中国组织工程研究与临床康复彳享７４眷剪２３筋２０１０—０６—０４出版ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＲｅｈａｂ眦ｔｗｅＴ西ｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＪｕｎｅ４，２０１０Ｖ０１．１４，Ｎｏ．２３２７易２小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞ＳＦｌ．Ｇ的培养冰☆刘峰，雷闽湘．陈慧玲ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌＳＦｌ－ＧＬｉｕＦｅｎｇ，ＬｅｉＭｉｎ－ｘｉａｎｇ，ＣｈｅｎＨｕｉ４ｉｎｇＡｂｓｔｒａｃｔＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ：Ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｆ｜ｉｎｅＳＦｌ－ＧｉｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍｏｒｕｌａｏｆｆｅｍａｌｅＣ５７ＢＵ６ｍｉｃｅｍａｔｉｎｇｗｉｔｈｍａｌｅＭ．ｓｐｒｅｔｕｓ．ＵｓｕａｌｌｙＳＦｌ一ＧｗａｓｃｕｉｆｕｒｅｄｏｌｌｔｈｅＩａｙｅｒｏｆＳＴｏｆｅｅｄｅｒｓ．ｓ１＿ｏｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｘｐｅｎｓｉｖｅ，ｗｈｅｒｅａｓｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ。．ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００８．Ｈｕｎａｌｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦｓ）ｗｅｒｅｅａｓｉｅｒｏｆｔｏｇｅｔ，ａｎｄｈａｄｍｏｒｅａｄｖａｎｔａｇｅｃｏｕｌｄａｍｐｌｉｆｙａｎｉｎｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃａｌｌｓｇｒｏｗｔｈ，ｓｕｃｈｏｆａｓｔｈｅｆｏｍｌａ廿ｏｎｔｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｃｌｏｎｅｓｊｎａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅｎｏｒｍａＩｃｅｌｌｓｉｎａｎｋａｒｙｏｐｌａｓｔｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｓｔａｔｕｓ．ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｕｓ．ｉｔｗａｓｖｅｒｙｕｓ甜ｕＩｅｓｔａｂｌｉｓｈＰｒｏｖｉｎｃｅ，ＣｈｊｎａＵｕａｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔａｍｗｈｉｃｈＳＦｌ一ＧｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏｅｘｐｌｏｒｅａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｏｕｓｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｏｆｉｓｏｌａｔｉｎｇａｎｄｃｕｌｔｕｒｉ哪ＭＥＦｓａｎｄｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓｆｏｒＦａｎｇ☆，ＳｔｕｄｙｉｎｇｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌＩ（ＳＦｌ－Ｇｃｅｌｌｓ）ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＭＥＦｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＩＣ：Ｒｆｏｒｄｏｃｔｏｒａｔｅ，Ｍ盯ＨＯＤＳ：ＴｈｅｍｏｕｓｅｐｒｉｍａｒｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ。ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００８．ＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ．Ｃｈｉｎａｌｉｕｆｅｎｇｄｙｘ＠１６３．ｃｏｒｎＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅｔｏ：ＣｈｅｎＨｕｉ－ｌｉｎｇ，ｍｏｕｓｅｆｅｔｕｓａｔ１２．５ｔｏ１４．５ｄａｙｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌａｇｅｓ．Ｔｈｅ３ｔｏ５ｐａｓｓａｇｅｓＭＥＦｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｍｙｔｏｍｙｃｉｎＣｔｏｉｎｈｉｂｉｔｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＴｈｅｔｒｅａｔｅｄＭＥＦｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｆｅｅｄｅｒｃｅｌｌｓｆｏｒｃｕＲｕｄｎｇＳＦｌ－Ｇｃｅｌｌ．ＴｈｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｏｆＳＦｌ－ＧｃａｌｌｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅＧｓｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＫＰ）ｏｆＳＦｌ－Ｇｃｅｌｌｓｗａｓｔｅｓｔｅｄ．Ｏｃｔ４ａｎｄＮａｎｏｇｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｗｅｒｅａｌｓｏｔｅｓｔｅｄｂｙＦＩＴ－ＰＣＲ．ＲＥＳＵＬＴＳＡＮＤＣＯＮＣＬＵＳｌＯＮ：ＭＥＦｓｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｆｒＯｍｍｏｕｓｅｆｅｔｕｓ．ＦｅｅｄｅｒｃａｌＩｓｐｒｅｐａｒｅｄＭＥＦｓｏｆ３ｔｏ５ｐａｓｓａｇｅｓｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｓｕｐｐｏｒｔＳＦｌ・ＧｃｅｌＩｇｒｏｗｔｈｗｉｔｈｄｅａｒｂｏｕｎｄａｒｉｅｓｏｆｃｌｏｎｅ．ＴｈｅＳＦｌ－Ｇｃｅｌｌｓｈａｄｎｏ帅ａｌｋａｒｙｏｔｙｐｅ，ｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｐｏｓＲｗｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＡＫＰａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｐＩｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ．ＴｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｒｔｉｓｏｌａｔｉｎｇａｎｄｃｕｌｔｕｄｎｇＭＥＦｓａｎｄｐｒｅｐａｒｅｄｆｅｅｄｅｒｃａｌｌｓｆｏｒｐｒｏｐａｇａｔｉｎｇａｎｄｃｕＲｕｄｎｇｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌＩｓ。ａｎｄＳＦｌ－ＧｃｅｌＩｓｃａｎｂｅｃｕＲｕｒｅｄｉｎｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｓｔａｔｅｊｎａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄｏｆｓｔｅｍＤｏｃｔｏｒ，Ａｓｓｏｃｉａｔｅｃｈｉｅｆｐｈｙｓｉｃｉａｎ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｃｅｌｌｓａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃａｌｌＳＦｌ－Ｇ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＵｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ．２０１０；１４（２３）：４３０３－４３０８．【ｈｔｔｐＪｌｗｗｗ．ｃｒｔｅｒ．ｃ，Ｎｈｔｔｐ＇Ｊ／ａｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎ】ＬｉｕＦ，ＬｅｉＭＸ。ＣｈｅｎＨＬＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ＸｉａｎｇｙａＨＯＳｐｉｔＡｌ．ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈ摘要背景：小鼠胚胎干细胞系ＳＦｌ－Ｇ是由雌性Ｃ５７Ｂｔ．／６小鼠与雄性Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ小鼠交配后，取桑葚胚期胚胎在ＳＴＯ饲养层细胞上分离培养获得，Ｓ１Ｄ细胞较昂贵，而由小鼠胚胎成纤维细胞制各的饲养层细胞不仅取材容易，而且形成胚胎干胞的克隆率、维持胚胎干细胞正常核型的能力均比Ｓ．ｒ－Ｏ细胞要好一些，因此，建立一种适宜ＳＦｌ・Ｇ细胞扩增的培养体系，保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目的：建立有效的小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及胚胎干细胞饲养层细胞制备体系；以建立有效的小鼠胚胎于细胞（ＳＦｌ－Ｇ细胞）扩增培养体系。方法：从孕１２．５—１４．５ｄ的ＩＣＲ小鼠分离培养原代小鼠胚胎成纤维细胞：取３—５代的小鼠胚胎成纤维细胞，以丝裂霉索Ｃ抑制其增殖能力制备饲养层细胞：在饲养层细胞上增殖培养ＳＦｌ一Ｇ细胞；染色体Ｇ显带分析法检测ＳＦｌ－Ｇ细胞核型，ＳＦｌ一Ｇ细胞碱性磷酸酶染色和ＲＴ－ＰＣＲ检测Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ基因表达。结果与结论：从孕鼠胚胎有效分离到小鼠胚胎成纤维细胞，以３—５代细胞制备的饲养层细胞能够支持胚胎干细胞ＳＦｌ－Ｇ呈边界清晰的克隆样牛长。染色体核型检测ＳＦｌ－Ｇ保持正常核型，碱性磷酸酶、表面标志物检测均呈阳性。实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系，并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系，能够在实验室对ＳＦｌ－Ｇ细胞保持正常未分化状态培养。关键词：小鼠：胚胎成纤维细胞：饲养细胞；胚胎干细胞：细胞培养ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３—８２２５．２０１０．２３．０２８刘峰，雷闽湘，陈慧玲．，ｊ、鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞ＳＦｌ－Ｇ的培养【Ｊ】．中国组织工程研究与临床康复，２０１０，１４（２３）：４３０３－４３０８．【ｈｔｔｐ一／ｗｗｗ．ｃｒｉｅｒ．ｏｒｇｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ曲ａ４１０∞８．ＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ。Ｃｈｉｎａｈｕｉｌｉｎｇｃｈａｎｇ＿８＠ｈｏｆｍａＪｌ．ｃＯｍＳｕｐｐｏｒｔｅｄｂｙ：ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄ删ＯｌｌｏｆＣｈｉｎａ，Ｎｏ．３０７＿７１０２５．Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０１０－０３．２４Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０１０－０５－１２中南大学湘雅医院内分泌科，湖南沙市４１∞∞刘峰☆，男，１９８０牟生，江西省安福县人，汉族，中南大学在读博士，主要从事糖尿病及其并发症的研究。ｌｉｕｆｅｎｇｄｙｘ＠１∞．ｃｏｒｎ胞成为生物医学领域的研究热点之一。０引言。胚胎干细胞体外培养条件要求非常严格，在体外极易分化、死亡，保持其未分化状态生长是充分利用胚胎干细胞资源的前提。目前，要保持其未分化状态生长，必须在培养基中加通讯作者：陈慧玲，博士，副主任医师，中南大学湘雅医院内分泌科，湖南沙市４１ｏ（）０８胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团和原始生殖细胞中分离出来的全能干细胞［１－２］，具有无限增殖和全能分化的潜力。在研究生长发育胚胎发育、遗传疾病、肿瘤发生的理想模型，组织再生工程中具有广阔的临床应用价值，为疾病治疗提供了崭新的思路。近年来，胚胎干细ｈｕｉｌｉｎｇｃｈｅｎｇ．８＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ中图分类号：Ｒ３９４．２文献标识码：Ｂ文章编号：１６７３－８２２５入分化抑制因子一一自血病抑制因子（１ｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ，ＬＩＦ）或将其培养在（２０１０）２３－０４３０３－０６收稿日期：２０１０－０３－２４修回日期：２０１０－０５－１２（２０１００３２４０１３／Ｗ‘Ｑ）能分泌分化抑制因子且无增殖能力的饲养层细胞上例，ＭＥＦ饲养层作为一种哺乳动物胚胎干万方数据铷峰．等’，ｊ、鬣锶葬甚细艉翱备ｓ，Ｊ、鼠驻眙于细匏ＳＦｌ－Ｇ的培养细胞支持培养最早和常用的方法［１－２］，能产生抑制胚胎干细胞自主分化和促进胚胎干细胞增殖的因子，故能有效地促进胚胎干细胞的增殖并维持其未分化特性和多潜能性，且分泌效果优于外源添加的一些因子，而且可以为胚胎干细胞的培养提供类似于体内的微环境。小鼠胚胎干细胞系ＳＦｌ・Ｇ是由雌性Ｃ５７ＢＬ／６小鼠与雄性Ｍ．ｓｐｒｅｔｕｓ小鼠交配后，取桑葚胚期胚胎在ＳＴＯ饲养层细胞上分离培养获得１４Ｊ，建立稳定的体外传代方法，是利用和研究胚胎干细胞的关键，因此，实验探讨建立本实验室小鼠胚胎成纤维细胞（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃ次晨和下午分别查阴栓１次，见阴栓者计为妊娠０．５ｄ。取妊娠１２．５—１４．５ｄ孕鼠。断颈处死孕小鼠，于体积分数为７５％医用乙醇中浸泡一两分钟。将孕鼠提出，在超净台内无菌取出子宫，置于盛有Ｄ．ＰＢＳ的１００ｍｍ培养皿中，Ｄ—ＰＢＳ清洗１次，吸去废液。在体式镜下用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠６—８只，去除胎鼠头、尾、四肢和内脏，Ｄ－ＰＢＳ洗涤３次后，将胎体充分剪碎。加入０．５ｇ，Ｌ胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ１０ｍｌ吹打成混悬液，于３７℃消化５ｍｉｎ，后加入等量的含体积分数为１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液中和胰蛋白酶的消化，转入５０ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，ＭＥＦｓ）分离和培养体系，并将此饲养层细胞用于培养ＳＦｌ・Ｇ细胞，了解传代后千细胞的特性，为进一步进行胚胎干细胞研究奠定基础。１材料和方法设计：单一样本观察。时间及地点：实验于２００９－０６／０８在中南大学生殖与干细胞工程研究所完成。材料：实验动物：清洁级雌性ＩＣＲ小鼠，７０ｇ，由中南大学实验动物学部提供，许可证号ＳＣＸＫ（沪）２００７．０００５。小鼠胚胎干细胞系ＳＦｌ－Ｇ由美国斯坦福大学Ｈｏｆｆｍａｎ教授馈赠。实验过程中对动物处置符合２００６年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》［ｏ－３。主要试剂和仪器：ｍＬ的离心管，并充分吹打细胞悬液后，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，弃上清。最后加入含体积分数为１０％胎牛血清的．ＤＭＥＭ培养液重悬细胞，室温静置两三分钟，待未剪碎细胞团块完全沉至离心管底，吸取上清细胞悬液至另一５０ｍＬ离心管中，补充培养基并混悬细胞液均匀种至两个Ｔ１７５培养瓶中，补充ＭＥＦ培养基至Ｔ１７５培养瓶中至细胞悬液为２５ｍＬ，并将培养瓶移入３７℃，体积分数为５％Ｃ０２，恒温培养箱中培养。原代细胞贴满瓶底达到９０％以上汇合，吸去培养瓶内的培养基，Ｄ－ＰＢＳ冲洗１遍，分别在各培养瓶内加入２ｍＬ０．５ｇ／Ｌ胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化液，于３７℃孵育消化１ｍｉｎ后，倒置相差显微镜下观察细胞收缩变圆后，用手轻拍培养瓶侧壁，细胞层随之从瓶底脱下，此时加入等量含体积分数为１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化，用移液器充分吹打下瓶壁上的细胞并把细胞吹打散，将细胞悬液转入１５ｍＬ离心管，１０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，弃上清。加入新鲜的ＭＥＦ培养基５ｍＬ重悬主要试剂和仪器Ｋｎｏｃｋｏｕｔ来源Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ公司细胞，按１：４传代到新培养瓶，补足ＭＥＦ培养基，移入３７℃，体积分数为５％Ｃ０２，恒温培养箱中培养。原代分离的细胞记录为Ｐ０代，按１：４传代后记录Ｐ１代，约三四天长到９０％以上汇合度可再次传代或冻存，下一代为Ｐ２代，以此类推。ＭＥＦ饲养层细胞的制备１６】：①取３—５代内长至８０％一９０％汇合的ＭＥＦｓ，吸去原培养基，加入终浓度为１０ｍｇ／Ｌ丝裂霉素Ｃ的ＭＥＦ培养基６ｍＵｌ００ｍｍＤＭＥＭ培养基、ＤＭＥＭ高糖培养青链霉素、胰酶和基、胎牛血清、Ｌ一谷氨酰胺、Ｂ一巯基乙醇、非必需氨基酸、ＴＲ亿ｏＬ。白血病抑制因子（ＵＦ）丝裂霉素Ｃ、明胶（Ｇｅｌａｔｉｎ）、碱性磷酸酶检测试荆盒均反转录试剂盒、ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｃ０２培养箱９７００Ｃｈｅｍｉｃｏｎ公司Ｓｉｇｍａ公司Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司德周Ｔｈｅｒｍｏ公司美国ＰＥ公司日本Ｎｉｋｏｎ公司ＰＣＲ仪细胞培养皿处理细胞２．５ｈ。②弃去培养基，每次加５ｍＬＤ－ＰＢＳ充分洗涤细胞３遍，完全去除丝裂霉素Ｃ，加ｇ／Ｌ胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ３７℃孵育消化１ｍｉｎ后，倒置相差显微镜下观察细胞收缩变圆后，用手轻拍２ｍＬ０．５相差显微镜、体式显微镜ＭＥＦ培养基：基础培养基为ＤＭＥＭ（葡萄糖４．５ｇ／Ｌ），使用前添加体积分数１０％胎牛血清、１００Ｕ的青、链霉素；胚胎干细胞培养基：基础培养基为ｋｎｏｃｋ．ｏｕｔＤＭＥＭ，含０．１ｍｍｏｌ／ＬｌＢ－ＭＥ、２ｍｍｏｌ／ＬＬ一谷氨酰胺、１％非必需氨基酸、体积分数为２０％胎牛血清、１０００Ｕ／ｍＬＬＩＦ、１００培养瓶侧壁，细胞层随之从瓶底脱下，此时加入等量含体积分数为１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液终止消化。③收集细胞至１５ｍＬ离心管，１０００ｒ／ｍｉｎ，３ｍｉｎ离心后去除上清，用ＭＥＦ培养基重悬细胞，调整细胞密度为２．５ｘ１０５细胞／孔种植于经１ｇ／Ｌ明胶包被的６孔培养板中，置３７℃，体积分数为５％Ｃ０２，恒温培养箱培养，２４ｈ后可作饲养层细胞使用，用前去除原培养基，Ｄ－ＰＢＳ洗后更换成胚胎干细胞培养基即可供胚胎干细只０．Ｂｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｃｎ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｒｎＵ的青、链霉素。实验方法小鼠胚胎成纤维细胞分离培养嘲：原代小鼠胚胎成纤维细胞分离培养：选取６—１０周龄ＩＣＲ雌雄鼠１：１合笼，４３０４万方数据铷峰．等．小鼠饲荐甚细匏翻各与小鼠驻髓干细匏￥Ｆ１・Ｇ的培养胞培养用。小鼠胚胎干细胞的培养：将小鼠胚胎干细胞复苏到制备好的的饲养层细胞，第２天开始呈克隆样增殖，每天换液，第４天细胞生长至７０％一８０％的汇合度，进行传代。吸去旧培养基，加１ｍＬ录因子的表达。反应程序条件：在ＰＥ９６００型ＰＣＲ扩增仪上完成ＰＣＲ扩增，条件如下：９４℃预变性４完成３０个循环，７２℃５泳结果并摄像。胚胎干细胞全能性表达基因的引物序列和ＰＣＲ反应条件：ｍｉｎ，４ｍｉｎ后，９４℃变性３０ｓ，６０℃退火３０ｓ，７２１２延伸３０ｓ，１２保温，产物在２％琼Ｄ—ＰＢＳ洗去残余培养基，脂糖凝胶进行电泳，溴乙锭染色，．紫外投射仪上观察电加入０．５ｇ／Ｌ胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化液５００ｐＬ，３７℃孵育１ｍｉｎ，相差显微镜下观察胚胎干细胞克隆开始分散开脱落。加入２ｍＬ胚胎干细胞完全培养基终止消化并用移液器轻柔吹打，进一步将贴壁细胞吹落，将细胞团分散开呈单个细胞。将消化后的细胞混悬液移入１５基因名称产物长度引物序列退火温度ｍＬ离心管，１０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃上清。加入小鼠胚胎干细胞完全培养基重悬细胞。计数细胞悬液，按约５ｘｌ０。个／孔接种到６孔板的各个孔中（基本是１：５～６）传代，放入３７℃、体积分数为５％Ｃ０２培养箱培养。胚胎干细胞鉴定：．胚胎干细胞的核型分析：①标本制备：取传代培养至第３天的胚胎干细胞，在培养基中加入秋水酰胺至终浓度为０．０６ｍｇ／Ｌ，３７℃处理１ｈ，胰酶消化收集细胞，离心后加Ｋｃｌ低渗溶液，３７℃低渗处理；加入新鲜配制的固定剂（甲醇：冰醋酸＝３：１），进行预固定；离心去上清液后，再加入固定剂，轻固定１ｈ以上，制成细胞悬液，用吸管将２滴细胞悬液滴在用冰上预冷的载玻片上。②染色体显带：将带有细胞标本的玻片置于７５—８０℃的烤箱中烤片３ｈ后，进行Ｇ显带处理。用８．５ｇ，Ｌ的ＮａＣＩ溶液将１０ｇ／Ｌ的胰酶配制成０．２５ｇ／Ｌ的浓度；主要观察指标：ＭＥＦ、ＳＦｌ－Ｇ细胞形态，ＳＦｌ一Ｇ细胞核型检测，胚胎干细胞碱性磷酸酶染色，ＦｌＴ－ＰＣＲ检测ＳＦｌ一Ｇ细胞Ｏｃｔ４，Ｎａｎｏｇ表达。设计、实施、评估者：设计为通讯作者，实施为第一作者，评估者为第一及第二作者。作者均经过正规的细胞培养及分子生物学实验训练。２结果向上述溶液中加入４ｇ／Ｌ的酚红（２滴肋ｍＬ），混匀，然ｍＬ后用０．１ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ将溶液调ｐＨ至橙红色；用染色缸盛５０—６０ｍＬ双蒸水，加入４Ｇｉｅｍｓａ原液，２．１混匀；将玻片置胰酶中消化适当时间；立即投入Ｇｉｅｒｎｓａ染色缸中染色１５ｍｉｎ，用自来水冲洗，空气干燥，树胶封固后在油镜下观察结果。③核型分析：在显微镜高倍ＭＥＦｓ的生长形态观察ＭＥＦｓ在体外为贴壁生长型细胞，大小不均匀，原代培养２ｈ左右即开始贴壁，培养至五六个小时时细胞已绝大部分贴壁，１２ｈ后开始增殖，当达到一定的密度（７０％一８００／ｏ汇合），细胞增殖更迅速。相差显微镜下观察，细胞多有长短不等的数个突起，呈梭形、不规则三角形或扇形，核为卵圆形，位居胞质，其间混杂有扁平多角形，紧密相靠的上皮样细胞胞质向外伸出伪足而形成梭形、多边形或不规则形等形状。原代ＭＥＦ细胞中杂细胞较多，随着传代杂细胞会减少，细胞越来越纯，至第３代，即可得到较纯的ＭＥＦ细胞，第５代以后，可见细胞伪足增多，并有分叉，细胞内颗粒增多，细胞之间空隙较大，见图１。２－２饲养层细胞生长形态观察用含１０ｍｇ／Ｌ丝裂霉素Ｃ培养基处理ＭＥＦ细胞２．５ｈ后，ＭＥＦｓ失去有丝的增殖能力，但保持一般的生长活性，按适当密度接种后能很好的支持胚胎干细胞生长，饲养层细胞制备２４ｈ后就可以投入使用，但最长时间不超过１周，见图２。目镜下检查显带标本，在染色体上若出现清晰的深浅相问的带型，即为可取标本，可供摄像分析。采用Ｌｕｃｉａ染色体分析软件至少分析２０个相。胚胎干细胞碱性磷酸酶的检测：将培养于ＭＥＦ饲养层细胞上的胚胎干细胞经Ｄ－ＰＢＳ冲洗尽量去除残余培养基；室温加入４０ｇ，Ｌ多聚甲醛固定细胞３０ｍｉｎ；去除固定液，采用去离子水３次；按照试剂盒说明，按照试剂说明配方（１药片＋５ｍＬ反应液）新鲜配置的染液染色，加入染液覆盖细胞染色；室温下避光染色１察并摄像。ＲＴ－ＰＣＲ检测胚胎干细胞全能性基因Ｏｃｔ．４和Ｎａｎｏｇ的表达：按ＴＲＩＺＯＬ说明书提取胚胎干细胞和ＭＥＦ细胞总ＲＮＡ，按反转录试剂盒说明将ＲＮＡ合成ｃＤＮＡ，以１３．ａｃｔＪｎ作为内参ＰＣＲ扩增Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ转５ｍｉｎ；当染色满意时，用去离子水洗涤３次；相差显微镜下观钙０５万方数据《醪２７易２ｗ眦钾觚啷覆ＭＥＦｓａｔＰａｓｓａｇｅ３，ｎｏｂ：ＭＥＦｓ越Ｐａｓｓａｇｅ３ｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍｌｔｏｍｙｃｉｎＣｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｌｔｏｍｙｃｉｎＣｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｇｒｏｗｉｎｇｏｎｔｈｅｇｅｌｅｔｉｎＦｉｇｕｒｅ２Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎ虻ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ（ＭＥＦｓ）ｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒｍｉｔｏｍｙｃｉｎＣｔｒｅａｔｍｅｎｔ图２丝裂霉索Ｃ处理前后的ＭＥＦ细胞２．３培养于ＭＥＦ饲养层细胞上的ＳＦｌ．Ｇ细胞形态ＳＦｌ－Ｇ细胞在有饲养层细胞和含ＬＩＦ的培养条件下能保持未分化状态快速增殖，细胞在饲养层上呈克隆样生长，边界清晰，立体感强，细胞排列紧密，生长迅速，见图３ａ，ｂ。在饲养层细胞上连续传代以后，其细胞形态、克隆形状及增殖速度未发生明显变化。而在无饲养层细胞的明胶包被的皿上传代培养的胚胎干细胞，呈自发性分化趋势，见图３ｃ。２．４胚胎干细胞鉴定ＳＦｌ－Ｇ细胞核型检测：胚胎干细胞对体外的培养环境要求极为严格，一旦培养条件及环境改变，或者不正确的培养操作均会导致细胞的分化甚至影响胚胎干细胞表型的改变。本实验中培养的ＳＦｌ－Ｇ细胞在有饲养层细胞及ＬＩＦ的分化抑制培养基培养下呈克隆性增殖，经细胞染色体核型检测，结果显示为稳定的二倍体核型３８＋ＸＹ，没有发现异常的缺失，扩增，移位等，见图４。万方数据Ａｑ峰．等西鼠诵葬詹细瞻裁备ｓ小鬣旺眙于细胞ＳＨ・Ｇ的培荐胚胎千细胞碱性磷酸酶染色结果：碱性磷酸酶在未分化的胚胎干细胞中高表达，分化后表达下降或检测不到通过对碱性磷酸酶的检测来反应胚胎干细胞的未分化状态，见图５。岂ＳＦｌ－ＧｃｅｌＩｓｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｔｈｅｂ：ＳＦｌ－ＧｃｅｌＩｓｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｔｈｅｆｅｅｄｅｒｓｂｅｆｏｒｅＡＫＰｓｔａｉｎｉｎｇｆｅｅｄｅｒｓａｆｔｅｒＡＫＰｓｔａｉｎｉｎｇＦｉｇｕｒｅ５ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＳＦｌ－Ｇｃｕｌｔｕｒｅｄｏｎｔｈｅｆｅｅｄｅｒｓｂｅｆｏｒｅａｎｄａｆｔｅｒａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＫＰ）ｓｔａｉｎｉｎｇ（ｘｌ００）图５饲养层细胞上培养的ＳＦｌ－Ｇ细胞碱性磷酸酶染色前后对比图（ｘ１００）ＰＱＢｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｃｎ．ｚｇｉｃｋｆ．ｃｏｍ胡峰．等．小鬣镧葬莹细胞翩各ｓ小镀驻眙干缎瞻ＳＦｌ一Ｇ的培养图５显示培养在ＭＥＦ饲养层上的ＳＦｌ一Ｇ细胞碱性磷酸酶检测结果为阳性，克隆呈红色。胚胎千细胞多能性基因表达检测结果：Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－４是多潜能细胞特异性表达的转录因子，在未分化的胚胎干细胞中高表达，目前广泛地用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态。实验通过ＲＴ－ＰＣＲ对纯化后ＳＦｌ一Ｇ细胞的Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ－４基因ｍＲＮＡ表达水平检测结果，见图６。１：ＲＴ－ＰＣＲｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｌｓｆＭＥＦｓ）；２：ＲＴ－ＰＣＲｏｆＳＦｌ一Ｇ：３：ＰＣＲｏｆＲＮＡｏｆＳＦｌ一ＧＦｉｇｕｒｅ６Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｒ℃ｙｇｅｎｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｍｂｗｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ图６胚胎干细胞多能性基因的检测结果３讨论自胚胎干细胞建系以来，体外维持胚胎干细胞未分化状态增殖培养就成为研究胚胎干细胞生物学特点的前提基础。胚胎干细胞培养主要采用饲养层细胞，它已形成一种常规且稳定的胚胎干细胞培养方式。但是，由于加入了经处理的饲养层细胞，在后续研究过程中，可能干扰某些结果的分析，因此，目前也有很多方法来探讨建立无饲养层细胞的胚胎干细胞培养体系Ｖ～，但是，这类方法如果不加入一些特殊因子，都只能短期保持胚胎干细胞的未分化状态，不利于长期培养。研究表明，饲养层细胞向培养液中分泌各种因子来促进胚胎干细胞生长１１ｕＪ，并维持细胞核型正常，因此，饲养层细胞已常规用于各种胚胎干细胞培养过程【１旷｜２｜。从本实验结果中也发现，ＳＦｌ・Ｇ细胞在有饲养层细胞和含ＬＩＦ的培养液中呈克隆样生长，边界清晰，立体感强，细胞排列紧密，生长迅速，见图３ａ，ｂ。在饲养层细胞上连续传代以后，其细胞形态、克隆形状及增殖速度未发生明显变化。而在无饲养层细胞的明胶包被的皿上传代培养的胚胎干细胞，呈自发性分化趋势，见图３ｃ，提示要获得生长状态良好的ＳＦｌ－Ｇ细胞，饲养层细胞非常重要。目前，用于制备饲养层的细胞有原代培养的小鼠胚胎成纤维细胞，已成系的小鼠成纤维细胞系ＳＴＯ细胞（来源于近交系ＳＩＭ小鼠细胞转染了ｎｅｏ或ＬＩＦ基因【１训），经ｙ射线或丝裂霉素Ｃ处理以抑制其有丝活性，然后接种至明胶包被的细胞培养皿，作为胚胎干万方数据＠２历２～一。俘细胞培养的饲养层细膨。４。。其中原代小鼠胚胎成纤维细胞取材容易，价格低廉，在胚胎干细胞建系、扩增培养中最为常用。虽然ＳＴｏ细胞在体外可以长期传代，但从ＳＴＯ饲养层细胞培养的囊胚内细胞团分离的胚胎干细胞存活率和嵌合力均低于ＭＥＦ饲养层细胞，而且在Ｓ１０饲养层上生长的胚胎干细胞发生核型异常的比例比ＭＥＦ上要高，其原因可能Ｓ１－Ｏ细胞在保存及长期培养过程发生变异，分泌分化抑制物的机能降低１１Ｈ叫。另外，小鼠胚胎成纤维细胞作为有限传代细胞，要满足胚胎干细胞传代培养的需要，必须不断从孕鼠分离培养小鼠胚胎成纤维细胞来制备饲养层细胞。因此，有效地从孕小鼠分离胚胎成纤维细胞，同时制备供胚胎干细胞培养的饲养层细胞是利用胚胎干细胞作为研究材料的基础。本研究参照目前较规范的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养方法【１刀，在实验室分离培养获得小鼠胚胎成纤维细胞，并制备了饲养层细胞，能够很好的支持胚胎干细胞生长。碱性磷酸酶是一种单脂磷酸水解酶，它能在碱性条件下水解磷酸单酯，释放出磷酸。碱性磷酸酶的高表达，与未分化的多能干细胞相关，未分化胚胎干细胞中表达丰富的碱性磷酸酶，而在已分化的胚胎干细胞中表达减少或消失，碱性磷酸酶染色可作为检测胚胎干细胞未分化状态的一个重要的标志【１盹”。Ｏｃｔ４是ＰＯＵ家族中的一员，高水平的Ｏｃｔ４的表达被认为与全能性有关［２２－２３］，而Ｎａｎｏｇ是另一个与细胞全能性密切相关的基因标志物［２４－２５］，它是维持胚胎干细胞全能性的管家，在一定的培养条件下通过抑制分化相关基因，阻止胚胎干细胞向原始内胚层、神经元、中胚层分化，正因为如此，Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ．４目前也同样广泛地用于鉴定胚胎干细胞是否处于未分化状态［２６－３０］。作者成功地在饲养层细胞上扩增培养ＳＦｌ．Ｇ细胞，且经碱性磷酸酶染色，全能性基因Ｏｃｔ・４、Ｎａｎｏｇ表达检测，证实培养的ＳＦｌ．Ｇ细胞处于多潜能未分化状态。通过实验成功底从孕小鼠分离培养小鼠胚胎成纤维细胞，并制备好供胚胎干细胞系ＳＦｌ－Ｇ生长饲养层细胞，经检测在制备的饲养层细胞上生长的ＳＦｌ－Ｇ细胞能够保持正常核型及未分化的多潜能状态，为今后利用该细胞作为研究材料奠定了基础。【１】ＥｖａｎｓＭＪ，ＫａｕｆｍａｎＭＨ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｉｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆｐｌｕｒ．ｐａ怕ｎｔ酬ｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓ．Ｎａｔｕｒｅ．１９８１；２９２（５８１９１：１５４－１５６．【２１ＭａｒｔｉｎＧＲ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｃｅｌ｜ＩｉｎｅｆｒｏｍｅａｒｌｙｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｍｅｄｉｕｍｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｂｙｔｅｒａｔｏｃａｒｃＪｎｏｍａｓｔｅｒｎｃｅｌｌｓ．ＰｒｏｃＮａｔＩＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９８１：７８（１２）：７６弘７６３８．【３】ＳｍｉｔｈＡＧ，ＨｏｏｐｅｒＭＬ．ＢｕｆｆａｌｏｒａｔＩｉｖｅｒｃｅｌＩｓｐｒｏｄｕｃｅａｄｉｆｆｕｓｉｂｌｅａｃｔｉｖｉｔｙｗｈｉｃｈｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｕｒｉｎｅｅｍｂｒｙｏｎａＩｃａｒｃｉｎｏｍａａｎｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＤｅｖＢｉ０１．１９８７；１２１（１）：１－９．【４】ＬｌＴＶｕＴＨ，ＵｌａｎｅｒＧＡ，ｅｔａ１．１ＶＦｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｅｎｏｖｏＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎａｎｄｈｉｓｔｏｎｅｍｅｔｙｌａｔｉｏｎａｔａｎＩｇｆ２－Ｈ１９ｉｍｐｎｍｉｎｇｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓｗｉｔｃｈ．ＭｏｌｅＨｕｍＲｅｐｒｏ．２００５：１１（９）：６３１—６．∞．４３０７４参考文献２历２一饷矾叼ｆ５】ＴｈｅＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ１ＩｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅＰｅｏｐｌｅ＇ｓＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＣｈｉｎａ．ＧｕｉｄａｎｃｅＳｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓｆｏｒｔｈｅＣａｒｅａｎｄＵｓｅｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌｓ．２００６－０９—３０．中华人民拭和国科学技术部．关于善待实验动物的指导性意见．２００６－０９—３０．嘲ＳｃｈａｔＩｅｎＧ。ＳｍｉｔｈＪ，ＮａｖａｒａＣ，ｅｔａ１．Ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ．２００５；２ｆ６）：４５孓４６３．１７ＩＨａｎＦ，ＹｅＲ。ＢａｏＩ．Ｊ，ｅｔａ１．ＳｕｚｈｏｕＤａｘｕｅＸｕｅｂａｏ：Ｙｉｘｕｅｂａｎ．２００９，（０２）韩带，叶荣，鲍挪君，等，小鼠胚胎干细胞无饲养层细胞培养及其生物学特性Ｍ．苏州大学学报：医学版，２００９，（０２）嘲ＳａｔｏＨ，ＡｍａｇａｉＫ，ＳｈｉｍｉｚｕｋａｗａＲ，ｅｔａ１．Ｓｔａｂｌｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｓｅｒｕｍ－ａｎｄｆｅｅｄｅｒ－ｆｒｅｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄｍｉｃｅｗｉｔｈｆｕｌｌｆｉｎｌｌｎｎｅ—ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｙｂｙｕｓｉｎｇａＧＳＫ３ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｊｔｏｔ．Ｇｅｎｅｓｉｓ．２００９（４７）：４１４－４２２．【９】ＺｈａｎｇＸ，ＷａｎｇＳ，ＹａｎｇＳ，ｅｔａｔ．Ｆｅｅｄｅｒｓｔｅｍｌａｙｅｒ－ａｎｄｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｒｈｅｓｕｓｍｏｎｋｅｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌｌｓ．ＲｅｐｒｏｄＢｉｏｍｅｄＯｎｌｉｎｅ．２００６：１３（３）：４１２—４２０．【１０］ＧｅｅｎｓＭ，ＭａｔｅｉｚｅＩＩ，ＳｅｒｍｏｎＫ，ｅｔａ１．ＨｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌＩＩｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｅｍｂｒｙｏｓ．Ｈｕｍｓｉｎｇｌｅｂｌａｓｔｏｍｅｒｅｓｏｆｔｗｏ４－ｃｅｌｌｓｔａｇｅＲｅｐｒｏｄ．２００９：２４（１１１：２７０９．２７１７．ｆ１１１ＬＩＨ，ＬａｍＡ，ＸｕＡＭ，ｅＩａｔ．ＨｉｇｈｄｏｓａｇｅｏｆＥｘｅｎｄｉｎ．４ｉｎｃｒｅａｓｅｄｅａｒｌｙｉｎｓｕｌｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｂｅｔａｃｅｉｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＡｃｔａＰｈａｒｍａｃｏｌＳｉｎ．２０１０；３１ｆ５）：５７０－５７７．【１２］ＨｏｖａｔｔａＯ，ＪａｃｏｎｉＭ，Ｔ６ｈ６ｎｅｎｖ，ｅｔａ１．Ａｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ—ｌｉｋｅｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌＩ（ｈＥＳＣ）ＩｉｎｅａｎｄｆｏｕｒｈＥＳＣＩｉｎｅｓｒｅｖｅａＩｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙｏｎｃｏｇｅｎｉｃｇｅｎｏｍｉｃｃｈａｎｇｅｓ．ＰＬｏＳＯｎｅ．２０１Ｏ２３；５（４）：ｅ１０２６３．【１３］Ｐｅａｓｅｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｓＳ，ＢｒａｇｈｅｔｔａＰＩＧｅａｒｉｎｇＤ．ｅｔ。ａ１．ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｅｍｂｒｙｏｎｉｃｉｎｍｅｄｉａｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄｗｉｔｈｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＩｅｕｋｅｍｉａｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）．ＤｅｖＢｉ０１．１９９０；１４１（２）：３４４－３５２．【１４】ＰｉｅｄｒａｈｉｔａＪＡ，ＡｎｄｅｒｓｏｎＧＢ，ＢｏｎｄｕｒａｎｔＲＨ．ｆｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｆｅｅｄｅｒｌａｙｅｒｔｙｐｅｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐｏｒｃｉｎｅｅｍｂｒｙｏ－ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｌｌＩｉｎｅｓ．ＴｈｅｎｏａｅｎｏＩｏａｙ．１９９０：３４（５）：８６５・８７７．【１５】ＳｕｅｍｒＨ。ＮａｋａｔｓｊｕｉＮ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｍｂｒｙｏ－ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍ（ＥＳ）ｃｅｌｌｌｉｎｅｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｆｅｅｄｅｒｃｅｌＩｌａｙｅｒ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＧｒｏｗｔｈａｎｄＤｉｆｆｅｒ．１９８７；２９（２）：１３３－１∞．【１６】ＳｕｋｏｙａｎＭＡ，ＶａｔｏｌｉｎＳＹ，ＧｏｌｕｂｉｔｓａＡＮ，ｅｔ，ａ１．Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍｏｒｕｌａｅ，ｉｎｎｅｒｃｅｌＩｍａｓｓ．ａｎｄｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓｏｆｍｉｎｋ：ｃｏｍｐａｎｓｏｎｓｏｆｔｈｅｉｒｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｉｅｓ．ＭｏｌＲｅｐｒｏｄＤｅｖ．１９９３；３６（２）：１４８－１５８．【１７】ＣｈｅｎＨ，ＱｉａｎＫ，ＺｈａｎｇＳＭ，ｅｔａ１．ＥｌｅｃｔｏｆｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｏｆＫｕｎｍｉｎｇｗｈｉｔｅｍｉｃｅｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｉｎｅｃｕｌａｔｉｎｇｄｅｎｓｉｔｉｅｓｏｎｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ．２００７；１１（３）：４４３－４４６．【１剐ＤｕＬ，ＬｊｎＧ，ＬｕＧＧｅｎｅｒａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｌｕｄｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｃｅｌｌｓｂｙ４ｄｅｆｉｎｅｄｆａｃｔｏｒｓ．ＺｈｏｎｇＮａｎＤａＸｕｅＸｕｅＢａｏＹｉＸｕｅＢａｎ．２００９：３４（１２ｌ：１１５７一＂６５．【１９】ＬｉＣ，ＺｈｏｕＪ。ＳｈｉＧｅｔａ１．ＰｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｃａｎｂｅｒａｐｉｄｌｙａｎｄｅｆｆｉｄｅｎｔＩｙｉｎｄｕｃｅｄｉｎｈｕｍａｎａｍｎｉｏｔｉｃｆｌｕｉｄ—ｄｅｒｉｖｅｄｃｅｉｌｓ．ＨｕｍＭｏｌＧｅｎｅｔ．２００９：１８（２２１：４３４０－４３４９．［２０】ＤｏｎｇＷＺ，Ｓｈｅｎｗｚ，ＨｕａＪＬ，ｅｔａ１．【ＳｔｕｄｙｏｎｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＥＳ．１ｉｋｅｃｅｌｌｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍａｌｅｇｅｒｍｓｔｅｒｎｃｅｌｌｓｏｆｂｏｖｉｎｅｆｅｔｕｓｅｓ】ＳｈｅｎｇＷｕＧｏｎｇＣｈｅｎｇＸｕｅＢａｏ．２００７；２３（４）：７５１－７５５．【２１】ＺｈｕＳＸ，ＳｕｎＺ，ＺｈａｎｇＪＰ．Ｏｖｉｎｅ（Ｏｖｉｓａｒｉｅｓ）ｂｌａｓｔｕｌａｆｒｏｍａｎｉｎｖｉｔｒｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ．Ｚｙｇｏｔｅ．２００７：１５（１）：３５－４１．【２２】ＬｉＤＷ，Ｉ＿ｉＷＹＳｈｅｎｇｗｕｘｕｅＺａｚｈｉ．２００７：２４：６－８．李尔伟，李交雍．转录园子Ｏｄ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ在早期胚胎发育过程中的表达【Ｊ】．生物学杂志，２００７；２４：６－８．万方数据铷峰．等西鬣饲葬甚缎胞锄备ｓ小鬣狂齄于细匏ＳＦｌ－Ｇ的培养【２３１ＮｉｗａＨ．ＭｉｙａｚａｋｉＪ，ＳｍｉｔｈＡＧＱｕａｎｔｉｔａＵｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＯｃｔ－３，４ｄｅｆｉｎｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｒｓｅｌｆ．ｒｅｎｅｗａＩｏｆＥＳｃｅｌｌｓ．ＮａｔＧｅｎｅｔ．２０００；２４（４）：３７２－３７６．【２４１ＮｉｗａＨ．Ｈｏｗｉｓｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｎｄｍａｉｎｔａｉｎｅｄ？Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．２００７：１３４（４）：６３５・６４６．【２５】ｃｈａｍｂｅｒｓＩ，ＣＯｌｂｙＤ，ＲｏｂｅｒｔｓｏｎＭ，ｅｔａ１．ＦｕｎｃｔｉｏｎａＩｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｌｏｎｉｎｇｓｔｅｍｏｆＮａｎｏｇ，ａｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｓｕｓｔａｉｎｉｎｇｆａｃｔｏｒｉｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｃｅｌＩｓ．Ｃｅｌｌ２００３：１１３（５）：６４３－６５５．ｆ２６】ＮｉｗａＨ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｏｍａｉｎｔａｉｎｓｔｅｒＲｃｅｉＩｒｅｎｅｗａｌｏｆＥＳｃｅｌｌｓ．ＣｅｌＩＳｔｒｕｃｔＦｕｎｃｔ．２００１：２６（３）：１３７．１４８．［２７１ＭｉｔｓｕｉＫ．ＴｏｋｕｚａｗａＹＩｔｏｈＨ．ｅｆａＩ．１１１ｅｈｏｍｅｏｐｒｏｔｅｉｎＮａｎｏｇｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅｏｆｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙｉｎｍｏｕｓｅｅｐｉｂｌａｓｔａｎｄＥＳｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ．２００３：１１３（５）：６３１．６４２．【２Ｓ］ＲｉｅｋｓｔｉｎａＵ，ＣａｋｓｔｉｎａＩ，Ｐａｒｆｅｊｅｖｓｖ，ｅｔａ１．ＥｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌＩｍａｒｋｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｈｕｍａｎｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ．ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ。ｈｅａｒｔａｎｄｄｅｒｍｉｓ．ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｖ．２００９；５（４）：３７８—３８６．【２９】ＳａｎｎａＤ，ＳａｎｎａＡ，ＭａｒａＬ，ｅｔａ１．０ｃｔ４ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｉｎ—ｖｉｔｒｏ－ｐｒｏｄｕｃｅｄｓｈｅｅｐｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓａｎｄｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅｃｅｌｌｓ．Ｃｅ¨ＢｉｏＩＩｎｔ．２００９；３４（１１：５３—６０．【３０］ＺｈｏｎｇＸ，Ｊｉｎ丫Ｃｒｉｔｉｃａｌｒｏｌｅｓｏｆｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒｐ３００ｉｎｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｔｅｍｃｅｌＩｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄＮａｎｏｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ＪＢｉｏＩＣｈｅｍ．２００９；２６４（１４）：９１６＆９１７５．来自本文课题的更多信息一基金撼劝＝课题为国家自然科学基金课题（３０７７１０２５），课题名称：胚胎千细胞定向诱导分化为胰岛样细胞过程中表现遗传学稳定性的变化及其机理研究．利ｒ盖卸凳课题由国家自然科学基金委资助，无其他利益冲突．梁题膨刮新赢实验为国家自然科学基金课题中的一部分，如果ＳＦｌ一Ｇ细胞不能稳定扩增，课题将不能继续下去，因此，建立一个稳定的扩增体系，是课题完成的基础．课题因涉及干细胞分化过程中表现遗传学变化及其机制的研究而获资助．壤ｇ铲劈脚“岔黼崔”：课题译估的指标主要涉及印记基因的变化及ＤＮＡ甲基化的检测．旋炉兹梁题功街搿与布层：因目前均存在分化效率低的问题，因此不容易获得高纯度的分化好的胰岛样细胞．撂群４Ｉ骞席僧签矽劈面豪实验建立了有效的小鼠胚胎成纤维细胞分离培养体系，并制备供胚胎干细胞进行增殖培养饲养层细胞体系，能够在实验室对ＳＦｌ．Ｇ细胞保持正常未分化状态培养，为更好的将干细胞应用于临床提供新的思路．ＰＤ．Ｂｏｘ１２００，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｃｎ．ｚｇｔｃｌｄ．ｃｏｍ小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
刘峰， 雷闽湘， 陈慧玲， Liu Feng， Lei Min-xiang， Chen Hui-ling中南大学湘雅医院内分泌科,湖南沙市,410008
中国组织工程研究与临床康复
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH2010,14(23)
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引用本文格式：刘峰.雷闽湘.陈慧玲.Liu Feng.Lei Min-xiang.Chen Hui-ling 小鼠饲养层细胞制备与小鼠胚胎干细胞SF1-G的培养[期刊论文]-中国组织工程研究与临床康复 2010(23)
