Apr.2015,35(2) 实验动物与比较医学Laboratory Animal and Comparative Medicine 87 doi:10.39690.issn.1674—5817.2015.02.001 ・论 著・ 大鼠颈总动脉球囊拉伤所致血管狭窄模型的建立 杨波 ,吴冰 ,唐俊明z,杨建业2,曹腾t,王家宁2 (1.武汉大学人民医院心内科,武汉430060; 2.湖北医药学院附属人民医院I临床医学研究所,十堰442000) [摘要】 目的建立一种简便实用的大鼠颈总动脉球裳拉伤的方法,为研究物理损伤基础上的血管 形态、细胞、生物化学成份等的变化提供稳定可靠的动物模型。方法30只体质量450~500 g雄 性SD大鼠,异氟烷麻醉后,分离颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉,并在颈外动脉上做切口,然后 用2F球囊导管沿切口插入颈总动脉,插入约4 cm后,注入O.02 mL生理盐水使球裳膨胀,轻轻 旋转着拉出导管,反复3次,致使颈总动脉内膜完全剥脱,在其损伤后1 d、3 d、7 d、14 d、28 d分 别取材,并进行病理组织学观察。结果损伤后随着时间的推移新生内膜明显增生,14d增生达到 高峰。结论 改进的大鼠颈总动脉球囊拉伤模型方法简便,手术成功率高,并且血栓形成率低。 【关键词]颈总动脉;血管再狭窄;球囊拉伤;2F球囊导管;新生内膜增生 [中图分类号]Q95—33 [文献标识 ̄i5-]A 【文章编号】1674—5817(2015)02—0087—05 冠心病是严重危害人类健康的常见病,是发 达国家及中国人群主要的死亡原因之一。经皮冠脉 介,K(percutaneous coronary intervention,PCI)是目 外研究报道的基础上[8-11】,试图通过改进手术操作 流程、血压控制、抗凝管理以及术后护理等多个 环节而建立一种操作简便、模型成功率高、血栓 发生率低、动物成活率高的大鼠颈总动脉球囊拉伤 模型方法。 前临床上治疗冠心病的有效措施之一。但PCI术后 再狭窄是影响其远期疗效的主要因素【卜31。由 于难以直接从再狭窄患者获取样本进行大样本的临 床研究而了血管损伤再狭窄的临床研究。因 1材料与方法 1.1实验动物及主要材料 SPF级雄性SD大鼠30只,体质量450~500 g, 购于湖北医药学院动物实验中心【SCXK(鄂)201 1— 0008],饲养于屏障设施[SYXK(鄂)2011-0031】。2F 球囊导管(2 F Fogarty arterial embolectomy balloon catheter)购于美国Baxter Edwards Healthcare公司; 小动物麻醉机购于美国欧美达(Ohmeda)公司;切片 机购于德国莱卡(Leica)公司;普通光学显微镜购于日 此,建立一个能很好反映血管损伤再狭窄临床病理 生理特点的动物模型显得非常必要,并据此开展的 研究将对PCI后血管再狭窄的防治具有重要理论及 实践意义。 大鼠颈动脉球囊损伤模型是目前国际上公认的 研究血管损伤后新生内膜形成的经典模型【 】。但 由于种种原因,其手术操作、模型成功率、大鼠 存活率等需要进一步的优化改善。本研究期望在国 [收稿日期】2014.12.05 【基金项目】国家自然科学基金资助项目(No.81270221) 【作者简介】杨波(1963一),博士生导师,教授。 E—mail:yybbl 12@whu.edu.cn; 本Nikon公司;显微手术器械购于美国Fine science 公司。异氟烷购于山东鲁南制药公司。 1.2 实验方法 吴 冰(1981一)硕士研究生。 E-mail:81532468@qq.tom 1.2.1大鼠颈总动脉球囊损伤模型的建立 大鼠颈 总动脉球囊损伤模型的建立方法参考文献[12]并适 [通讯作者】王家宁(1967一)博士生导师,教授。 E-mail:rywjn@vip.163.com 当改进。简要介绍如下:大鼠行异氟烷麻醉后, 固定,去除颈部的被毛,于胸骨上端至颌下之间 实验动物与比较医学Laboratory Animal and Comparative Medicine Apr2015.35(2) .增生不典型,易造成结果评价不稳定以及评价误判 所导致的结论不严谨等。而股动脉线损伤模型是用 直径为0.38 mm金属线插入股动脉,使其内膜剥 脱,进而形成内膜过度增生的血管狭窄。这也是国 际公认的建立血管再狭窄模型的好方法,但是这种 方法也有局限性,由于金属线直径小,有时易造成血 管内膜剥脱不均匀不彻底等情况。且主要适用于小 鼠,如某些基因修饰小鼠血管狭窄模型的建立。 而且由于该模型必须在显微镜下才能更好完成操作, 因此设备要求较高,从而其广泛推广应用。 3.1模型特点及方法改进 本研究选用的大鼠颈总动脉球囊拉伤模型是国 际公认的研究血管损伤后狭窄最理想的动物模型。 主要优点是:操作相对简单,球囊拉伤使血管内 膜剥脱均匀彻底,术后动物状态好,恢复快,血 栓生成率及死亡率低。本模型的建立是在总结国 内、外文献报道的基础上,通过实践、改进而完 成。主要改进如下:1)血压的监控:麻醉过深往往 会使血压降低过快、血流速度减慢,引起血管损 伤、血流不通畅而易致血管内血栓的形成。本研 究表明通过严格控制术中异氟烷吸入量,避免麻醉 过深,在适度的麻醉剂量下尽快完成模型整个制作 手术可有效降低动物死亡率以及血栓发生率。2)本 研究中建立结扎咽升动脉、枕动脉和甲状腺上动脉 的两端,并在两结之问剪断,可有效避免经验不 足的手术者因过度牵拉使这些小动脉断裂而大量出 血,造成整个手术时间延长以及血栓发生率增加 和动物死亡等不良反应。3)为了减少动物的痛 苦,给予动物应有的福利,在缝合皮肤的同时给 它们肌肉注射氯诺昔康止痛,并在双眼涂红霉素 眼膏防治眼睛干涩。 3.2模型制备成功的注意事项 术前:关于大鼠的体质量及性别选择问题, 建议选择450~500 g的雄性大鼠,因为成年大鼠血 管腔相对较粗,便于球囊插入,拉伤效果好。不 宜选择雌性大鼠,因为雌激素对多种细胞可能有潜 在的作用而影响实验效果。但是探索利用该模型观 察雌激素及其相关因素对血管损伤再狭窄的作用, 这将也是一个不错的模型选择。 术中:1)应在手术前准备好球囊导管,在距离 球囊端约4 cm的位置用记号笔做好标记,用1 mL 注射器吸入无菌生理盐水,充满三通管及球囊导 管,确保无气泡产生。2)鉴于麻醉过深会使血压 过低,进而导致损伤血管易形成血栓,故应避免 麻醉过深。一般在麻醉诱导阶段,异氟烷与氧气 的v/v值应为3:2。在皮肤和筋膜切开及分离血 管和神经等刺激较大的过程中,异氟烷与氧气的 V/v值应为2:2。其它过程中,异氟烷与氧气的 V/v值应为1:2,应尽量缩短手术时间并使动物 在术后最短的时间里苏醒,控制维持血压在合适的 范围内以降低血栓形成的几率。由于动物个体差 异,术中应适当调整麻醉参数(通过观察颈总动脉 搏动情况:搏动起伏较大有力为好)。3)在分离动 脉时,应避免损伤枕动脉,甲状腺上动脉和咽升 动脉,最好能用6号缝合线在这些小动脉两端问结 扎,并用显微眼科剪刀从两结之间剪断,以避免 后期牵拉大动脉时这些小动脉破裂致使大量出血。 4)动脉切口时应尽量靠近远心端,以避免第一次 切口失败,做第二次切口有足够的空间。5)动脉 切口不宜过大,以防动脉易断裂,致使导管无法 进入。6)在球囊导管插入之前不建议浸蘸肝素溶 液,虽然肝素有防止血栓形成的作用,但也可能 抑制平滑肌细胞增生,从而抑制新生内膜的增生, 影响实验效果。7)向外拉导管时,应避免太过靠 近动脉切口,以防球囊从动脉切口脱出,造成大 量出血。 术后:根据手术过程中失血情况,酌情经腹腔 注射生理盐水补液3~5 mL。每日肌肉注射青霉素 12万单位×3 d预防感染。 取材:1)事先准备好PBS和肝素钠混合溶液作 为灌流液,通畅灌流去除血液。2)在分离颈总动 脉及修剪颈总动脉的过程中避免过度牵拉和夹闭血 管,以利于保持血管固有形态。 参考文献: 【1] Ananthanarayanan B,Fosbrink M,Rahdar M,et a1.Live—cell molecular analysis of Akt activation reveals roles for activa— tion loop phosphorylation[J].J Biol Chem,2007,282(50): 36634.36641. 【2]Lemos PA,Van Mieghem CA,Arampatzis CA,et a1.Post— sirolimus・-eluting stent restenosis treated with repeat percu-・ taneous intervention:late nagiographic nad clinical outcomes 【J1.Circulation,2004,109(21):2500—2502. 【3】Costa MA,Simon DI.Molecularbasis ofrestenosis and drug— eluting stents[J].Circulation,2005,1 1 1(17):2257—2273. 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Establishment of Vascular Restenosis Model Induced by Carotid Artery Balloon Injury in Rats YANG Bo ,WU Bing ,TANG Jun-ming ,YANG Jian-ye ,CAO Teng ,WANG Jia—ning f1.DepartmentofCardiology,RenminHospital ofWuhan University,Wuhan430060,China; 2.Institute of Clinical Medicine Renmin Hospiatl,Hubei Universiyt foMedicine,Shiyan 442000,China) 【Abstract】 Objective To establish a simple and useful method of rat carotid artery balloon injury, providing stable and reliable animal model for studying the changes of vessels based on physical damage. Methods Rat common carotid artery,external carotid artery and internal carotid artery were isolated after anesthesia with isoflurane,the artery incision was performed in the extemal carotid artery,and hten hte 2F balloon catheter was inserted into common carotid artery in the incision,and pushed about 4 cm. Meanwhile,0.02 mL normal saline was slightly injected to make hte balloon inflate,and then hte catheter was gently rotated for all the way when removing.Repeat this operation by three times to completely denude hte common carotid artery intima.The changes of histomorphology in carotid artery were observed 1 day,3 days,7 days,14 days,and 28 days after injury.Results Obvious neointima hyperplasia appeared over time after damage,which reached the peak at 14 days.Conclusion The improved rat carotid artery balloon injury model is established with the characteristics of simple operation,high success rate,and 1ow rate of thrombosis. 【Key words】Common carotid artery;Vasculra restenosis;Balloon withdraw injury;2F Fogarty arterial embolectomy balloon catheter;Neointimal hyperplasia