第２３卷Ｖｏ１．２３ 第２期 Ｎｏ．２ 草 地 学 报 ＡＣＴＡ ＡＧＲＥＳＴＩＡ ＳＩＮＩＣＡ ２０１５年 Ｍａｒ． ３月 ２０１５ ｄｏｉ：１０．１１７３３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７—０４３５．２０１５．０２．０２６ 不同乳酸菌添加剂对青贮黑麦草和青贮 玉米微生物群集的影响 李雁冰 ，玉 柱 ，孙娟娟。 （１．黑龙江八一农垦大学动物科技学院动物营养实验室，黑龙江大庆１６３３１９； ２．中国农业大学动物科技学院草业科学系，北京１００１９３；３．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特０１００３１） 摘要：在青贮黑麦草（Ｌｏｌｉｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）和青贮玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）中添加鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌，研究其对微生物 群集的影响，青贮饲料贮藏时间为１４，５６，１２０ ｄ。结果表明：添加布氏乳杆菌的青贮黑麦草组细菌与真菌群集都很 稳定，大肠菌中的Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｅｒｓｉｃｉｎａ，Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ和Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ在青贮黑麦草对照组中被发现， 鼠李糖乳杆菌组没有发现。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ是对照组与鼠李糖乳杆菌组青贮黑麦草 中的主要真菌；Ｐ．ａｎｏｍａｌａ在布氏乳杆菌组未检测到。Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｕｓ和Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒ— ｍｅｄｉａ在青贮玉米原料与发酵过程中均检测到，Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ和Ｃａｎｄｉｄａ ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ只在发酵过程检测到。 有氧发生时，青贮玉米真菌菌群发生明显变化，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｔｉｎｉａｅ，Ｐｉｃｈｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ和Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ可在的青贮玉米中检测到。这表明添加乳酸菌制剂可 以改变青贮黑麦草的菌群，但是对青贮玉米菌群影响较小，发生时真菌菌群与细菌菌群均发生变化。 关键词：细菌；真菌；ＤＧＧＥ；青贮 中图分类号：￥５４３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００７—０４３５（２０Ｉ５）０２—０３８７—０７ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｒｏｐ Ｃｏｒｎ ａｎｄ Ｗｉｌｔｅｄ Ｉｔａｌｉａｎ Ｒｙｅｇｒａｓｓ Ｓｉｌａｇｅ Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｌａｃｔｉｃ Ａｃｉｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ ＬＩ Ｙａｎ—ｂｉｎｇ 。ＹＵ Ｚｈｕ弘。ＳＵＮ Ｊ ｕａｎ—ｊ ｕａｎ。 （１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｂａｙｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｑｉｎｇ，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ １６３３１９，Ｃｈｉｎａ ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３，Ｃｈｉｎａ； ３．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ ０１００１０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ（ＬＡＢ）ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ａｅｒｏｂｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｂｉａ１ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ ｓｉｌａｇｅ，ｗｉｌｔｅｄ Ｉｔａｌｉａｎ ｒｙｅｇｒａｓｓ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ ｃｒｏｐ ｃｏｒｎ ｗｅｒｅ ｓｔｏｒｅｄ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｉｌｏｓ ｗｉｔｈ ａｎｄ ｗｉｔｈｏｕｔ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ａｎｄ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ．Ｔｈｅ ｓｉｌｏｓ ｗｅｒｅ ｏｐｅｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｌ４，５６ ａｎｄ １２０ ｄａｙｓ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ａｅｒｏｂｉｃ ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ７ ｄａｙｓ．Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｕｃｈ ａｓ Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｅｒｓｉｃｉ一 抛，Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ ａｎｄ Ｒａｈｎｅｌｌａ ａｑｕａｔｉｌｉｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ｇｒａｓｓ ｓｉｌａｇｅ．ｗｈｅｒｅａｓ ｓｏｍｅ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ ｏｒ ｂｅｃａｍｅ ｆａｉｎｔ ｗｉｔｈ Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ ｇｒａｓｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｂｏｔｈ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ｕｎｔｒｅａｔｅｄ ａｎｄ Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ—ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｇｒａｓｓ ｓｉｌａｇｅｓ；ｈｏｗｅｖｅｒ，Ｐ．ａｎｏｍａｌａ ｗａｓ ｎｏｔ ｖｉｓｉｂｌｙ ｓｅｅｎ ｉｎ Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｇｒａｓｓ ｓｉｌａｇｅ ｅｉｔｈｅｒ ａｔ ｓｉｌｏ ｏｐｅｎｉｎｇ ｏｒ ａｆｔｅｒ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｏ ａｉｒ．Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇ— ｎｏｌｉａ，Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆＺａ￣．ｓ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅ－ｅｎｓｉｌｅｄ ｃｏｒｎ ｃｒｏｐ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｌａｇｅ， ｗｈｅｒｅａｓ Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａ ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ．Ｔｈｅ ｍａｒｋｅｄ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗａｓ ｓｅｅｎ ａｆｔｅｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｓｐｏｉｌａｇｅ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｘｉｇｕｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｔｉｎｉａｅ， Ｐｉｃｈｉａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｐｉｃｈｉａ ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｐｉｃｈｉａ ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ ａｐｐｅａｒｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｏｉｌｅｄ ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ．Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ＬＡＢ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｆｅｗ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ．ａｎｄ ｔｈｅ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｓｉｌａｇｅ ｗａｓ ｓｐｏｉｌｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａ；Ｆｕｎｇｉ；Ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｇｅＩ ｅＩｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；Ｓｉｌａｇｅ 收稿日期：２０１４－Ｏ卜０９；修回日期：２０１４—０３—２４ 基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（２０１３０３０６１）；黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（ＷＢ１３Ｂ１１１—２）；黑龙江省教育厅海 外学人重点科研项目（１２５２ＨＱ００９）；国家牧草业技术体系（ＣＡＲＳ－３５）资助 作者简介：李雁冰（１９８０一），女，吉林吉林人，博士，研究方向为饲料资源开发，Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｙａｎｂｉｎｇ９２９＠１６３．ｃｏｒｎ；＊通信作者Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒ— ｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙｕｚｈｕ３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ ３８８ 草 地 学 报 第２３卷 青贮饲料作为家畜的常规饲料，其研究一直备受 人们的关注，对青贮饲料的营养价值和发酵品质的研 究现在仍旧是热门。乳酸菌添加剂（ＬＡＢ）被广泛用于 改善青贮品质。在不使用乳酸菌添加剂的情况下，原 料上附生的微生物在发酵过程中主导着发酵的品质， 往往会导致青贮饲料干物质损失以及蛋白质水解【 。 理想的乳酸菌添加剂应该具有以下特点：快速生长并 同附生微生物竞争成功，迅速降低ｐＨ值，乳酸比乙酸 的值较高，低乙醇和氨态氮产生，提高１ ～３ 干物质 回收率 ］。为了增加发酵饲料中乳酸菌的含量，同型 发酵乳酸菌接种剂被广泛使用，如植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏ— ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、粪链球菌（Ｅ ｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ） 和片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）等。异型乳酸菌却一直被 认为是不利于发酵的乳酸菌。然而，同型乳酸菌的使 用会降低青贮饲料的有氧稳定性，因为饲料中产生的 大量乳酸可以被酵母菌以及其他需氧微生物利用＿１］。 为了提高青贮饲料有氧稳定性能力，一种异型发酵乳 酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ４０７８８被用作青贮饲料添加 剂，它可以产生高剂量的乙酸抑制酵母和霉菌，从而使 青贮饲料在暴露于空气中时不易。。。］。Ｏｕｄｅ Ｅｌｆ— ｅｆｉｎｋ等＿４ 发现布氏乳杆菌（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）可以厌氧分解 乳酸，ｌ ｍｏｌ乳酸被降解为０．４８ ｍｏｌ乙酸、０．４８ ｏｔｏｌ １，２一 丙二醇、０．０４ ｔｏｏｌ乙醇和０．５２ ｍｏｌ Ｃ０２。 使用微生物添加剂并不总是能够取得成功，当 附生乳酸菌数量过高时，或者发酵环境更适合附生 乳酸菌时，这些附生乳酸菌会在发酵过程中占主导 地位 ］。在Ｐａｒｖｉｎ等＿６］的研究中发现黑麦草（Ｌｏｌｉ— ｕｍ ｐｅｒｅｎｎｅ）、几内亚草（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍａｘｉｍｕｍ）中添 加乳酸菌可以与附生乳酸菌有效竞争，在菌落分析 中几乎检测不到添加的乳酸菌以外的微生物，然而 在玉米（Ｚｅａ，ｎａｙｓ）青贮中使用的乳酸菌添加剂却 与附生微生物并存。一直以来，乳酸菌添加剂的添 加效果通常由发酵产物进行评定，然而，近期的研究 结果表明，在评价乳酸菌添加剂效果时不仅要考虑 发酵产物还要考虑对附生菌群的影响口］。本研究是 在青贮黑麦草和青贮玉米中添加鼠李糖乳杆菌（Ｌ． ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）和布氏乳杆菌，研究这２种乳酸菌对贮 藏期间与开封后青贮饲料微生物菌群的影响。 １材料与方法 Ｉ．Ｉ青贮的调制与贮存 选用开花期黑麦草以及选用乳熟期全株玉米分别 进行青贮，黑麦草青贮前预干４ ｈ至干物质３０％左右， 全株玉米直接青贮，原料均经铡草机切碎至１～２ ｃｍ。 冻干粉末的鼠李糖乳杆菌与布氏乳杆菌用自来水进行 溶解稀释，以２ ｍＬ・ｋｇ 的剂量均匀的喷洒在原材料 上，以保证每克原料上达到１０。ＣＦＵ的乳酸菌，对照组 使用的是自来水２ ｍＬ。设置对照组：自来水；ＬＲ组： 添加鼠李糖乳杆菌组；ＬＢ组：添加布氏乳杆菌组。将 切好的原料３００ ｇ，放人０．０５ Ｉｉｌｉ＂１１厚的塑料袋（２７ ｍｍＸ ３９ ｍｍ）中利用真空封口机抽气封口，置于恒温环境 （２５℃）中发酵。保存在２５℃恒温室内，贮存１４，５６，１２０ ｄ。每个处理３个平行样本。鼠李糖乳杆菌源于一头 健康奶牛粪中培养。布氏乳杆菌分离于青贮玉米窖。 每次开封后进行有氧稳定试验。 １．２ ＤＧＧＥ分析 由于先前的试验已经证明平行样本呈现相同的 ＤＧＧＥ结果，所以本试验是选择３个平行样本中的 一个，所选样本供开封和有氧试验ＤＮＡ抽取 之用。青贮饲料细菌ＤＮＡ的抽取按照以下方法进 行。１０ ｇ样本加入９Ｏ ｍＬ的灭菌ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）， 震荡１０ ｍｉｎ，并用４层灭菌纱布过滤。离心分离后 （８０００ ｒ・ｍｉｎ ×１５ ｍｉｎ，４℃），去掉上清液，沉淀 物中加入Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ和Ｌｙｓｏｚｙｍｅ进行回收 ＤＮＡ，利用试剂盒（ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ；Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）进行ＤＮＡ的精制。提取 细菌ＤＮＡ应用ＰＣＲ在１６Ｓ ｒＲＮＡ的Ｖ３领域增 幅，引物为ＧＣ３５７ｆ（５ 一ＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＧＣＧ ＧＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧＣＡＣＧＧＧＧＧＧＣＣＴＡＣ ＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ一３ ）和５ １ ７ ｒ（５ ＬＡＴＴＡＣＣＧＣＧ— ＧＣＴＧＣＴＧＧ一３ ），采用３０次循环进行增幅 （ＴＰ６５０，ＴａＫａＲａ公司，日本），产物为１６０ ｂｐ。扩 增反应在Ｂｉｏ—Ｒａｄ仪器上进行，反应参数：预变性 ９５℃，１０ ｍｉｎ；变性９３℃，３Ｏ Ｓ；退火６５℃（前１０个循 环），３０ Ｓ；６０℃（中问１Ｏ个循环），３Ｏ ｓ；５５℃（最后１Ｏ个 循环），３０ ｓ；延伸７２℃，１ ｍｉｎ；共３Ｏ个循环；延伸７２℃， ５ ｍｉｎ。ＴＡＫＡＲＡ生物技术公司合成引物，扩增片段 为１６０ ｂｐ。提取的真菌ＤＮＡ应用ＰＣＲ在１８Ｓ ｒＲＮＡ 领域增幅，引物为Ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉ— ｉｆｃａｔｉｏｎ，向引物ＮＳ３（５＇－Ｃ￣ＡＡＧＴＣＴＧＧＴＧＣＣＡＧ ＣＡＣ￣２－３ ）和反向引物ＹＭ９５１ｒ（５＇－ＴＴＧＣＡ２ＡＡＡＴ— ＧＣＴＴＴＣＧＣ一３ ）使用。扩增反应在Ｂｉｏ－Ｒａｄ仪器上进 行，反应参数：预变性９５℃，１０ ｍｉｎ；变性，９３℃，１ ｍｉｎ； 退火，５５℃（前１０个循环），１ ｍｉｎ；５０℃（中间１Ｏ个循 环），１ ｍｉｎ；４５℃（最后１Ｏ个循环），１ ｍｉｎ；延伸７２℃，３ ｍｉａｒ共３Ｏ个循环；延伸７２℃，５ ｍｉｎ。ＴＡＫＡＲＡ生物 ３９２ 草 地 学 报 第２３卷 在对照组Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ和Ｐ．ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ以及一些大 肠菌出现在有氧稳定试验以后的青贮饲料中。在鼠 李糖乳杆菌组Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ出现在有氧稳定试验以 明大肠菌与的关系，因此将来我们可以在青贮 饲料中添加Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ，Ｂ． ｇｉｂｓｏｎｉｉ和Ｅ．ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ，以了解与这些大肠 菌的关系。 后，且条带较亮。Ｉｎｇｌｉｓ等口 也发现Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ出 现在使用乳酸菌添加剂的青贮饲料开封后，开封后 青贮饲料ｐＨ的升高与芽胞杆菌关系更大。Ｌ． Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ在青贮饲料的渗透液中分离过，可 能会导致犊牛拉稀。在青贮玉米发酵过程中，ｃ． ｍａｇｎｏｌｉａ，Ｃ．ｆｌａｖｕｓ，Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ ｂｒｅｖｉｓ在有的研究中也被认为是一种菌［１ ，然 而更多的情况是Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ可以起到一定的提高有 和Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ组成真菌菌群。虽然Ｃａｎｄｉｄａ 氧稳定性的作用＿１引。一般认为鼠李糖乳杆菌组的 真菌菌群应该与对照组不同，应该含有利用乳酸的 酵母菌，因为乳酸被认为是导致有氧的原因之 一。同样布氏乳杆菌组真菌菌群也应该发生转变， 应为布氏乳杆菌在发酵后期起作用口 。事实上，鼠 李糖乳杆菌组的真菌菌群并没有发生改变，布氏乳 杆菌组只是Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ和Ｐ．ａｎｏｍａｌａ在贮藏过 程中发现，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｐ．ａｎｏｍａｌａ和Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ在ＤＧＧＥ中不容易区别，添加布氏乳 杆菌抑制了Ｐ．ａｎｏｍａｌａ，一种乳酸分解酵母。 ３．２添加鼠李糖乳杆菌和布氏乳杆菌对青贮玉米 微生物群集和有氧稳定性的影响 本研究中鼠李糖乳杆菌的使用并没有改变青贮 玉米发酵产物的含量和组成。研究已经表明在青贮 玉米中接种乳酸菌的成功率小于青贮牧草口 。由 于青贮玉米原料中的附生乳酸菌含量往往与接种剂 数量一致（约１０ ｃｆｕ・ｇ ），接种的乳酸菌不容易 竞争过附生菌群＿１ 。但是，在本研究中，青贮饲料 中细菌和真菌菌群与原料附生菌群不一致。如果附 生菌群数量足够，他们应该能够在发酵过程中处于 优势地位，至少在发酵初期这样。事实上，Ｗ．ｐａ— ｒａｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ，Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ和Ｌ．１ａｃｔｉｓ在原料 中并没有检测到，在发酵过程中所有的样品中均检 测到。此外，虽然Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ，Ｐ．ｐａｒｖｕｌｕｓ，Ｗ． ｃｏｎｆｕｓａ和Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ在发酵前后均有发现， 但在发酵过程中并不占优势。其他学者的研究中也 提到过原料与发酵过程中微生物菌群的差异【６］。虽 然ＤＧＧＥ分析是不定量的测试，但它可以检测细菌 菌群中占１ 以上的细菌Ｌ１ 。在的的玉米青贮 饲料中，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ，Ｂ．ｇｉｂ— ｓｏｎｉｉ和Ｅ．ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ被检测到。醋酸菌一直被认 为是的起始菌，而芽孢杆菌被认为是后期ｐＨ 上升的主要菌。大肠菌在有氧中的作用并不清 楚，可能它也参与有氧或者在酵母等定植后为 大肠菌定植创造了机会。但是本试验并不能充分说 ｓｐｐ．和Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．在一些发酵食物中也能 发现，Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａ，Ｃ．ｆｌａｖｕｓ，Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ和 Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ在青贮中还没有报到。本研究中Ｃ． ｇｌａｂｒａｔａ在开封后检测不到，在的鼠李糖乳杆 菌组检测到另外两种真菌。Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａ在有氧和 厌氧条件下都可以生长，但是Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａ在开封 后消失。在对照组和鼠李糖乳杆菌组Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕ— ｓａ开封后也未检测到。这证明Ｃ．ｍａｇｎｏｌｉａ，Ｃ． ｆｌａｖｕｓ，Ｃ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ和Ｃ．ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ可能与腐 败无关。Ｐ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ，Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ和Ｐ． ｒ— ｍｅｎｔａｎｓ在的青贮饲料中发现，这些真菌在青 贮玉米暴露于空气中时发现Ⅲ１ 。而Ｐ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅ— ｖｉｉ在发酵期间也发现，说明Ｐ．ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ与有 氧无关。有报道称Ｃ．ｍｉｌｌｅｒｉ和Ｐ．ａｎｏｍａｌａ 青贮玉米有氧有关＿＿１ ，但是在本研究ＤＧＧＥ 结果中没有发现。 ４ 结论 添加鼠李糖乳杆菌可以改变青贮黑麦草的细菌 菌群，添加布氏乳杆菌对青贮黑麦草细菌菌群影响 不大。发生时青贮黑麦草的细菌与真菌菌群发 生变化。添加鼠李糖乳杆菌与布氏乳杆菌对青贮玉 米的细菌菌群与真菌菌群影响较小，发生后青 贮玉米细菌菌群发生变化，真菌菌群的变化只存在 于开封前与后。 参考文献 ［１］ＭｃＤｏｎａｌｄ Ｐ，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ Ａ Ｒ，Ｈｅｒｏｎ Ｓ Ｊ Ｅ．Ｔｈｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｓｉｌａｇｅ［Ｍ］．Ｗｅｌｔｏｎ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＵＫ：Ｃｈａｌｃｏｍｂｅ Ｐｕｂｌｉｃａ— ｔｉｏｎｓ．１９９１ ［２］Ｗｅｉｎｂｅｒｇ Ｚ Ｇ，Ｍｕｃｋ Ｒ Ｅ．Ｎｅｗ ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ ｆｏｒ ｓｉｌａｇｅ［Ｊ］．ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９６，１９（１）：５３—６８ ［３］Ｄｒｉｅｈｕｉｓ Ｆ，Ｏｕｄｅ Ｓ，Ｓｐｏｅｌｓｔｒａ Ｓ Ｆ．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｇ— ｒａｄａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｓｉｌａｇｅ ｏｆ ｗｈｏｌｅ ｃｒｏｐ ｍａｉｚｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｙｅａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ａｅｒ— 第２期 李雁冰等：不同乳酸菌添加剂对青贮黑麦草和青贮玉米微生物群集的影响 ３９３ ｏｂｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ＥＪ３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９，８７ （４）：５８３—５９４ ［４３ Ｏｕｄｅ Ｓ，Ｋｒｏｏｎｅｍａｎ Ｊ，Ｇｏｔｔｓｃｈａｌ Ｊ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎ— ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｔｏ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ １．２－Ｐｒｏ ｐａｎｅｄｉｏｌ ｂｙ Ｌａｃｔｏ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉ— ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，６７（１）：１２５—１３２ Ｉｓ］Ｌｉｎ ｃ，Ｂｏｌｓｅｎ Ｋ，Ｂｒｅｎｔ Ｂ Ｅ，ｅｔａ１．Ｅｐｉｐｈｙｔｉｅ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅ— ｒｉａ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅ—。ｅｎｓｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｅｎｓｉｌｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄｓ ｏｆ ａｌ—－ ｆａｌｆａ ａｎｄ ｍａｉｚｅ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９９２，７３ （５）：３７５－３８７ ［６３ Ｐａｒｖｉｎ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｃ，Ｌｉ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ１ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｉｔａｌｉａｎ ｒｙｅｇｒａｓｓ，ｗｈｏｌｅ ｃｒｏｐ ｍａｉｚｅ，ｇｕｉｎｅａ ｇｒａｓｓ ａｎｄ Ｒｈｏｄｅｓ ｇｒａｓｓ ｓｉ— ｌａｇｅｓ［Ｊ］．Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，１６０ （３）：１６Ｏ一１６６ ［７３ Ｏｓｔｌｉｎｇ Ｃ，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ Ｓ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ ｔｈｅ ｆｅｒ— ｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｒａｓｓ ｓｉｌａｇｅｓ［Ｊ］．Ｇｒａｓｓ ａｎｄ Ｆｏｒａｇｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，５０（１）：４１－４７ ［８］Ｐａｓｃｕａｌ Ｌ Ｍ，Ｄａｎｉｅｌｅ Ｍ Ｂ，Ｒｕｉｚ Ｆ，ｅｔａ１．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍ— ｎＯＳＵ５ Ｌ６０，ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｖａｇｉ— ｎａ［Ｊ３．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｇｅｎｅｒａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８， ５４（３）：１４１－１４８ ［９］Ｎａｋａｍｕｒａ Ｌ Ｋ．Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｎｏｒａ．ｒｅｖ．， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｎｏｒａ．ｒｅｖ．，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｂｕｌｉ ｓｐ． ｎｏｖ．，ｎｏｒａ，ｒｅｖ．，ａｎｄ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｌｉｄｕｓ ｓｐ．ｎｏｖ．，ｎｏｒａ．ｒｅｖ ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１９８４，３４ （２）：２２４－２２６ ［１Ｏ］Ｍｉｄｄｅｌｈｏｖｅｎ Ｗ Ｊ，Ｂａａｌｅｎ Ａ Ｈ Ｍ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｆｌｏｒａ ｏｆ ｗｈｏｌｅ—。ｃｒｏｐ ｍａｉｚｅ ｄｕｒｉｎｇ ｅｎｓｉｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ ｓｕｂｓｅ—－ ｑｕｅｎｔ ａｅｒｏｂｉｏｓｉｓ［Ｊ３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉ— ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８８，４２（３）：１９９—２０７ ［１１］Ａｕｅｒｂａｃｈ Ｈ，Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ Ｅ，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ Ｆ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｅ ｉ— ｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ ａｎｄ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉｎ Ｃ ｉｎ ｓｉｌａｇｅｓ［Ｊ３．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９９８，７６（４）：５６５—５７２ ［１２３ Ｈａｃｋｉｎｇ Ａ，Ｒｏｓｓｅｒ Ｗ Ｒ．Ｐａｔｕｌｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｌａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ— ｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，１９８１，３２（６）：６２０— ６２３ ［１３３ Ｉｎｇｌｉｓ Ｇ Ｄ，Ｙａｎｋｅ Ｌ Ｊ，Ｋａｗｃｈｕｋ Ｌ Ｍ，ｅｔａ１．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ ｓｐｏｉｌａｇｅ ｏｆ ｂａｒｌｅｒｙ ｓｉｌａｇｅ［Ｊ］．Ｃａｎａｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９９， ４５（１）：７７—８７ ［１４］Ｗａｉｔｅ Ｊ Ｇ，Ｊｏｎｅｓ Ｊ Ｍ，Ｙｏｕｓｅｆ Ａ Ｅ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｏｉｌａｇｅ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｕｓｉｎｇ ｆｏｏｄ—ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｒａｎｃｈ ｄｒｅｓｓｉｎｇ ａｓ ８ ｍｏｄｅｌ ｆｏｏｄ［Ｊ］． Ｆｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００９，２６（３）：２３５—２３９ ［１５］Ｄａｎｎｅｒ Ｈ，Ｈｏｌｚｅｒ Ｍ，Ｍａｙｒｈｕｂｅｒ Ｅ，ｅｔａ１．Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎｃｒｅａ— ｓｅｓ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｉｌａｇｅ ｕｎｄｅｒ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，６９（１）：５６２—５６７ ［１６］Ｎｉｓｈｉｎｏ Ｎ，Ｙｏｓｈｉｄａ Ｍ，Ｓｈｉｏｔａ Ｈ，ｅｌａ１．Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ １，２一 ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｗｈｏｌｅ ｃｒｏｐ ｍａｉｚｅ ｓｉｌａｇｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒ— ｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，９４（５）：８００—８０７ ［１ ７３ Ｍｕｃｋ Ｒ Ｅ．Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｌａｇｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｓｉｌａｇｅ ｑｕａｌｉｔｙ ［Ｃ］／／Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｄａｉｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒａｇｅ Ｉｎｄｕｓ— ｔｒｉｅｓ．ＵＳ ｄａｉｒｙ ｆｏｒａｇｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ， １９９６ １ ４３—５１ ［１８］Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｎ Ｂ，Ｓｌｏｔｈ Ｋ Ｈ，Ｈｏｊｂｅｒｇ ０，ｅｔ ａ１．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｉ— ｃｒｏｂｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｎｔｓ ｏｎ ｃｏｒｎ ｓｉｌａｇｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｍｉｃｒｏｂｉａ１ ｃｏｎ— ｔｅｎｔｓ，ａｅｒｏｂｉｃ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｍｉｌｋ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｆｉｅｌｄ ｅｏｎｄｉ— ｔｉｏｎｓ［刀．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，９３（８）：３７６４—３７７４ ［１９］Ｏｒｏｓ—Ｓｉｃｈｌｅｒ Ｍ，Ｃｏｓｔａ Ｒ，Ｈｅｕｅｒ Ｈ，ｅｔ ａ１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｎｇｅｒ— ｐｒｉｎｔｉｎｇ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｓｏｌ１ ｍｉｃｒｏｂｉａ１ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ［Ｍ］／／ｖａｎ Ｅｌｓａｓ Ｊ Ｄ，Ｊａｎｓｓｏｎ Ｊ Ｋ，Ｔｒｅｖｏｒｓ Ｊ Ｔ，ｅｄｓ．Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｏｉｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄｎ．ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ， ＵＳＡ，２００７ （责任编辑 吴雅娜）
