌的某种酶能够使前体转化为该生长因子。经过培养后，工具菌会在目的菌周围形成生长圈。生长圈法用于检出

氨基酸、核苷酸以及维生素等生产菌。

F抑菌圈法：是根据工具菌在目的菌的周围的生长被抑制而形成一个抑菌圈而对目的菌进行检出。目的菌在生长过程中能分泌抗生物质或能分泌某种酶能将无抑菌作用的前体物质转化成抗生物质，而工具菌则是对该抗生物质敏感的菌株。此法可以直接在分离培养基中对目的菌进行检出。但是由于微生物

要到生长晚期才能分泌抗生物质，需要培养的时间长，各菌产生的抗菌物质相互干扰，所以往往需要分两步进行————先用不加工具菌的琼脂培养基对样品进行纯种分离，待菌落形成后，将菌落与周围小块琼脂培养基用直径6mm的木塞穿孔器一起取出，置于另一无菌培养基中保湿培养4-5天，使微生物所产生的抗生物质在小琼脂块中积累；然后，将上述琼脂块转移到涂有工具菌的鉴定板上，保持琼脂块之间的距离为2cm左右，培养过夜后即可观察到抑菌圈，抑菌圈的大小反映了琼脂块中抗生物质浓度的高低。抑菌圈法用于抗生素产生菌的检出。 6.厌氧微生物的分离方法

厌氧微生物要求在低氧化还原电位的培养基中才能生长。保持低氧化还原电位方法：一是在培养基中加入还原物质（如半胱氨酸等）二是要为微生物创造一个无氧环境

.厌氧分离（培养）技术：高层琼脂柱技术、厌氧罐技术、厌氧手套箱技术 7.筛选

初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶 目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌

复筛：每株3~5瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，3~5%接种量， 复筛可进行多次，逐步淘汰，留下3~5株甚至最好的1株

第二节 基因突变

1.突变型的类型：

形态突变型：指细胞个体形态或菌落形态发生改变的突变型

营养突变型：野生型菌株由于基因突变而丧失合成一种或几种生长因子的能力，这种突变株叫做营养缺陷型突变株。主要有氨基酸缺陷型、维生素缺陷型和嘌呤嘧啶缺陷型

抗性缺陷型：由于基因突变而产生对某种化学药物、致死物理因子或噬菌体具有抗性的变异菌株叫抗性菌株。

致死突变型：由于基因突变而导致个体死亡的突变型

条件致死突变型：在某种条件下可以正常生长繁殖并呈现其固有表型，而在另一条件下致死的突变型

产量突变型：所产生的代谢产物的产量明显有别于原始菌株的突变株 正变株：产量高于原始菌株； 负变株：产量低于原始菌株。 2.基因突变的特点：

(1）自发性 (2）非对应性(3）稀有性 (4）性 (5）可诱 变性(6）稳定性 3.突变的类型：染色体畸变、基因突变

4.基因突变包括碱基置换和移码突变，碱基置换分为转换和颠换

5.基因突变自发性和不对应性的证明个经典实验：变量实验、涂布实验、影印实验证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！ 6.基因突变的机制可以分为自发突变和人工诱发突变两大类

第三节 诱变育种

1.诱变育种：

是选择合适的诱变因素、处理剂量及处理方法，人为地对出发菌株进行诱变，然后运用合理的筛选程序及适当的筛选方法把优良的变异菌株筛选出来。 2.诱变育种的用途

首先，通过诱变育种可以提高产物的产量，即可以获得高产突变株。 其次，通过诱变育种可以改善菌种特性。提高产品质量。 第三，通过诱变育种可以选育出更适合工业化发酵要求的突变株，简化工艺条件。 第四，通过诱变可以开发新产品。 3.诱变育种的步骤和方法

选择优良的出发菌株， 诱变菌株的培养，诱变菌悬液的制备，诱变处理，后培养，突变株的分离和筛选 4.前培养：

目的是将诱变细胞的生理状态调整到处于同步生长状态的旺盛的对数生长期，而细胞内又要含有丰富的内源性碱基。 大肠杆菌的前培养方法： （1）用培养24小时的斜面培养物接种LB液体培养基，于37℃振荡培养过夜（约16h）；

（2）以5％接种量转接新鲜LB培养基，于37℃培养4～6h，使细胞处于对数生长期；

（3）将上述培养物置4～6 ℃放1h，低温诱导同步生长；

（4）将经低温诱导的细胞以20％接种量转接新鲜LB培养基，于37 ℃振荡培养30～50min，使细胞处于同步状态，立即置冰水裕中保藏10min，离心收获细胞

产生孢子的丝状菌的前培养方法：取其孢子进行处理，因为多数丝状菌的孢子是单核。

不产生孢子的丝状真菌的前培养方法： 可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理 （1）对菌丝尖端进行诱变处理 （2）对菌落边缘菌丝进行处理

（3）对小段菌丝悬浮液进行诱变处理 5.诱变菌悬液的制备：

（1）选择合适的介质，一般可用生理盐水或缓冲液制备。 （2）使细胞或孢子处于良好的分散状态。

方法：先用玻璃珠振荡分散，然后用脱脂棉或过滤纸过滤。

理由：如果几个细胞在一起，诱变时剂量不均匀，细胞的变异情况不一致，产生误差，给筛选带来麻烦。

（3）调节适当的细胞或孢子密度。

后培养：是指诱变处理后，立即将处理过的细胞转移到营养丰富的培养基中进行培养，使突变基因稳定、纯合并表达。后培养的另一个重要作用是可以消除表型迟延，即表型的改变落后于基因突变的现象。

（1）分离性迟延：在大肠杆菌等细菌中一般含有两个核质体，突变基因常是隐性的，所以在一个核质体中发生了突变的细胞的表型还是属于野生型，只有通过细胞而出现同一细胞的两个核质体中都带有这一突变基因时，该细胞才表型出突变表型。

（2）生理性迟延：是由于原已存在的野生型基因的产物只有通过细胞的多次被”稀释“到很低的浓度以后，呈隐性的突变型才能得以表达。 常用筛选方法：

a..随机筛选（摇瓶筛选） b.平板菌落预筛

根据形态变异淘汰低产菌株

根据平皿生化反应直接挑取高产突变菌株 6.营养缺陷型菌株的筛选 *定义：从自然界中分离到的微生物在其发生突变前的原始菌株称为野生型菌株。营养缺陷型菌株是野生型菌株经过人工诱变或自发突变失去合成某种营养物质（氨基酸、维生素、碱基等生长因子）的能力，只能在完全培养基或补充了相应生长因子的基本培养基中才能正常生长的变异菌株。营养缺陷型菌株经回复突变或者重组变异后所产生的、在营养要求上与野生型相同的菌株称为原养型菌株。

基本培养基(MM)：它是仅能满足微生物野生型菌株生长要求的培养基

完全培养基(CM)：它是能满足微生物所有营养缺陷型菌株营养要求的天然或半合成培养基

补充培养基(SM)：凡是只能满足某营养缺陷型生长需要的合成培养基 *7.营养缺陷型菌株的筛选方法：

后培养、淘汰野生型、检出缺陷型、鉴别缺陷型几个步骤

后培养：在营养缺陷型菌株筛选过程中也将后培养称为中间培养

淘汰野生型：起到“浓缩”缺陷型的作用，常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。抗生素法原理（细菌—青霉素、酵母菌-制霉菌素）：野生型细胞能在基本培养基上生长繁殖，可选用某种抗生素将生长状态的细胞杀死，而留下不能生长的缺陷型。菌丝过滤法吧（真菌和放线菌）原理：使能在基本培养基上生长形成菌丝体的野生型留在滤膜上，不能生长的营养缺陷型细胞则能透过滤膜。 缺陷型的检出：

a.逐个检出法：把上述处理液在CM平板上进行分离，然后将平板上长出的菌落用无菌牙签逐个按一定次序点种到MM、CM平板上的相应位置，经过培养后逐个对照，如果发现某一位置上CM培养基上长出了菌落，而MM培养基上没有长出菌落，则可以初步认定为这是一个营养缺陷型的菌株。

b.夹层检出法：先在培养皿内部倒一层MM作底层，冷却后加上一层含处理细胞的MM层，固定后再继续加第三层MM。经过一段时间的培养，平板上长出野生型菌落，在皿底相应位置做上记号，再在上面加上一层CM，再继续培养。在加入CM新长出来的菌落，个体较小，可能是缺陷型菌落。在加入CM之前已经形成的野生型的菌落个体较大。此法虽然操作简单，但可靠性差，需要对

检出的菌落进一步确认。 c.限量补充检出法：将经过处理后的菌液接种在含有微量（0.01%或更少量）蛋白胨的MM培养基上培养，野生型迅速生长成大菌落，而营养缺陷型将较慢长成小菌落，因而可以检出，此法称为限量法。如果要筛选特定的营养缺陷型，可以在MM培养基中加入这种单一生长因子，此法为补充法。

d. 影印培养法：就是采用一种专用的接种工具--“印章”一次将CM平板上长出的菌落依次分别转接到MM和CM两个平板上，经培养，分别观察在两个平板相应位置长出的菌落，如果在CM上生长，而MM上不长，可初步认定是营养缺陷型，也可省略影印CM，因为从原CM平板上就可以比较出。

缺陷型的鉴定： 生长谱法：即在同一个平板上测定一个缺陷型菌株对多种生长因子的需求情况，由此确定该菌株是何种生长因子的缺陷型。

（1）缺陷型菌株平板的制备：

将待测微生物从生长斜面上用无菌生理盐水洗下或从液体培养物中离心收集细胞，沉淀物用生理盐水洗涤后制成浓度为106～108个细胞/ml的悬浮液。取0.1ml涂布在MM上，也可以与已融化并冷却到50℃的MM混匀，倾注平板。

（2）缺陷营养类别的确定：用于确定营养缺陷型类别的四种营养物质： ①不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合物或蛋白胨，含有氨基酸类生长因子；②水溶性维生素混合物，含有维生素类生长因子；③ 0.1％碱水解酵母核酸液，含嘌呤嘧啶类生长因子；④酵母浸出物，含有所有的生长因子。

检测方法：可用滤纸片培养法

取0.5cm直径的滤纸片沾取以上溶液，放在已接菌的平皿上四个相应位置培养，只要在此滤纸片周围菌能生长，即可说明此营养缺陷型的类别，

（3）缺陷单一营养因子的确定 营养成分编组 滤纸片培养：将沾有组合营养因子溶液的滤纸片放在涂有试验菌的MM平板上，培养后观察生长情况。 *8.抗性菌株的筛选办法： 一次性筛选法：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株的方法，称为一次性筛选。（适于不是很昂贵的药物） 梯度性筛选法：使用药物浓度梯度平板筛选在对敏感菌致死的药物浓度区生长的抗性突变株的方法叫做阶梯性筛选法。

第四节 基因重组育种

1.基因重组育种定义：通过两个细胞间遗传物质的重组而实现的工业微生物育种称基因重组育种 2. 基因重组形式 微生物类别 供体菌DNA进入重组涉及的范围 受体菌途径 有性生殖 真菌 有性孢子的接合 整个染色体组 准性生殖 真菌 体细胞的接合 整个染色体组 细菌接合 大肠杆菌等细菌 细胞间暂时沟通 部分染色体

F因子转导 放线菌接合 转导 转化 大肠杆菌等细菌 原生质体融合 细胞间暂时沟通F个别或少数基因 因子介导 天蓝色链球菌等菌丝间连接 部分染色体 放线菌 原核微生物 细胞间不接触，噬个别或少数基因 菌体介导 原核微生物 细胞间不接触，吸个别或少数基因 收游离的DNA片段 所有微生物 原生质体间的融整个染色体组 合 *3.细菌的接合

接合定义： 供体菌（“雄性”）通过性菌毛与受体菌（“雌性”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞，就是接合子。 机制(大肠杆菌的接合机制)

接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导。 F因子的四种细胞形式：

a）F-菌株， 不含F因子，没有性菌毛，但可以通过 接合作用接收F因子而变成雄性菌株（F+）；

b）F+菌株， F因子存在，细胞表面有性菌毛。

c）Hfr菌株，F因子插入到染色体DNA上，细胞表面有性菌毛。

d）F′菌株，Hfr菌株内的F因子因不正常切割而脱离染色体时，形成游离的但携带一小段染色体基因的F因子，特称为F′因子。 细胞表面同样有性菌毛。 （1）F+与F-菌株之间的接合的结果使受体菌F-菌株转变成F+菌株。当两菌株接触后，通过性纤毛所形成的接合管将两细胞沟通，供体菌中的F因子通过滚环复制产生一条单链F因子DNA，单链F因子DNA经过接合管进入受体菌细胞内，在受体菌细胞内，单链DNA的互补链合成，形成双链，通过环化形成环状F因子，最后供体菌和受体菌都为F+细胞。

（2）Hfr菌株与F-菌株的结合的结果是受体菌获得供体菌的染色体DNA片段导致基因重组形成重组子。当两菌株接触后，通过接合管将两细胞沟通，供体菌中整合有F因子的染色体片段DNA从转移起始基因oriT处开始通过接合管向受体菌中转移。 *4.转化：

定义：指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的游离DNA，并将其整合到自己染色体基因组中，从而获得后者遗传性状的现象。通过转化方式而形成的重组子，称转化子。参与转化的基因供体只是游离DNA分子，称为转化因子。

感受态:

研究发现，能发生转化的受体细胞都处于感受态。

感受态是指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。 感受态细胞具有摄取外源DNA能力的细胞。

感受态受遗传控制，但也存在个体差异。 感受态出现的时间不同；感受态细

胞所占比例和维持时间不同；外界环境因子如腺苷酸（cAMP）及Ca2+等对感受态也有重要影响。 转化过程：

每个受体细胞表面约有30-80个转化因子结合点，当转化因子结合到受体表面结合点上时，DNA一条链被受体细胞膜上的核酸酶分解，另一条链进入受体细胞，通过整合与受体细胞进行基因重组。 ①感受态细胞的建立； ②DNA的结合和摄取；

供体双链DNA与受体细胞壁上的接受位点相结合。

通过核酸酶的作用，一条链被核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。

③转化子和染色体重组

单链进入受体细胞后，与双链结构的受体染色体DNA同源片断发生交换重组 通过DNA复制和细胞而表现出转化性状，形成转化子。 *5.转导

定义：转导是以噬菌体作为媒介，将一个细胞的遗传物质传递给另一个细胞的过程。

转导分两步完成：噬菌体首先感染供体细菌，通过细菌的裂解释放出携带有供体菌染色体基因的转导噬菌体，然后转导噬菌体感染受体菌，将所携带的供体染色体基因传递到受体菌种。

转导噬菌体指的是携带有细菌染色体基因的噬菌体颗粒。

转导噬菌体内的遗传物质可以是部分噬菌体基因组和细菌染色体DNA的个别基因（如局限性转导噬菌体），也可以全部是细菌染色体DNA而不含有噬菌体基因组（如普遍性转导噬菌体）

*转导分为局限性转导和普遍性转导两类。局限性转导指的是只能传递供体细菌染色体上原噬菌体整合位点少数基因的转导，普遍性转导能传递供体细菌染色体上任何基因的转导。

普遍性转导： 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍性转导。 一般用烈性噬菌体或经过改造的温和噬菌体作为普遍性转导的媒介。 普遍性转导的三种后果

A.进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子。 B.流产转导:（一）DNA不能复制，因此群体中仅一个细胞含有DNA，而其它细胞只能得到其基因产物，形成微小菌落。（二）转导DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。

C.外源DNA被降解，转导失败。

局限性转导： 指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。

特点：①只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因，一般为噬菌体整合位点两侧的基因；②该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；③缺陷噬菌体的形成方式是由于它在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率的误切而形成；④局限转导噬菌体的产生要通过UV等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。

局限性转导与普遍性转导的主要区别：

a）局限性转导中，被转导的基因与噬菌体DNA共价连接，与噬菌体DNA一起进行复制、包装以及被导入受体细胞中。而普遍性转导包装的可能全部是宿主菌的基因。 b）局限性转导颗粒携带特定的染色体片段并将固定的个别基因导入受体，故称为局限性转导。而普遍性转导携带的宿主基因具有随机性。

第六节 菌种退化、复壮与保藏

1.退化

*菌种退化的原因：基因自发突变

退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。 自发突变率10-8~10-9

加速退化的因素：传代次数过多、不适宜的培养条件 *防止退化的措施 （1）控制传代次数

（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等 保藏培养基：

细 菌：营养琼脂 放线菌：高氏一号

霉 菌：察氏培养基 酵母菌：YEPD。

（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子 （4）采用有效的菌种保藏方法 菌种退化的表现

生产性状的劣化,遗传标记的丢失, 原有的典型性状的不典型等 菌落及细胞形态的改变、生长速度缓慢、代谢产物生产能力下降，即负突变、致病菌对宿主侵染力下降、抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱

2.复壮

狭义复壮： 在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；

广义复壮：在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称生产育种

3.菌种的保藏 （一）目的

使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理

挑选典型培养物的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。 措施

低温：生长温度低限约为-30℃，水溶液中酶促反应温度低限-140℃

干燥、缺氧、避光 缺乏营养、添加保护剂：甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白 添加酸度中和剂 三）菌种保藏方法 1、斜面保藏法

方法：接种适宜斜面培养基 → 培养 → 4℃保藏 措施：低温：4℃ 适用：各大类 保藏期：1~6个月

用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间 2、石蜡油封藏法

方法：斜面或半固体接种 → 培养 → 加无菌液蜡高出培养基1cm→4~15℃保藏

措施：低温，隔氧

适用：不能利用石油的各大类 保藏期：1~2年 优点：简便

3、砂土管保藏法

方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 保藏 措施：无营养，缺氧，干燥 适用：产孢子（芽孢）微生物 保藏期：1~10年 4、冷冻干燥保藏

方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮 → 加入安醅管中→低温冻结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检查真空度 → 保藏 措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类

保藏期：5~15年或更长

5、甘油悬液低温冷冻保藏法

方法：菌种培养 → 15~30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中 → 置 -70℃冰箱保藏

措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6、液氮保藏法

方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶中 措施：超低温（-196℃）、保护剂 适用：各大类 保藏期：>15年